金屬依賴型厭氧甲烷氧化研究進展

李俠，蘭建英 ，蔣海明 *

1. 內蒙古科技大學礦業(yè)研究院，內蒙古 包頭 0140101；2. 內蒙古科技大學生命科學與技術學院，內蒙古 包頭 014010；3. 內蒙古自治區(qū)生物質能源化利用重點實驗室，內蒙古 包頭 014010

甲烷（CH4）是一種溫室氣體，其溫室效應是二氧化碳的26倍（Caldwell et al.，2008）。減少甲烷排放，可以保護大氣環(huán)境。據(jù)Reeburgh（1976）分析，大氣中的甲烷約80%來自厭氧條件下微生物降解有機物產生?？刂拼髿庵屑淄闈舛葘刂迫蜃兣兄匾饬x。在厭氧環(huán)境中，當甲烷作為唯一的電子供體、且存在 SO42-、NO3-、Mn(Ⅳ)及 Fe(Ⅲ)等電子受體時，厭氧甲烷營養(yǎng)古菌（Anaerobic Methanotrophic Archaea，ANME）可以將甲烷氧化為二氧化碳（張夢竹等，2012）。微生物介導的甲烷厭氧氧化（Anaerobic Oxidation of Methane，AOM）是減少自然環(huán)境中甲烷排放的重要途徑之一（吳憶寧，2019；張夢竹等，2012）。盡管近些年在厭氧甲烷營養(yǎng)古菌、厭氧甲烷氧化機制乃至厭氧甲烷營養(yǎng)古菌胞外電子傳遞等方面的研究取得了很大進展，但厭氧甲烷氧化研究仍有許多懸而未決的問題。對不同生態(tài)環(huán)境中AOM過程和機理進行深入了解和研究，有助于進一步理解生物礦化、全球碳循環(huán)及 AOM，并對控制甲烷排放具有十分重要的指導意義（吳憶寧，2019）。

金屬氧化物或金屬離子可以作為厭氧甲烷氧化的電子受體，且金屬依賴的厭氧甲烷氧化是減少全球甲烷排放的一個重要途徑。金屬依賴的厭氧甲烷氧化研究是生物地球化學、地質微生物學等許多基礎學科的研究熱點。本文從金屬依賴型厭氧甲烷氧化菌、金屬依賴型厭氧甲烷氧化機制及金屬依賴型厭氧甲烷氧化時胞外電子傳遞機制對金屬依賴型厭氧甲烷氧化研究現(xiàn)狀進行了概述，分析了金屬依賴型厭氧甲烷氧化研究存在的問題，并討論了其今后的研究方向，為金屬依賴型厭氧甲烷氧化研究提供參考。

1 金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌研究

AOM 是減少甲烷排放的重要途徑之一，包括硫酸鹽依賴型厭氧甲烷氧化（Sulfate-dependent anaerobic oxidation of methane，S-DAOM）、硝酸鹽/亞硝酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化（Nitrate/nitritedependent anaerobic oxidation of methane，NDAOM）及金屬離子依賴型厭氧甲烷氧化（Metal ion-dependent anaerobic oxidation of methane，MDAOM）（Cui et al.，2015）（圖1）。

圖1 3種不同甲烷厭氧氧化模型（Cui et al.，2015）Fig. 1 Three different models of anaerobic oxidation of methane(AOM) depending on the different electron acceptors(Cui et al., 2015)

