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    分子動(dòng)力學(xué)模擬超高壓結(jié)合熱處理對(duì)β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)的影響

    2022-01-06 02:31:30簡清梅索化夷張喜才茍興能黃業(yè)傳
    食品科學(xué) 2021年23期
    關(guān)鍵詞:氫鍵表面積熱處理

    簡清梅,索化夷,張喜才,茍興能,黃業(yè)傳,*

    (1.荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院,湖北 荊門 448000;2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;3.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 綿陽 621010)

    牛乳營養(yǎng)豐富,是深受人們喜愛的一種食物。乳制品的殺菌現(xiàn)仍以巴氏殺菌等熱處理為主,但加熱或多或少會(huì)降低產(chǎn)品的品質(zhì)。隨著人們對(duì)高質(zhì)量食品的需求不斷增加,希望在保證食品安全的情況下盡量減少營養(yǎng)損失。由此一些非熱殺菌技術(shù),如超高壓在食品中的應(yīng)用越來越受到重視,其在具有良好殺菌效果的同時(shí)使食物中小分子營養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì)得以較好保存,超高壓用以牛奶殺菌也有很多研究[1-2]。食物中的一些耐壓細(xì)菌在高達(dá)1 000 MPa的壓力下仍能存活,因此現(xiàn)在超高壓在食品殺菌的應(yīng)用主要是壓力結(jié)合一定的溫度進(jìn)行處理,一般溫度不超過60 ℃[3-4]。高壓結(jié)合熱處理會(huì)對(duì)大分子的食品蛋白質(zhì)造成影響,一些學(xué)者就高壓熱處理結(jié)合對(duì)蛋白理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、蛋白氧化[5-6],及對(duì)酶活性的影響[7-8]等進(jìn)行了研究。

    高壓處理不可避免會(huì)影響牛乳中蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),進(jìn)而影響產(chǎn)品品質(zhì)。一些學(xué)者研究了超高壓處理對(duì)牛乳中蛋白的影響,如Bogahawaththa等研究表明高壓能使乳清蛋白,特別是β-乳球蛋白和免疫球蛋白G變性,還會(huì)破壞酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu),600 MPa以上處理時(shí)通過巰基二硫化物的形成引起乳蛋白聚集[9];Considine等也發(fā)現(xiàn)超高壓下β-乳球蛋白的變性或聚集主要是蛋白中二硫鍵重排引起的[10];Russo等發(fā)現(xiàn)壓力較低時(shí)β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定,而3 000 bar(即300 MPa)以上的壓力會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)逐漸展開變性[11]。但這些研究仍以常規(guī)的實(shí)驗(yàn)分析方法為主,如光譜技術(shù)、波譜技術(shù)、量熱技術(shù)等,因此仍不清楚超高壓處理過程中乳蛋白結(jié)構(gòu)在微觀層面的變化。分子動(dòng)力學(xué)模擬現(xiàn)已成為研究蛋白結(jié)構(gòu)的一種有效方式,成為繼實(shí)驗(yàn)和理論手段后從分子水平了解和認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)世界的第三種手段,是一種具有足夠小的時(shí)間尺度和空間尺度的強(qiáng)大模擬技術(shù)[12]。分子動(dòng)力學(xué)用于研究牛乳蛋白的報(bào)道較多,主要是牛乳中的β-乳球蛋白與一些小分子結(jié)合的動(dòng)力學(xué)模擬,如柑橘黃酮[13]、辣椒素[14]、姜黃素[15]、茶多酚[16]、蘆丁[17]等。就處理方式而言,關(guān)于熱處理對(duì)蛋白影響的分子模擬較多,如一些學(xué)者研究了加熱條件下乳蛋白結(jié)構(gòu)變化的分子動(dòng)力學(xué)過程[18-21];而模擬超高壓對(duì)蛋白影響的研究較少,如Kurpiewska等模擬了胰島素在高壓下的結(jié)構(gòu)變化[22],陳剛模擬了脂肪酶在高壓下的結(jié)構(gòu)變化[12],分子動(dòng)力學(xué)用于模擬牛乳蛋白在超高壓處理下的變化更是鮮有報(bào)道。

