• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    紅豆皮多酚提取物對兩種致病菌的抑菌活性及作用機理

    2022-01-06 02:31:30葛思彤任世達劉景圣
    食品科學 2021年23期
    關鍵詞:食源性李斯特紅豆

    賈 睿,蔡 丹,葛思彤,任世達,劉景圣

    (吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,小麥和玉米深加工國家工程實驗室,吉林 長春 130118)

    食源性致病菌污染是影響食品安全和引發(fā)公共衛(wèi)生事件的潛在威脅因素,常見的致病菌包括大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌等,這些致病菌具有較強的耐受干燥、酸、鹽、熱等環(huán)境因素的能力,導致其可以在食品生產(chǎn)、加工和貯藏過程中長期生存?;瘜W來源的抑菌劑是有效的防控方式,但其在抑制腐敗微生物和致病菌生長的同時,可能存在安全隱患并可能使致病微生物產(chǎn)生耐藥性,從而引發(fā)了較多爭議[1]。研究發(fā)現(xiàn),蒼山子中的槲皮素對金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌具有較強的抑菌活性[2];柑橘類水果中的柚皮素具有抑制鼠傷寒沙門氏菌的作用[3];茶葉中的茶多酚可顯著抑制革蘭氏陽性菌生長[4]。這些天然產(chǎn)物提取物除了表現(xiàn)出抑制致病菌活性外,還具有綠色、安全、高效等特點,往往采用單獨或與蛋白、多糖混合成膜噴灑、包埋或涂抹等方式應用于食品的抑菌中。

    糧食副產(chǎn)物中富含具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物,如酚類化合物。酚類化合物具有調(diào)節(jié)血糖、預防動脈粥樣硬化、抗氧化和抗炎等多種生理活性,研究表明大麥提取物中的大麥多酚對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌等均有抑制生長作用[5-7]。紅豆(Vigna angularis)是一種一年生半纏繞草本植物,《本草綱目》中記載其有助于抗水腫、腹瀉和嘔吐等[8]。紅豆在現(xiàn)代糧食加工過程中常會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——紅豆皮,紅豆皮中富含三萜皂苷、酚類化合物、植物甾醇和色素等生物活性物質(zhì),其中的酚類化合物被認為是生物活性最高的代謝產(chǎn)物之一,主要包含兒茶素苷、槲皮素苷、楊梅素3-鼠李糖苷、花色苷和原花青素二聚體等[9-10]。目前國內(nèi)外研究多集中于紅豆皮成分以及抗氧化活性方面,對于紅豆皮多酚提取物的抑菌活性及抑菌機理鮮見報道。

    綜上,本實驗以紅豆皮為原料,采用超聲波輔助醇提法制備紅豆皮多酚提取物,分析其對李斯特菌、沙門氏菌兩種食源性致病菌的抑菌活性,并探究其抑菌機理,以期為糧食源抑菌劑的開發(fā)與應用提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    紅豆皮取自吉林農(nóng)業(yè)大學小麥和玉米深加工國家工程實驗室;李斯特菌ATCC19119(ListeriainnocuaATCC19119)(G+)、沙門氏菌ATCC14028(SalmonellaATCC14028)(G-)均取自吉林農(nóng)業(yè)大學。

    膜電位熒光探針DiBAC4(3) 北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、ATP檢測試劑盒、堿性磷酸酶檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司。所有試劑均為國產(chǎn)分析純;液相色譜試劑均為色譜級。

    1.2 儀器與設備

    HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱、DL-CL-ND超凈工作臺哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司;Autoclave 4001136高壓滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;FLUO star Omega全自動多功能酶標儀 德國BMG Labtech公司;Z36HK超高速冷凍離心 德國Hermle公司;FD-1B-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康儀器有限公司;HD-3紫外檢測器、BSZ-100自動部分收集器、玻璃層析柱(1.8 cm×30 cm) 上海滬西分析儀器廠;GeminiSEM場發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司;1200型高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

    1.3 方法

    1.3.1 紅豆皮多酚提取物的制備

    根據(jù)Luo Jiaqiang等[11]的方法并略作修改制備紅豆皮多酚提取物。稱取紅豆皮粉末2.000 g,置于200 mL燒杯中,以料液比1∶30加入體積分數(shù)70%的乙醇溶液,攪拌均勻。然后在室溫條件下,360 W超聲處理30 min,樣液取出后立即離心20 min(4 000 r/min),取上清液,通過45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮粗提物。利用AB-8大孔樹脂進行純化(上樣液質(zhì)量濃度2.5 mg/mL、上樣液體積330 mL、流速1 mL/min、體積分數(shù)70%乙醇溶液洗脫),將純化液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮,冷凍干燥后得到粉末狀紅豆皮多酚提取物,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    采用Folin-Ciocalteu法測定紅豆皮多酚提取物的多酚含量,根據(jù)文獻[12]方法略作修改。繪制沒食子酸標準曲線:配制質(zhì)量濃度分別為0、4、8、12、16、20、24 μg/mL的沒食子酸溶液,吸取各質(zhì)量濃度溶液1 mL,加入Folin-Ciocalteu試劑2.5 mL以及質(zhì)量分數(shù)15%的Na2CO3溶液2 mL于比色管中,加去離子水定容至10 mL,搖勻,在黑暗處靜置2 h,然后在96 孔板酶標儀中于765 nm波長處測定吸光度,得到標準曲線線性回歸方程:y=0.015 8x+0.046 6,R2=0.9988。精確吸取適量紅豆皮多酚提取物干粉配制的溶液50 μL,按上述方法處理并測定吸光度。通過標準曲線方程計算出溶液中多酚的質(zhì)量濃度,每組做3個平行。根據(jù)下式計算出紅豆皮提取物的多酚含量為(145.28±2.21)mg/g。