鐵(Ⅲ)/錳(Ⅳ)氧化物在地球表面分布廣泛，且含量高。因此，金屬依賴型厭氧甲烷氧化對全球碳元素、硫元素、磷元素以及金屬元素的循環(huán)有著重要影響。2009年，Beal et al.（2009）首次在海洋沉積物中發(fā)現(xiàn) ANME可以在氧化甲烷時耦合金屬離子還原，這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)開辟了金屬依賴型厭氧甲烷氧化研究。隨后研究者通過化學元素分析法和同位素示蹤法證實在海洋冷泉區(qū)（Beal et al.，2009；Peng et al.，2017；Sivan et al.，2014a；Wu et al.，2020）、海洋沉積物（Sivan et al.，2007；Riedinger et al.，2014；Treude et al.，2014；Oni et al.，2015；Scheller et al.，2016；Liu et al.，2018；Winkel et al.，2018；Xie et al.，2019；Aromokeye et al.，2020；Roland et al.，2021；陳穎，2014）、咸水沿岸沉積物（Sivan et al.，2011；Egger et al.，2015；Egger et al.，2016；Rooze et al.，2016）、湖泊底泥（Crowe et al.，2011；Sivan et al.，2011；Norei et al.，2013；Torres et al.，2014；Ettwig et al.，2016；Bar-Or et al.，2017；Su et al.，2020）、咸水濕地沉積物（Segarra et al.，2013）、淡水濕地沉積物（Segarra et al.，2013；Zou et al.，2018；Leu et al.，2020；Shi et al.，2020；李玉芳，2016；張乃方等，2018）、河口區(qū)（王維奇，2014）及原油污染區(qū)（Amos et al.，2012）等都存在金屬依賴型厭氧甲烷氧化。在厭氧環(huán)境中，金屬依賴型厭氧甲烷氧化是一個普遍的過程。在淡水環(huán)境中，由于硫酸鹽含量低，鐵依賴型AOM成為減少甲烷的主要過程（Sivan et al.，2011）。雖然許多文獻報道了自然界中存在M-DAOM現(xiàn)象，但在實驗室利用富集培養(yǎng)物和純培養(yǎng)物以實現(xiàn) MDAOM的報道并不多。Chang et al.（2012）在研究臺灣東部泥火山的孔隙水中M-DAOM時，發(fā)現(xiàn)包括 ANME-1、ANME-2及 ANME-3在內的幾乎所有 ANME的亞類都可參與 M-DAOM。Scheller et al.（2016）的研究顯示深海沉積物中的 ANME-2a和 ANME-2c在人工氧化劑可溶性檸檬酸鐵和EDTA鐵存在下具有氧化甲烷的能力。Ettwig et al.（2016）從荷蘭的特文特運河沉積物中富集獲得的與厭氧甲烷氧化古菌相關的高純培養(yǎng)物（AOM-associated archaea，AAA）（認為是ANME-2 d）可在厭氧氧化甲烷的同時還原可溶解性Fe(Ⅲ)、水鐵礦、Fe(Ⅲ)與 Mn(Ⅳ)礦物。另一項研究表明，與“Methanoperedens nitroreducens”有關的厭氧甲烷營養(yǎng)古菌在富含鐵沉積物的培養(yǎng)過程中參與 AOM（Weber et al.，2017）。但是上述研究都基于混合培養(yǎng)物，并沒有得到純培養(yǎng)物。從ANME-1沉積物中分離得到的純培養(yǎng)物 Methanosarcina acetivorans C2A能夠依靠 Fe(Ⅲ)的還原進行厭氧甲烷營養(yǎng)生長，可以在厭氧氧化甲烷與偶聯(lián)還原Fe(Ⅲ)的同時產生乙酸，但是其不能在Fe(Ⅲ)介導下將甲烷完全氧化為 CO2（Soo et al.，2016；Yan et al.，2018）。Cai et al.（2018）以澳大利亞昆士蘭州金溪水庫采集的沉積物樣品作為接種物、氫氧化鐵為電子受體及甲烷為電子供體，在實驗室規(guī)模的生物反應器中富集獲得了厭氧甲烷營養(yǎng)古菌 Methanoperedens ferrireducens，13C標記、57Fe標記、宏基因組分析及宏轉錄分析表明該古菌能夠以 Fe(Ⅲ)作為末端電子受體獨立地介導AOM，但是沒有從分子水平進行驗證。Leu et al.（2020）在淡水沉積物接種的生物反應器中添加甲烷和錳(Ⅳ)氧化物（水鈉錳礦），富集得到的微生物菌群中以 Candidatus Methanoperedens manganicus與 Candidatus Methanoperedens manganireducens（屬于Methanoperedenaceae的兩個新成員）為主，通過基因組和轉錄組分析認為它們屬于Mn(Ⅳ)依賴型厭氧甲烷氧化菌，但是該研究也沒有從分子水平進行驗證。