    β-乳球蛋白是乳清中含量最為豐富的一種蛋白質(zhì),由于其良好的功能和營養(yǎng)特性,因此在食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用。β-乳球蛋白每個(gè)單體含有162個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為18.4 kDa,是由8 條反向平行的β-折疊構(gòu)成的桶狀結(jié)構(gòu),外側(cè)含有α-螺旋結(jié)構(gòu)[23]。600 MPa被認(rèn)為是能夠殺滅牛乳中絕大多數(shù)微生物的安全壓力[2],因此本研究以β-乳球蛋白為研究對(duì)象,從分子動(dòng)力學(xué)角度探討300、600 MPa的壓力結(jié)合300、330 K的溫度對(duì)蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響,并與通常意義上比較劇烈的加熱溫度100 ℃(373.15 K)的熱處理進(jìn)行對(duì)比,以更深入地了解高壓條件下β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)在微觀層面的變化。因分子動(dòng)力學(xué)模擬得到的數(shù)據(jù)較多,為更好地反映蛋白分子結(jié)構(gòu)的變化,采用方差分析-偏最小二乘回歸分析(analysis of variance-partial least squares regression,APLSR)法探討溫度和壓力對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響規(guī)律。

    1 材料與方法

    1.1 分子動(dòng)力學(xué)模擬

    本研究中分子動(dòng)力學(xué)模擬參考文獻(xiàn)[12-14,18],采用Gromacs(2019.6)軟件[24],β-乳球蛋白從RCSB PDB網(wǎng)站(www.rcsb.org)下載(ID號(hào):3npo),下載后用PyMOL軟件手動(dòng)除去結(jié)晶水。模擬過程中選用GROMOS54a7力場[25],將蛋白放入立方體水盒子中,水模型采用簡單點(diǎn)電荷(simple point charge,SPC)模型,使蛋白離盒子邊緣最短距離為1 nm,添加Na+使體系達(dá)到電中性,使用最速下降法對(duì)體系進(jìn)行能量最小化[26]。然后在NVT和NPT系綜下分別進(jìn)行400 ps的平衡,平衡后溫度為300 K,壓力達(dá)到預(yù)先設(shè)定的壓力值(0.1、300、600 MPa)。最后在設(shè)定的壓力和溫度下進(jìn)行150 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬,使用LINCS(linear constraint solver)算法約束所有鍵,使用PME(particle-mesh-Ewald)方法計(jì)算靜電作用,范德華相互作用使用截?cái)喟霃綖?.4 nm進(jìn)行計(jì)算。選用Parrinello-Rahman壓浴方式、Isotropic控壓方式、V-rescale控溫方式。需要升溫時(shí),溫度從300 K以10 K/ns的速度升至目標(biāo)溫度(300、330、373.15 K),然后一直保持在目標(biāo)溫度下。模擬步長為2 fs,每10 ps儲(chǔ)存1 次數(shù)據(jù),每個(gè)處理平行模擬2 次。

    模擬結(jié)束后,去除周期性邊界條件,然后使用Gromacs軟件相應(yīng)的分析命令分析不同處理?xiàng)l件下蛋白結(jié)構(gòu)的均方根誤差(root mean square deviation,RMSD)、均方根波動(dòng)(root mean square fluctuation,RMSF)、回旋半徑、二級(jí)結(jié)構(gòu)、溶劑可及表面積、蛋白體積和氫鍵數(shù)量的變化。其中RMSD、回旋半徑、蛋白體積均是提取全部150 ns的數(shù)據(jù),每0.1 ns提取1 次,共1 500個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn),以分析整個(gè)模擬過程中蛋白的結(jié)構(gòu)變化情況;而蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、氫鍵數(shù)量、溶劑可及表面積、RMSF只分析蛋白穩(wěn)定后的數(shù)據(jù),即100 ns到150 ns的數(shù)據(jù),共500個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。

    1.2 APLSR分析

    以7個(gè)0/1樣品變量(0.1 MPa-300 K、0.1 MPa-330 K、300 MPa-300 K、300 MPa-330 K、600 MPa-300 K、600 MPa-330 K、100 ℃(0.1 MPa-373.15 K))作為X變量,13個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)信息指標(biāo)作為Y變量作PLS2分析。13個(gè)指標(biāo)分別為RMSD、RMSF、回旋半徑、蛋白體積、總?cè)軇┛杉氨砻娣e、親水表面積、疏水表面積、氫鍵數(shù)量、α-螺旋數(shù)量、β-折疊數(shù)量、無規(guī)卷曲數(shù)量、轉(zhuǎn)角數(shù)量、彎曲數(shù)量,分別取100~150 ns共500個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值,即每0.1 ns提取1 次數(shù)據(jù)。