    式中:ρ為紅豆皮多酚的質(zhì)量濃度/(mg/mL);V為提取液體積/mL;N為稀釋倍數(shù);m為紅豆皮提取物干粉的質(zhì)量/g。

    1.3.2 高效液相色譜測定紅豆皮多酚組成

    為了進一步分析純化后紅豆皮多酚類物質(zhì)的組成成分,將純化后的紅豆皮多酚提取物溶于色譜級甲醇中,稀釋至1 mg/mL,通過0.45 μm有機濾膜過濾,并使用Zorbox SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μm),通過高效液相色譜儀對紅豆皮多酚提取物混合液的組成成分進行分析。色譜參數(shù):柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:20 μL;流動相A:甲醇;流動相B:體積分數(shù)0.5%冰醋酸。洗脫條件:0~5 min,5% A;5~10 min,8% A;10~20 min,12% A;20~30 min,20% A;30~40 min,40% A;40~50 min,50% A;50~60 min,60% A;60~65 min,70% A;65~70 min,80% A。比較樣品色譜峰保留時間與標準品保留時間,判定紅豆皮多酚提取物中單體酚的組成。

    1.3.3 紅豆皮多酚提取物最小抑菌濃度的測定

    參考Kanatt等[13]的二倍等度稀釋96 孔板法測定紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028兩種供試菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。將兩種細菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基,于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600nm=0.6)(培養(yǎng)條件后同),紅豆皮多酚提取物用二倍稀釋法通過LB液體培養(yǎng)基稀釋至不同質(zhì)量濃度(5 000、2 500、1 250、625、312、156 mg/mL),將50 μL對數(shù)期菌液與50 μL不同質(zhì)量濃度多酚提取物溶液于96 孔板內(nèi)混合均勻后,37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,通過酶標儀測定菌液OD600nm,以沒有菌體生長(未檢測到OD600nm)所對應的多酚提取物終質(zhì)量濃度為MIC。以無菌水和10 μg/mL氨芐西林分別為陰性和陽性對照。

    1.3.4 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌生長曲線影響的測定

    使用Taukoorah等[14]的方法,取培養(yǎng)至對數(shù)期的兩種供試菌50 mL和不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物溶液,加入到100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中,使紅豆皮多酚提取液的終質(zhì)量濃度分別為0(對照)、1 MIC、2 MIC。以終質(zhì)量濃度0.01 g/mL的氨芐西林作為陽性對照。置于37 ℃、180 r/min恒溫搖床中培養(yǎng),并從0 h開始,每小時取一次樣,測定OD600nm。以培養(yǎng)時間與OD600nm的關系繪制生長曲線。

    1.3.5 菌體細胞膜完整性的測定

    將50 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的兩種供試菌在4 ℃、5 000 r/min下離心5 min,收集菌體并用無菌生理鹽水洗滌3 次,離心后用生理鹽水重懸至107CFU/mL。將5 mL菌懸液與5 mL不同質(zhì)量濃度(2 MIC、4 MIC)多酚提取物溶液混合,并在37 ℃下孵育,以相同體積的生理鹽水作為陰性對照。分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 h和6 h,離心(4 ℃、5 000 r/min、5 min)去除菌體,得到上清液,經(jīng)0.22 μm醋酸纖維素濾膜過濾。過膜后按照BCA試劑盒說明測定蛋白質(zhì)量濃度。同時利用紫外分光光度計測定上清液OD260nm,通過OD260nm來確定細胞內(nèi)核酸的泄漏情況[15-16]。

    1.3.6 菌體細胞膜電位的測定

    將兩種供試菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期,取50 mL菌液離心(4 ℃、5 000×g、5 min)并將菌體沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌3~4 次,用磷酸鹽緩沖液調(diào)整菌液濃度至107CFU/mL。用二甲基亞砜將DiBAC4(3)溶解后加至黑色不透明96 孔板中,加入125 μL菌液和終濃度1 μmol/L的DiBAC4(3)熒光探針,在37 ℃培養(yǎng)箱中平衡30 min,之后加入125 μL紅豆皮多酚提取物溶液,使其終質(zhì)量濃度分別達到0(對照)、1 MIC、2 MIC。利用多功能酶標儀在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為492 nm和515 nm條件下測定相對熒光強度,以相對熒光強度表征細胞膜電位[17]。