除 Fe(Ⅲ)與 Mn(Ⅳ)外，Se(VI)、Cr(VI)、As(V)、V(Ⅴ)、Sb(Ⅴ)及 Te(IV)也能介導甲烷厭氧氧化。Lai et al.（2016）在膜生物反應器中以甲烷為唯一電子供體將硒酸鹽完全還原為 Se0，并認為甲烷氧化菌屬中的 Methylomonas可以在氧化甲烷的同時直接將 SeO42-還原 Se0。Luo et al.（2018）的研究也表明，在厭氧條件下甲烷氧化菌Candidatus Methanoperedens和Candidatus Methylomirabilis能將SeO42-還原為Se0而消除SeO42-的毒性。此外，甲烷氧化菌也能以甲烷為唯一的電子供體將V(Ⅴ)、Sb(Ⅴ)、Te(IV)、Cr(VI)和 As(V)分別還原為V(IV)（Lai et al.，2018a；Zhang et al.，2020）、Sb(III)（Lai et al.，2018b）、Te0（Shi et al.，2019）、Cr(III)（Al-Hasin et al.，2010；Lu et al.，2016；Dong et al.，2019； Lu et al.，2018；Luo et al.，2019）及 As(IV)（Shi et al.，2020），其相應的主要功能微生物如表1所示。Shi et al.（2020）發(fā)現(xiàn)砷污染濕地土壤中的ANME-1和ANME-2a-c能以砷酸鹽為電子受體厭氧氧化甲烷，并認為甲烷厭氧氧化和砷酸鹽還原是一個以前被忽視的潛在的全球性過程，該過程對砷的遷移和環(huán)境污染具有影響。Lu et al.（2016）在間歇式反應器中利用 CH4作為唯一電子供體研究甲烷氧化耦合Cr6+的還原，實驗中觀測到了甲烷厭氧氧化耦合Cr6+還原現(xiàn)象，并認為ANME-2d可能參與偶聯(lián)于Cr(Ⅵ)還原的AOM。

表1 文獻報道的金屬依賴型厭氧甲烷氧化微生物Table 1 Microbes reported as M-DAOM

雖然在將近 20年前就發(fā)現(xiàn)了金屬依賴型厭氧甲烷氧化，但涉及的微生物仍不是很清楚。目前，研究的主要是非純培養(yǎng)物。由于缺乏純培養(yǎng)物，金屬依賴型厭氧甲烷氧化的生化研究受到阻礙。因此，從不同厭氧環(huán)境中獲取金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌的純培養(yǎng)物對于更好地從生化層面理解及研究金屬依賴型厭氧甲烷氧化機理具有十分重要的意義。