    1.3.7 菌體細胞內(nèi)ATP含量的測定

    將兩種供試菌接種至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期,取50 mL菌液離心(4 ℃、5 000 r/min、5 min)收集菌體,并用無菌生理鹽水洗滌3 次,再用無菌生理鹽水重懸至107CFU/mL,取菌懸液1 mL加入1 mL紅豆皮多酚提取物溶液,使紅豆皮多酚提取物終質(zhì)量濃度分別為0(對照)、1 MIC、2 MIC,置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。按照ATP檢測試劑盒說明書處理樣品,利用多功能酶標儀測定熒光相對發(fā)光值,以相對發(fā)光值表征菌體細胞內(nèi)ATP含量[18]。

    1.3.8 菌體細胞外堿性磷酸酶活力的測定

    將50 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的兩種供試菌在4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min,收集菌體并用無菌生理鹽水洗滌3 次,再用無菌生理鹽水重懸至107CFU/mL。將5 mL菌懸液與5 mL不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物溶液混合,使其終質(zhì)量濃度分別為1 MIC、2 MIC,并在37 ℃下孵育0、3、6、9 h和12 h。將混合物以8 000 r/min離心10 min后,根據(jù)試劑盒說明測定堿性磷酸酶活力。

    1.3.9 菌體形態(tài)的觀察

    根據(jù)Chen Mingshun等[19]的方法加以改進觀察菌體形態(tài)。將50 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的兩種供試菌在4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min,收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌3 次后,再用無菌生理鹽水重懸至107CFU/mL。向5 mL菌懸液中加入5 mL不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物溶液,使其終質(zhì)量濃度分別為0(對照)、1 MIC、2 MIC,培養(yǎng)12 h后4 ℃、8 000 r/min條件下離心,沉淀用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌,4 ℃、8 000 r/min離心并棄上清液,用體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液4 ℃過夜固定。隨后用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗,依次用體積分數(shù)20%、60%、80%、90%和100%乙醇進行梯度脫水。脫水結(jié)束后,用乙醇-叔丁醇(1∶1,V/V)溶液置換20 min,最后用體積分數(shù)100%叔丁醇置換兩次。置換后將樣品進行干燥處理,干燥后的樣品進行離子濺射儀噴鍍后,通過加速電壓為5 kV的場發(fā)射掃描電子顯微鏡進行微觀形貌觀察。

    1.3.10 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

    采用Wang Chenjie等[20]的方法進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)。將50 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的兩種供試菌在4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min,收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌3 次后,再用無菌生理鹽水重懸至107CFU/mL。取5 mL菌懸液,加入5 mL相應質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取液,使其終質(zhì)量濃度1 MIC,以等體積無菌水和10 μg/mL氨芐西林為陰性和陽性對照,37 ℃恒溫培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12 h,在8 000 r/min下離心10 min,棄上清液,用無菌生理鹽水洗滌菌體兩次后重懸于無菌生理鹽水(107CFU/mL)中,取5 μL菌液加入等體積上樣緩沖液,在100 ℃水浴中加熱10 min。采用質(zhì)量分數(shù)12%的分離膠和質(zhì)量分數(shù)5%的濃縮膠進行電泳,利用質(zhì)量分數(shù)0.1%的考馬斯亮藍R250染色,凝膠脫色好后用凝膠成像儀進行觀察并拍照。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    使用SPSS Statistics 24軟件進行數(shù)據(jù)分析,利用Duncan’s多重比較進行差異顯著性分析,以P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。使用Origin 2017軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 紅豆皮多酚組成分析結(jié)果

    如表1所示,紅豆皮多酚中含量相對較高的多酚化合物是槲皮素與金絲桃苷。據(jù)報道,槲皮素是一種具有抗菌和抗氧化活性的黃酮類化合物[21-22],同時在癌癥治療中具有促進癌細胞凋亡和抑制癌細胞增殖的作用[23-24]。金絲桃苷也具有多種藥用特性,如抗炎、抗病毒、抗氧化和抗腫瘤等[25]。蘆丁是一種黃酮類化合物,廣泛存在于蕓香葉、煙葉和橙皮等植物中[26];山柰酚是一種黃酮醇類化合物,能夠有效抑制癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移[27];表兒茶素是兒茶素類化合物,屬于黃烷醇化合物,與兒茶素互為同分異構(gòu)體,具有預防癌癥、止瀉、止血、抗真菌及以預防胃潰瘍等作用,同時表兒茶素可以通過抑制葡萄球菌生物膜的形成達到抗菌的效果[28-29]。此外,紅豆皮多酚還含有多種酚酸,包括沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、對香豆酸和咖啡酸,這些酚酸具有如抗氧化、抗菌、抗炎等生物活性[30]。因此,從紅豆皮多酚組成分析結(jié)果可知,紅豆皮富含多酚類物質(zhì),可作為一種天然抗氧化劑和抗菌劑的良好來源。

    表1 紅豆皮多酚組分Table 1 Polyphenol composition of adzuki bean seed coat

    2.2 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌的最小抑菌濃度

    如表2所示,紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028的MIC分別為625 μg/mL和2 500 μg/mL??梢钥闯?,紅豆皮多酚提取物對革蘭氏陽性和陰性細菌的生長均具有抑制作用。但是,其效果因微生物類型和紅豆皮多酚提取物濃度而異,可能主要與菌體細胞壁結(jié)構(gòu)的差異有關,革蘭氏陽性菌只有單層細胞壁,而革蘭氏陰性菌則具有外膜和獨特的胞質(zhì)間隙,因此,與革蘭氏陰性菌相比,多酚更容易破壞單層細胞壁,抑制菌體的核酸合成以及能量代謝等生物學功能[31]。

    表2 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028的MICTable 2 MICs of adzuki bean seed coat polyphenols against Listeria ATCC19119 and Salmonella ATCC14028

    2.3 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌生長曲線的影響

    由圖1可知,與對照處理相比,1 MIC條件下兩種食源性致病菌的生長對數(shù)期均相對滯后,而2 MIC組OD600nm的增長速率與1 MIC組OD600nm相比趨勢明顯降低,說明在2 MIC下,紅豆皮多酚提取物對供試菌的生長能力有更強的抑制作用。陽性對照組完全抑制了菌體生長,2 MIC組與其抑制效果接近。

    圖1 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119 和沙門氏菌ATCC14028生長曲線的影響Fig. 1 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on the growth curves of Listeria ATCC19119 and Salmonella ATCC14028

    2.4 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌細胞膜完整性的影響

    抑菌物質(zhì)在破壞菌體細胞膜完整性的過程中,還增加了菌體細胞膜的滲透性,導致細胞內(nèi)容物流失[16]。Chen Lin等[32]發(fā)現(xiàn),細胞膜受損的李斯特菌能引起細胞內(nèi)組分大量流失。從圖2可以看出,在不同質(zhì)量濃度紅豆皮多酚提取物的作用下,李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028細菌上清液中的蛋白質(zhì)和核酸水平隨時間延長逐漸提升。結(jié)果表明,在不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物作用下,李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028的細胞壁膜通透性增加,細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸存在不同程度的泄漏,且添加高質(zhì)量濃度紅豆皮多酚提取物組的細菌核酸和蛋白質(zhì)泄漏程度更劇烈。

    圖2 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028胞外蛋白質(zhì)和核酸水平的影響Fig. 2 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on extracellular protein and nucleic acid contents of Listeria ATCC19119 and Salmonella ATCC14028

    2.5 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌細胞膜電位的影響

    靜息膜電位是反映細胞存活情況最重要的參數(shù)之一。DiBAC4(3)是一種測定膜極化變化的熒光膜電位染料,其本身無熒光,當進入細胞與細胞質(zhì)中的蛋白結(jié)合后才發(fā)出熒光,熒光強度增加,即膜電位增加,表明細胞發(fā)生去極化[33-34]。圖3為不同質(zhì)量濃度的紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028的細胞膜電位的影響。經(jīng)1 MIC和2 MIC紅豆皮多酚提取物處理后,李斯特菌ATCC19119的相對熒光強度與對照組相比分別增加了3.76 倍和6.91 倍,沙門氏菌ATCC1402的相對熒光強度與對照組相比分別增加了3.58 倍和5.59 倍,即細胞發(fā)生去極化。

    圖3 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌 ATCC19119(A) 和沙門氏菌ATCC14028(B)細胞膜電位的影響Fig. 3 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on membrane potential in Listeria ATCC19119 and Salmonella ATCC14028

    2.6 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌細胞內(nèi)ATP含量的影響

    當細胞受損或死亡時,菌體細胞中的ATP含量會迅速下降,故ATP含量可以反映細胞的存活狀態(tài)[20]。ATP含量的降低可能是細胞質(zhì)ATP釋放量增加和質(zhì)子泵ATP酶的水解速率上升所致[35]。在正常條件下,菌體細胞中ATP的含量相對穩(wěn)定。經(jīng)抑菌劑處理后,菌體細胞膜受損,導致細胞膜變得不穩(wěn)定,細胞內(nèi)ATP合成速率降低,細胞內(nèi)ATP水平降低。圖4為紅豆皮多酚提取物分別對李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028細胞內(nèi)ATP含量的影響。與對照組相比,經(jīng)1 MIC和2 MIC紅豆皮多酚提取物處理的李斯特菌ATCC19119細胞內(nèi)ATP的相對發(fā)光值分別降低了74.68%、89.88%;經(jīng)1 MIC和2 MIC紅豆皮多酚提取物處理的沙門氏菌ATCC14028細胞內(nèi)ATP的相對發(fā)光值分別降低了69.56%、87.12%。與對照組相比,紅豆皮多酚提取物處理后菌體細胞中的ATP含量顯著降低(P<0.05,P<0.01),并且隨著提取物質(zhì)量濃度的增加,菌體細胞中的ATP含量降低更明顯,說明紅豆皮多酚能夠影響菌體的生命活動,促進或?qū)е戮w死亡。