2 金屬依賴型厭氧甲烷氧化的機制

M-DAOM微生物包括ANME和產甲烷古菌兩個大類，其氧化甲烷的方式目前主要有5種（圖2）。其中，前兩種方式主要存在于ANME（圖2A、B）（He et al.，2018）：（1）ANME（如 ANME-2a、2c、2d）單獨完成M-DAOM，即ANME直接將甲烷氧化為CO2，并將產生的電子直接傳遞到可溶金屬離子或金屬離子絡合物或固體金屬氧化物上（Ettwig et al.，2016；Lu et al.，2016；Scheller et al.，2016；Cai et al.，2018；Leu et al.，2020）；（2）ANME與金屬還原微生物（Metal-reducing microorganism，MRM）合作共同完成M-DAOM過程（Fu et al.，2016），即首先ANME將甲烷氧化為CO2產生的電子直接傳遞給MRM，然后MRM利用從 ANME獲得的電子將金屬氧化物還原。金屬依賴厭氧甲烷氧化的后3種途徑則主要由產甲烷古菌催化（圖2C—E）（何丹等，2020）：（1）產甲烷古菌將氧化甲烷產生的電子直接傳遞到給金屬離子或金屬離子絡合物或固體金屬氧化物，并將其還原（Bar-Or et al.，2017）；（2）產甲烷古菌將氧化甲烷產生的電子傳遞給電子穿梭體，后者再將金屬離子或金屬離子絡合物或固體金屬氧化物還原，從而實現(xiàn)甲烷厭氧氧化（He et al.，2019）；（3）產甲烷古菌將甲烷氧化并產生中間產物（如 H2）（Hoehler et al.，1994），然后MRM再利用產生的中間產物（如H2）將金屬氧化物還原（Lovley et al.，1989），從而實現(xiàn)甲烷厭氧氧化。

圖2 微生物介導的M-DAOM不同機制（He et al.，2018；何丹等，2020）Fig. 2 Different mechanisms of microbe-mediated M-DAOM(He et al., 2018; He et al., 2020)

He et al.（2018）認為金屬氧化物促進S-DAOM也屬于 M-DAOM，即首先 ANME將甲烷氧化為CO2產生的電子直接傳遞給SRB，然后SRB利用從ANME獲得的電子將硫酸鹽還原為S2-，產生的S2-通過一個隱藏的硫循環(huán)過程將金屬氧化物還原或與金屬氧化物的還原產物生成金屬硫化物（CH4+SO42-→HCO3-+HS-+H2O，HS-+2Fe(OH)3+5H+=2Fe2++S0+6H2O，HS-+2FeOOH+5H+=2Fe2++S0+4H2O，F(xiàn)e2++HS-=FeS+H+），從而促進S-DAOM（Hansel et al.，2015；Sivan et al.，2014b）。但本文作者認為有無金屬氧化物存在，S-DAOM過程中微生物都能將甲烷氧化，金屬氧化物的存在只是促進了S-DAOM。因此，金屬氧化物促進S-DAOM不屬于M-DAOM范疇。

目前，報道的微生物介導M-DAOM以金屬離子/金屬氧化物直接耦合甲烷厭氧氧化的反向產甲烷途徑為主。Ettwig et al.（2016）將只含AAA一種古菌的培養(yǎng)物和一系列金屬氧化物一起培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)加入檸檬酸鐵可以促使甲烷發(fā)生氧化，而且通過宏基因組分析發(fā)現(xiàn)在該富集物中沒有其他古菌和已知的鐵還原微生物，排除了鐵還原菌耦合ANME的可能性，這一切都暗示了AAA能夠利用金屬離子氧化甲烷。對AAA基因型進行分析，AAA含有反向產甲烷所需的全部基因，并且含有大量編碼血紅素c型細胞色素的基因（Ettwig et al.，2016）。先前電活性微生物的研究表明血紅素c型細胞色素在胞外電子傳遞中具有重要作用（Rosenbaum et al.，2011；Lovley，2012），因此推測AAA可以通過血紅素c型細胞色素將胞內電子傳遞給胞外電子受體檸檬酸鐵。Scheller et al.（2016）發(fā)現(xiàn)在含有ANME-2古菌（包括ANME-2a與ANME-2c）的培養(yǎng)基中分別加入 2, 6-蒽醌二磺酸鈉（Anthraquinone-2, 6-disulfonic acid Disodium Salt，AQDS）（一種人工電子受體）、腐殖酸、以及鐵的配合物（檸檬酸鐵和乙二胺四乙酸鐵）時均可發(fā)生甲烷厭氧氧化現(xiàn)象，主要原因是ANME-2古菌細胞膜表面含有大量血紅素c型細胞色素，c型細胞色素可以使AQDS、以及 Fe3+等胞外電子受體接受來自古菌體內通過反向產甲烷途徑產生的電子，也就是說 AQDS與Fe3+等胞外電子受體直接充當了末端電子受體的角色。Soo et al.（2016）通過宏基因組與宏轉錄組分析，證實Fe(Ⅲ)介導M. acetivorans C2A厭氧氧化甲烷時，還原Fe3+等胞外電子受體所需的電子由菌體內通過“反向產甲烷途徑”產生。宏基因組分析表明M. ferrireducens具有編碼“反向產甲烷途徑”及多血紅素c型細胞色素的基因，而這些細胞色素c被認為促進異化Fe(Ⅲ)還原（Cai et al.，2018）。宏轉錄組分析顯示Fe(Ⅲ)介導AOM時這些基因上調，這進一步支持M. ferrireducens能夠以Fe(Ⅲ)作為末端電子受體，通過“反向產甲烷途徑”獨立地介導 AOM（Cai et al.，2018）。Leu et al.（2020）以淡水沉積物接種生物反應器，并添加甲烷與水鈉錳礦，富集得到的微生物菌群以C. M. manganicus和C. M. manganireducens為主，宏基組及轉錄組分析顯示上述兩菌株能夠以 Mn(Ⅳ)作為末端電子受體，通過“反向產甲烷途徑”獨立地介導AOM。

目前，主要根據(jù)環(huán)境與純培養(yǎng)物的宏基因組和宏轉錄組分析推測M-ANME是通過金屬離子直接耦合“反向產甲烷途徑”機制厭氧氧化甲烷（McGlynn，2017；Timmers et al.，2017），但是并沒有從分子水平對該機制的每一步進行驗證。由于絕大部分的ANME只能以CH4為底物生長，從而阻礙了從分子水平對該機制進行驗證。因此，需篩分、富集獲得多底物純培養(yǎng)物，并以該純培養(yǎng)物為模式微生物，構建關鍵酶的基因突變株，研究金屬離子介導這些突變株代謝甲烷，以從分子水平對金屬離子/金屬氧化物直接耦合“反向產甲烷途徑”厭氧甲烷氧化的機制進行驗證。

3 金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌胞外電子傳遞機制研究

與傳統(tǒng)的胞內電子傳遞不同，金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌氧化甲烷時需將胞內產生的電子傳遞到胞外的終端電子。金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌胞內產生的電子如何穿過細胞膜與胞外電子受體（如Fe(Ⅲ)和Mn(Ⅳ)）建立“電”聯(lián)系，是金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌胞外電子傳遞機制研究的熱點。金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌氧化甲烷時會產生輔酶M（CoM-SH）、輔酶B（CoB-SH）、還原態(tài)輔酶 F420（Reduced coenzyme F420，F(xiàn)420H2）及還原態(tài)鐵氧還原蛋白（Fully Reduced ferredoxin，F(xiàn)dred2-）（Soo et al.，2016；Cai et al.，2018；Yan et al.，2018）。胞內 CoM-SH、CoB-SH、F420H2及 Fdred2-如何被氧化，以及氧化產生的電子如何直接傳遞到胞外終端電子受體（如Fe(Ⅲ)和Mn(Ⅳ)）是金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌胞外電子傳遞機制研究需解決的關鍵問題。