    圖4 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119(A)和沙門氏菌ATCC14028(B)胞內(nèi)ATP含量的影響Fig. 4 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on intracellular ATP contents of Listeria ATCC19119 (A) and Salmonella ATCC14028 (B)

    2.7 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌菌體堿性磷酸酶活力的影響

    堿性磷酸酶存在于細菌的細胞膜和細胞壁之間,因此未經(jīng)處理的菌懸液中應無堿性磷酸酶活性。因此,可通過檢測細菌懸液中堿性磷酸酶的泄漏情況來反映細胞壁的通透性[36-37]。如圖5所示,與對照相比,經(jīng)紅豆皮多酚提取物處理后李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028細胞堿性磷酸酶活力明顯增加,且堿性磷酸酶活力隨處理時間的延長或者紅豆皮多酚提取物質(zhì)量濃度的增加而升高,表明紅豆皮多酚提取物會導致細胞壁通透性增加,破壞菌體細胞壁完整性。

    圖5 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119(A)和沙門氏菌ATCC14028(B)堿性磷酸酶活力的影響Fig. 5 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on alkaline phosphatase activity of Listeria ATCC19119 (A) and Salmonella ATCC14028 (B)

    2.8 紅豆皮多酚提取物對食源性致病菌菌體形態(tài)的影響

    用掃描電子顯微鏡觀察紅豆皮多酚處理后李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028細胞的細胞膜完整性和形態(tài)變化。如圖6、7所示,未經(jīng)處理的李斯特菌和沙門氏菌菌體細胞分別呈橢球狀和短桿狀,表面相對完整,沒有明顯的皺紋和裂紋。而經(jīng)紅豆皮多酚提取物處理的菌體細胞受到嚴重破壞,在菌體細胞表面上能夠觀察到明顯的褶皺和凹陷,且細胞發(fā)生黏附和聚集。這些結(jié)果表明紅豆皮多酚能夠破壞兩種菌體細胞的細胞膜,導致菌體的死亡和瓦解。

    圖6 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119形態(tài)的影響Fig. 6 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on cell morphology of Listeria ATCC19119

    圖7 紅豆皮多酚提取物對沙門氏菌ATCC14028形態(tài)的影響Fig. 7 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on cell morphology of Salmonella ATCC14028

    2.9 SDS-PAGE分析結(jié)果

    菌體細胞膜蛋白在維持細胞膜通透性方面起著重要作用。細胞膜蛋白的損傷可能導致菌體細胞膜中酶系統(tǒng)完整性的破壞。Nakayama等[38]發(fā)現(xiàn)表沒食子酸阻斷了大腸桿菌細胞外膜蛋白的孔通道,抑制外膜的被動轉(zhuǎn)運,從而抑制大腸桿菌的生長。如圖8所示,經(jīng)1 MIC紅豆皮多酚提取物處理的李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028菌株的蛋白條帶灰度與陰性對照組相比降低,李斯特菌ATCC19119中48~135 kDa蛋白條帶灰度明顯降低,沙門氏菌ATCC14028中25~35 kDa和48~100 kDa蛋白條帶灰度明顯降低,且李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028菌株的蛋白含量與紅豆皮多酚提取物處理時間呈負相關。

    圖8 紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119(A)和沙門氏菌ATCC14028(B)蛋白組成的影響Fig. 8 Effects of adzuki bean seed coat polyphenols on the protein composition of cell membranes of Listeria ATCC19119 (A) and Salmonella ATCC14028 (B)

    3 結(jié) 論

    本實驗通過高效液相色譜法檢測出紅豆皮多酚的13 種單體酚成分。紅豆皮多酚提取物對李斯特菌ATCC19119和沙門氏菌ATCC14028菌體細胞具有有效的抑菌活性,其對李斯特菌ATCC19119的MIC為625 μg/mL,對沙門氏菌ATCC14028的MIC為2 500 μg/mL。此外,通過分析經(jīng)紅豆皮多酚提取物處理后的細菌細胞內(nèi)容物蛋白質(zhì)和核酸的含量變化發(fā)現(xiàn),二者均明顯減少,因此可以推斷紅豆皮多酚的作用機制是破壞細胞膜通透性,從而導致核酸和蛋白質(zhì)的損失。SDS-PAGE結(jié)果也可以證明在紅豆多酚的作用下細菌胞內(nèi)蛋白含量減少。同時,紅豆皮多酚會使細胞內(nèi)ATP含量顯著性降低,細菌細胞膜產(chǎn)生去極化現(xiàn)象。綜上,推測紅豆皮多酚的作用會導致細胞裂解和死亡,這與細胞膜通透性的增加有關。通過掃描電子顯微鏡觀察到的菌體表面褶皺和凹陷的現(xiàn)象也能夠支持上述假設。然而,考慮到食品的安全性,在將紅豆皮多酚應用于食品生產(chǎn)前還需進行安全性實驗,優(yōu)化使用劑量并分析其對食品感官特性產(chǎn)生的影響。