Yan et al.（2018）通過M. acetivorans C2A氧化甲烷時的轉錄組分析提出了 M. acetivorans C2A Fe(Ⅲ)依賴的厭氧甲烷氧化及胞外電子傳遞假設途徑（見圖3）。根據(jù)該假設模型，F(xiàn)dred2-被Rnf complex氧化，產生的電子經細胞色素c傳遞給Fe(Ⅲ)，并將其還原為Fe(Ⅱ)，從而實現(xiàn)Fdred2-攜帶的電子傳遞到胞外電子受體。在人工電子介體蒽醌2, 6-二磺酸鈉（Anthraquinone-2, 6-disulfonic Acid Disodium，AQDS）的介導下，與膜結合的異二硫物還原酶HdrDE（Heterodisulfide Reductase subunits D and E）將CoM-SH和CoB-SH氧化，產生的電子經AQDS傳遞給 Fe(Ⅲ)，并將其還原為 Fe(Ⅱ)，從而實現(xiàn)CoM-SH和CoB-SH攜帶的電子傳遞到胞外電子受體，但是AQDS依賴的電子從HdrDE傳遞到Fe(Ⅲ)的途徑不清楚，即HdrDE是直接將AQDS還原為AQDSH2，還是 HdrDE先將氧化態(tài)的甲烷吩嗪（Oxidized Methanophenazine，MP）還原為還原態(tài)的甲烷吩嗪（Reduced Methanophenazine，MPH2），然后 MPH2（E0= -165 mV vs SHE (Tietze et al.，2003)）再將AQDS（E0= -184 mV vs SHE (Wolf et al.，2009)）還原為AQDSH2。該途徑提出，所產生的F420H2通過兩種可能的機制被氧化，并將電子傳遞給胞外電子受體 Fe(Ⅲ)。一種是 F420H2被輔酶F420脫氫酶（F420H2dehydrogenase，F(xiàn)po）氧化，產生的電子將MP還原為MPH2，MPH2再將電子傳遞給胞外電子受體Fe(Ⅲ)，從而實現(xiàn)F420H2的氧化及攜帶的電子傳遞到胞外電子受體。但是MPH2位于質膜內，而Fe(Ⅲ)位于胞外，兩者之間不能直接接觸，因而無法直接傳遞電子。MPH2與胞外電子受體 Fe(Ⅲ)之間要實現(xiàn)電子傳遞，必須借助貫穿質膜外表面的媒介（如貫穿質膜外表面的細胞色素或MPH2氧化酶），但是這一媒介仍不清楚。另一種是 F420H2被細胞質中的異二硫物還原酶HdrA2B2C2（Heterodisulfide Reductase subunits A2，B2，and C2，HdrA2B2C2）氧化產生Fdred2-、CoM-SH及CoB-SH，F(xiàn)dred2-、CoM-SH及CoB-SH再分別被Rnf complex及HdrDE氧化，并將電子傳遞給胞外電子受體 Fe(Ⅲ)，從而實現(xiàn) F420H2的氧化及攜帶的電子傳遞到胞外電子受體。但是HdrA2B2C2只能氧化 F420H2（E0= -360 mV vs SHE）并還原 Fdox（E°′= -520 mV vs SHE）和 CoMS-S-CoB（E0′= -143 mV vs SHE (Tietze et al.，2003)）產生 Fdred-、CoM-SH及 CoB-SH（圖 4）（Yan et al.，2017）。因此，需構建M. acetivorans C2A的cytc、hdrA2B2C2及fpo基因突變株，驗證 Cyt c、HdrA2B2C2及 Fpo在 Fe(Ⅲ)介導 M.acetivorans C2A厭氧氧化甲烷時胞外電子傳遞中的作用，進而從分子水平對M. acetivorans C2A胞外電子傳遞機制進行驗證。

圖3 M. acetivorans C2A Fe(Ⅲ)依賴的甲烷氧化及胞外電子傳遞假設途徑（Yan et al.，2018）Fig. 3 Pathway proposed for Fe(III)-dependent methane oxidation and conservation of energy by M. acetivorans (Yan et al., 2018)

圖4 胞質異二硫化物還原酶HdrA2B2C2利用CoMS-S-CoB和F420H2還原Fdox假設機制（Yan et al.，2017）Fig. 4 Proposed scheme for the reduction of Fdox with CoM-S-S-CoB and F420H2 by cytoplasmic electron confurcating heterodisul fide reductase HdrA2B2C2 complex (Yan et al., 2017)