    猜你喜歡
    食源性李斯特紅豆
    紅豆緣
    紅豆(2022年9期)2022-11-04 03:15:14
    秋冬季高發(fā)食源性疾病的危害與預防
    中老年保健(2022年1期)2022-08-17 06:14:22
    論食品安全與食源性疾病的控制
    夏季食品安全頭號殺手——食源性疾病
    中老年保健(2021年6期)2021-08-24 06:54:00
    我請鴿子來吃飯
    幼兒園(2019年7期)2019-09-05 17:49:18
    食源性病原微生物的危害
    那年桃夭,紅豆暗拋
    誰在千年前種下紅豆
    火花(2015年3期)2015-02-27 07:41:06
    紅豆紅
    音樂生活(2014年2期)2014-04-25 00:04:00
    保持肅靜
    小小說月刊(2013年6期)2013-05-14 14:55:19
    日韩 亚洲 欧美在线| 熟女电影av网| 久久狼人影院| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 国产男女内射视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产 一区精品| 国产高清国产精品国产三级| 天堂俺去俺来也www色官网| 男女无遮挡免费网站观看| av.在线天堂| 少妇人妻久久综合中文| 一区二区三区乱码不卡18| 九九爱精品视频在线观看| 在线天堂中文资源库| 国产精品无大码| 97在线视频观看| 丝袜美足系列| 国产乱人偷精品视频| 女性生殖器流出的白浆| 国产成人91sexporn| 国产成人免费无遮挡视频| 婷婷色av中文字幕| 在线天堂中文资源库| 国产熟女午夜一区二区三区| 大片免费播放器 马上看| 久久久久久人人人人人| 国产一区二区激情短视频 | 天堂8中文在线网| 最近2019中文字幕mv第一页| 99热这里只有是精品在线观看| 久久久精品区二区三区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 午夜91福利影院| 99久久精品国产国产毛片| 欧美人与性动交α欧美软件 | 十八禁高潮呻吟视频| 久热这里只有精品99| 五月开心婷婷网| 国产成人精品无人区| 国产极品天堂在线| 久久久亚洲精品成人影院| 成年美女黄网站色视频大全免费| 美女大奶头黄色视频| 香蕉国产在线看| 国产麻豆69| xxx大片免费视频| 9色porny在线观看| 国产1区2区3区精品| 亚洲欧美清纯卡通| 在线免费观看不下载黄p国产| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产成人精品福利久久| 国产成人免费观看mmmm| 高清欧美精品videossex| 国产色爽女视频免费观看| 99国产综合亚洲精品| 亚洲国产精品专区欧美| 在现免费观看毛片| 丝瓜视频免费看黄片| 免费黄频网站在线观看国产| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久久a久久爽久久v久久| 欧美变态另类bdsm刘玥| 大香蕉久久网| 国产免费福利视频在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久久精品94久久精品| 国产av国产精品国产| 99久久精品国产国产毛片| 女性被躁到高潮视频| 女性被躁到高潮视频| 超碰97精品在线观看| 老女人水多毛片| 国产毛片在线视频| 九九在线视频观看精品| 午夜日本视频在线| 日本wwww免费看| 久久久久视频综合| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 高清不卡的av网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| 婷婷成人精品国产| 成年女人在线观看亚洲视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| av电影中文网址| 自线自在国产av| 乱人伦中国视频| 十八禁网站网址无遮挡| 一级,二级,三级黄色视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久韩国三级中文字幕| 最近的中文字幕免费完整| 一级爰片在线观看| 波野结衣二区三区在线| 欧美日韩成人在线一区二区| 精品一区在线观看国产| 黄色视频在线播放观看不卡| 午夜精品国产一区二区电影| 久久毛片免费看一区二区三区| 大香蕉久久网| av网站免费在线观看视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 高清av免费在线| 大片免费播放器 马上看| a级毛色黄片| 美女中出高潮动态图| 国产成人精品在线电影| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲国产av影院在线观看| 97在线视频观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 超碰97精品在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 99精国产麻豆久久婷婷| 香蕉国产在线看| 亚洲内射少妇av| 久久人人爽人人片av| 国产成人一区二区在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 最后的刺客免费高清国语| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲天堂av无毛| 好男人视频免费观看在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日本av免费视频播放| 亚洲高清免费不卡视频| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲av男天堂| 久久99热6这里只有精品| 久久久久国产网址| 少妇的逼好多水| 性色av一级| 国产一区二区激情短视频 | 日本av手机在线免费观看| 丝瓜视频免费看黄片| 在线看a的网站| 国产高清国产精品国产三级| 久久久国产欧美日韩av| 大香蕉久久成人网| av电影中文网址| 日韩欧美一区视频在线观看| 精品国产一区二区久久| 亚洲精品第二区| 日本黄色日本黄色录像| 少妇的丰满在线观看| 99热6这里只有精品| 国产在线免费精品| www.熟女人妻精品国产 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲国产色片| 黄色配什么色好看| 国产成人精品无人区| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲国产成人一精品久久久| 成人毛片60女人毛片免费| 青青草视频在线视频观看| 亚洲少妇的诱惑av| 街头女战士在线观看网站| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩成人伦理影院| 国产成人精品婷婷| 国产一级毛片在线| 一级片免费观看大全| 天美传媒精品一区二区| 精品国产一区二区三区四区第35| 人人妻人人澡人人看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲成色77777| 国产激情久久老熟女| 蜜桃国产av成人99| 精品人妻偷拍中文字幕| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 大香蕉久久成人网| 精品一区二区三区视频在线| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产高清国产精品国产三级| 极品少妇高潮喷水抽搐| 成人黄色视频免费在线看| 高清欧美精品videossex| 日韩成人伦理影院| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产av精品麻豆| 97在线视频观看| 自线自在国产av| 男的添女的下面高潮视频| 国产av国产精品国产| 美女中出高潮动态图| 最黄视频免费看| 亚洲精品日本国产第一区| 国产一区二区三区综合在线观看 | 精品人妻在线不人妻| av网站免费在线观看视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 高清毛片免费看| 国产精品一区二区在线观看99| 成人国产麻豆网| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产男女超爽视频在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 欧美精品国产亚洲| 亚洲美女搞黄在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲中文av在线| 一边亲一边摸免费视频| av黄色大香蕉| 观看av在线不卡| www日本在线高清视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美 日韩 精品 国产| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久青草综合色| 在线观看免费视频网站a站| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 99视频精品全部免费 在线| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美精品高潮呻吟av久久| 成人黄色视频免费在线看| 精品一区二区三区视频在线| 色5月婷婷丁香| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久久久久久久久成人| 久久免费观看电影| 成人国产av品久久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久精品国产自在天天线| 久久综合国产亚洲精品| 黄色 视频免费看| 国产一区二区激情短视频 | 精品熟女少妇av免费看| 亚洲精品乱久久久久久| av女优亚洲男人天堂| 国产淫语在线视频| 久久久亚洲精品成人影院| 9色porny在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 国产一区二区激情短视频 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 另类亚洲欧美激情| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品一区www在线观看| 在线天堂中文资源库| 国产男人的电影天堂91| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 丝袜美足系列| av有码第一页| 国精品久久久久久国模美| 另类亚洲欧美激情| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久精品国产a三级三级三级| 久久99精品国语久久久| www日本在线高清视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久 成人 亚洲| 97超碰精品成人国产| 五月玫瑰六月丁香| 国产高清三级在线| 亚洲伊人久久精品综合| 乱人伦中国视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲精品自拍成人| 欧美日韩av久久| 国产av码专区亚洲av| 久久青草综合色| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 97在线视频观看| 亚洲图色成人| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美3d第一页| 免费大片黄手机在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 制服诱惑二区| av卡一久久| 高清在线视频一区二区三区| 日本黄大片高清| 少妇人妻久久综合中文| av.在线天堂| 母亲3免费完整高清在线观看 | 亚洲av电影在线进入| 亚洲综合色惰| 五月天丁香电影| a级片在线免费高清观看视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 午夜激情av网站| 亚洲国产av影院在线观看| 久久久久精品性色| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 日韩三级伦理在线观看| 秋霞在线观看毛片| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲综合色惰| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 中文字幕人妻丝袜制服| 在线观看国产h片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 在线免费观看不下载黄p国产| 黄色配什么色好看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲成人av在线免费| 久久久精品94久久精品| 国产精品久久久久久精品古装| 免费av不卡在线播放| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 三上悠亚av全集在线观看| 美女大奶头黄色视频| 9191精品国产免费久久| 久久亚洲国产成人精品v| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 一二三四在线观看免费中文在 | 人妻一区二区av| 人人妻人人澡人人看| 热99国产精品久久久久久7| 中国美白少妇内射xxxbb| 日本与韩国留学比较| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲国产日韩一区二区| 黑人高潮一二区| 久久99热6这里只有精品| 免费观看av网站的网址| 一级a做视频免费观看| 最近的中文字幕免费完整| 国产成人精品久久久久久| 成人影院久久| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | av卡一久久| 考比视频在线观看| 日韩中字成人| www日本在线高清视频| 亚洲中文av在线| 国国产精品蜜臀av免费| 人妻系列 视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 新久久久久国产一级毛片| 国产黄频视频在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 成人手机av| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲少妇的诱惑av| 观看av在线不卡| 一级黄片播放器| 国产成人精品福利久久| 成人国语在线视频| av女优亚洲男人天堂| 免费高清在线观看日韩| 国产麻豆69| 丝袜脚勾引网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产精品人妻久久久影院| 久久人人爽人人片av| 精品福利永久在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 18禁国产床啪视频网站| 国产极品天堂在线| 欧美人与性动交α欧美软件 | 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲天堂av无毛| 亚洲精品av麻豆狂野| 内地一区二区视频在线| 交换朋友夫妻互换小说| 高清不卡的av网站| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲国产av影院在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 多毛熟女@视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品偷伦视频观看了| 成年人午夜在线观看视频| www.av在线官网国产| 丰满迷人的少妇在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产高清国产精品国产三级| 97在线人人人人妻| 国产 一区精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产免费福利视频在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 