Cai et al.（2018）從以氫氧化鐵為電子受體、甲烷為底物的實驗室生物反應器中富集、分離得了一株厭氧甲烷營養(yǎng)古菌M. ferrireducens，13C-和57Fe同位素標記批次實驗表明 M. ferrireducens可實現(xiàn)AOM與Fe(Ⅲ)的還原相耦合。宏基因組分析表明，立地介導 AOM，并通過轉錄組分析提出了 M.ferrireducens Fe(Ⅲ)依賴的甲烷氧化及胞外電子傳遞假設途徑（圖5）。M. ferrireducens沿“逆向產甲烷”途徑將甲烷氧化并產生CoM-SH、CoB-SH、F420H2及Fdred2-。HdrDE將產生的部分CoM-SH與CoB-SH氧化的同時將氧化態(tài)甲基萘醌（oxidized menaquinone，MK）還原為還原態(tài)甲基萘醌（reduced menaquinone，MKH2）。Fdred2-及產生的部分CoMSH與CoB-SH被HdrABC-FrhB complex氧化，氧化產生的電子將F420還原為F420H2，產生的F420H2被Fpo氧化的同時將MK還原為還MKH2。最后，產生的MKH2被Cytb或NfrD氧化并將電子傳遞給胞外的電子受體 Fe(Ⅲ)，從而實現(xiàn)胞外電子傳遞。但是 MK/MKH2的氧化還原電位（E0′= -260 mV vs SHE (Kishi et al.，2017)）較 CoM-S-S-CoB/(CoMSH+CoB-SH)的氧化還原電位（E0′= -143 mV vs SHE (Tietze et al.，2003)）低很多，HdrDE無法直接利用CoM-SH與CoB-SH將MK還原為MKH2。因此，圖5中HdrDE利用CoM-SH與CoB-SH將MK還原為 MKH2的假設值得探討。此外，M.ferrireducens只能代謝甲烷，且HdrDE、HdrABCFrhB complex、Fpo、Cytb及NfrD在M. ferrireducens胞外電子傳遞過程中必不可少，不能通過構建相關酶的基因突變株的方式對相關酶的功能進行驗證，因而不能從分子水平對 M. ferrireducens胞外電子傳遞假設途徑進行驗證。

圖5 M. ferrireducens Fe(Ⅲ)依賴的甲烷氧化及胞外電子傳遞假設途徑（Cai et al.，2018）Fig. 5 Metabolic construction of the putative pathway for AOM coupled to Fe(III) reduction in “M. ferrireducens” (Cai et al., 2018)

Leu et al.（2020）以淡水沉積物接種生物反應器、甲烷為底物及水鈉錳礦為電子受體，富集得到的微生物菌群中以 C. M. manganicus和 C. M.manganireducens為主，通過宏基組及轉錄組分析提出了上述兩菌株在 Mn(IV)介導下厭氧氧化甲烷的胞外電子傳遞假設機制（見圖 6）。C.Methanoperedens沿“逆向產甲烷”途徑將甲烷氧化并產生CoM-SH、CoB-SH、F420H2及Fdred。HdrDE將產生的部分 CoM-SH與 CoB-SH氧化的同時將MK還原為MKH2。Fdred及產生的部分CoM-SH與CoB-SH被HdrABC-FrhB complex氧化，氧化產生的電子將F420還原為F420H2。產生的F420H2被Fpo氧化的同時將MK還原為還MKH2。最后，產生的MKH2通過 menaquinone：cytochrome c oxidoreductases傳遞給位于細胞質膜外的多血紅素細胞色素c將Mn(Ⅳ)氧化物還原。