日韩视频在线欧美| 国产麻豆69| 婷婷成人精品国产| 久久99精品国语久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲内射少妇av| 在线观看人妻少妇| 国产麻豆69| 欧美丝袜亚洲另类| 成人毛片a级毛片在线播放| 午夜老司机福利剧场| 秋霞伦理黄片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲成人av在线免费| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲精品一二三| 亚洲成国产人片在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 精品国产国语对白av| 97超碰精品成人国产| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲av免费高清在线观看| av有码第一页| 免费观看无遮挡的男女| 91精品三级在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 丁香六月天网| 欧美bdsm另类| 三级国产精品片| 久久免费观看电影| 9热在线视频观看99| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 熟女av电影| 一级片'在线观看视频| tube8黄色片| 99热网站在线观看| 日韩一区二区三区影片| 亚洲欧美精品自产自拍| videossex国产| 99国产精品免费福利视频| 国产精品免费大片| 涩涩av久久男人的天堂| 国产麻豆69| 欧美日韩av久久| 九九在线视频观看精品| 国产成人a∨麻豆精品| 黄色配什么色好看| 国产综合精华液| 亚洲,欧美,日韩| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日韩电影二区| 精品久久蜜臀av无| av线在线观看网站| 国产精品无大码| 久久99热6这里只有精品| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 女性被躁到高潮视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久久a久久爽久久v久久| 欧美精品一区二区免费开放| 国产片特级美女逼逼视频| 全区人妻精品视频| 精品国产国语对白av| videosex国产| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 久久久久久久精品精品| 精品人妻在线不人妻| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 香蕉精品网在线| 久久99精品国语久久久| 国产成人aa在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲av电影在线进入| 精品少妇内射三级| 日本黄色日本黄色录像| 人人澡人人妻人| 宅男免费午夜| 中文字幕最新亚洲高清| 国产精品国产av在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| tube8黄色片| 黑人高潮一二区| 国产高清三级在线| 亚洲av男天堂| 极品少妇高潮喷水抽搐| 色婷婷av一区二区三区视频| av线在线观看网站| 人人妻人人澡人人看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 成人黄色视频免费在线看| 热re99久久精品国产66热6| 欧美精品一区二区免费开放| 天堂俺去俺来也www色官网| 成人手机av| 婷婷色av中文字幕| 免费观看a级毛片全部| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 五月伊人婷婷丁香| 国产69精品久久久久777片| 在线观看免费日韩欧美大片| 在线观看www视频免费| 国产精品国产三级专区第一集| 99热全是精品| 日本与韩国留学比较| 亚洲成人一二三区av| 91国产中文字幕| 热re99久久精品国产66热6| 国产黄频视频在线观看| 妹子高潮喷水视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 麻豆乱淫一区二区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 麻豆乱淫一区二区| 大香蕉久久成人网| 妹子高潮喷水视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产成人欧美| 制服诱惑二区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 制服诱惑二区| 18禁动态无遮挡网站| 国产国语露脸激情在线看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美bdsm另类| 成年av动漫网址| 久久久久久伊人网av| 国产高清三级在线| 一级片'在线观看视频| 午夜福利乱码中文字幕| 丰满乱子伦码专区| 国产精品国产av在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 免费在线观看完整版高清| 日韩成人av中文字幕在线观看| 色5月婷婷丁香| 黄色怎么调成土黄色| 精品酒店卫生间| 在线观看免费高清a一片| 免费av不卡在线播放| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产免费现黄频在线看| 人妻人人澡人人爽人人| 天堂中文最新版在线下载| 丝袜脚勾引网站| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 99热网站在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 大码成人一级视频| 久久狼人影院| 国产精品一区二区在线不卡| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲四区av| 日韩一本色道免费dvd| 天堂俺去俺来也www色官网| 成人黄色视频免费在线看| 久久人人97超碰香蕉20202| 一级毛片 在线播放| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 午夜福利视频在线观看免费| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久毛片免费看一区二区三区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 大香蕉久久网| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产精品99久久99久久久不卡 | 少妇精品久久久久久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 人妻 亚洲 视频| 亚洲国产精品一区三区| 黄色一级大片看看| 婷婷色综合www| 亚洲一区二区三区欧美精品| 在线观看www视频免费| 亚洲欧洲国产日韩| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久人人爽人人爽人人片va| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久99热这里只频精品6学生| av有码第一页| 春色校园在线视频观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 国产高清三级在线| 激情五月婷婷亚洲| 黄色配什么色好看| 亚洲国产最新在线播放| 一级片免费观看大全| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲综合色惰| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 飞空精品影院首页| 桃花免费在线播放| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 九九爱精品视频在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久久久久久久久人人人人人人|