圖6 Ca. Methanoperedens基因組中AOM與Mn(IV)還原偶聯(lián)的代謝途徑構建（Leu et al.，2020）Fig. 6 Metabolic construction of the putative pathway for AOM coupled to Mn(IV) reduction in the“Ca. Methanoperedens” genomes (Leu et al., 2020)

4 展望

金屬依賴型厭氧甲烷氧化對全球碳元素、硫元素、磷元素以及金屬元素的循環(huán)有著重要影響，是生物地球化學、地質微生物學等許多基礎學科的熱點課題。盡管近些年在金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌、甲烷厭氧氧化機制乃至厭氧甲烷營養(yǎng)古菌胞外電子傳遞等方面取得了令人振奮的成就，但總體上講金屬依賴型厭氧甲烷氧化仍有太多未解決的問題。盡管強調了金屬偶聯(lián)AOM的全球重要性，但迄今為止，無論是其機制還是所涉及的微生物都缺乏深入研究。由于缺乏足夠的純培養(yǎng)物，金屬依賴型厭氧甲烷氧化的生化研究受到阻礙，獲取金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌的純培養(yǎng)物對于更好地理解及研究金屬依賴型厭氧甲烷氧化機理具有十分重要意義。因此，需篩分、富集獲得多底物純培養(yǎng)金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌，并以該金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌為模式微生物，從分子水平對金屬離依賴型甲烷厭氧氧化的機制進行驗證。此外，現(xiàn)有研究也沒有從分子水平揭示金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌胞外電子傳遞機制。目前，主要根據(jù)環(huán)境與純培養(yǎng)物的宏轉錄組分析推測金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌可能的胞外電子傳遞機制，但是并沒有從分子水平對其進行驗證。由于絕大部分的金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌只能以CH4為底物生長，且金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌純培養(yǎng)物較少，從而阻礙了從分子水平對金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌可能的胞外電子傳遞機制進行驗證。

金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌胞外電子傳遞中，HdrDE、HdrA2B2C2、HdrABC-FrhB及Fpo起重要作用，可以以乙酸為底物構建 M. acetivorans C2A的 hdrA2B2C2基因突變株，然后研究 M.acetivorans C2A的hdrA2B2C2基因突變株代謝甲烷以對 HdrA2B2C2的功能進行驗證。Fe3+能介導產甲烷菌 Methanosarcina barkeri 800及Methanosarcina barkeri Fusaro氧化甲醇，可以以乙酸為底物構建M. barkeri 800或M. barkeri Fusaro的fpo基因突變株，然后研究Fe3+介導M. barkeri 800或M. barkeri Fusaro的fpo基因突變株代謝甲醇以對 Fpo在胞外電子傳遞中的作用進行驗證。HdrABC-FrhB在產甲烷菌 Methanosaeta harundinacea 6Ac直接利用胞外電子還原CO2產甲烷中起重要作用，可以以乙酸為底物構建 M.harundinacea 6Ac的hdrABC/frhB基因突變株，然后研究產甲烷菌M. harundinacea 6Ac hdrABC/frhB基因突變株直接利用胞外電子還原CO2產甲烷以對HdrABC-FrhB的功能進行驗證。吡啶和鹽酸羥胺可以抑制HdrDE（Kamlage et al.，1992），因而可研究吡啶和鹽酸羥胺對金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌氧化甲烷的影響以驗證 HdrDE在金屬依賴型厭氧甲烷營養(yǎng)古菌胞外電子傳遞中的作用。此外，可以從產甲烷菌中篩選能氧化甲烷的產甲烷菌，并以該類產甲烷菌為模式微生物，構建厭氧甲烷氧化胞外電子傳遞中涉及的酶的基因突變株，并研究這些突變株氧化甲烷特性，從而揭示這些酶在厭氧甲烷氧化胞外電子傳遞中的作用。對不同生境中AOM過程和胞外電子傳遞機理進行深入了解和研究，有助于進一步理解AOM、全球碳循環(huán)及生物礦化，并對控制甲烷排放具有十分重要的指導意義。