    為了更直觀地顯示壓力與溫度聯(lián)合作用對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響,將100 ℃樣品去掉后,以主要設(shè)計(jì)變量(溫度:300、330 K;壓力:0.1、300、600 MPa)和6個(gè)0/1樣品變量作為X變量,上述13個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)指標(biāo)為Y變量,進(jìn)一步做PLS2分析。

    APLSR分析采用Unscrambler V 9.7軟件,所有數(shù)據(jù)在分析前均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,分子模擬結(jié)果采用Origin 8.0軟件繪圖,APLSR分析的關(guān)系圖采用Unscrambler軟件繪制,采用SPSS軟件中的Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 高壓結(jié)合熱處理對(duì)β-乳球蛋白R(shí)MSD的影響

    RMSD是衡量特定時(shí)間蛋白結(jié)構(gòu)與原始構(gòu)象的平均偏差,是評(píng)價(jià)模擬體系是否穩(wěn)定的重要指標(biāo)。由圖1可知,100 ℃的體系在100 ns后才達(dá)到平衡,而其他體系均是在75 ns以內(nèi)達(dá)到平衡。從平衡以后RMSD的具體值來看,100 ℃加熱的體系RMSD遠(yuǎn)大于其他體系,100 ns后的平均值為0.45 nm,而其他的處理組RMSD均小于0.33 nm,說明100 ℃加熱對(duì)β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)破壞遠(yuǎn)大于300、600 MP的壓力結(jié)合330 K的熱處理。從300 K下不同壓力來看,0.1 MPa時(shí)的RMSD最低,300、600 MP時(shí)RMSD相當(dāng),后者略高于前者,這說明壓力的增大能增加蛋白的不穩(wěn)定性;陳剛報(bào)道脂肪酶在常溫下200、400、600 MPa處理時(shí)相對(duì)0.1 MPa時(shí)RMSD均有所增加[12],與本研究結(jié)論類似。330 K條件下樣品的RMSD總體上明顯高于300 K時(shí),說明溫度對(duì)RMSD的影響顯著。從3個(gè)壓力結(jié)合330 K的結(jié)果來看,RMSD最大的是單獨(dú)330 K加熱的體系(0.33 nm),其略高于600 MPa-330 K(0.30 nm),遠(yuǎn)大于300 MPa-330 K處理的體系(0.21 nm)。這說明壓力和加熱處理對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的去穩(wěn)定機(jī)制可能相反,即單獨(dú)的壓力或加熱都會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,但一定的壓力處理可以穩(wěn)定由加熱導(dǎo)致的蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。鮮有關(guān)于高壓結(jié)合熱處理對(duì)蛋白R(shí)MSD影響的報(bào)道,Borgohain等報(bào)道了尿素可引起蛋白變性,但其對(duì)高壓變性有部分抵消作用[27],Angsupanich等報(bào)道了壓力和溫度影響魚蛋白結(jié)構(gòu)的機(jī)理不同[28]。

    圖1 不同處理?xiàng)l件對(duì)β-乳球蛋白R(shí)MSD的影響Fig. 1 Effect of different treatments on the RMSD of β-lactoglobulin

    2.2 高壓結(jié)合熱處理對(duì)β-乳球蛋白回旋半徑的影響

    不同處理?xiàng)l件下蛋白回旋半徑的變化如圖2所示,回旋半徑越小表明蛋白結(jié)構(gòu)越致密,反之則越膨脹。由圖2可知,各體系回旋半徑相差不大,相對(duì)而言,100 ℃的樣品和常壓下處理的2個(gè)樣品回旋半徑較大,且只有100 ℃的體系后期回旋半徑增加,而其他體系都是隨時(shí)間的延長有所減少,說明100 ℃加熱時(shí)蛋白會(huì)膨脹,而其他處理過程中蛋白或多或少都會(huì)變得更加致密。Sahihi等模擬柑橘黃酮與β-乳球蛋白間的結(jié)合時(shí)報(bào)道的回旋半徑比本研究的稍低,約1.40~1.45 nm,但Sahihi等是在常溫常壓下進(jìn)行模擬[13],與本研究的模擬條件不同。

    圖2 不同處理?xiàng)l件對(duì)β-乳球蛋白回旋半徑的影響Fig. 2 Effect of different treatments on the radius of gyration of β-lactoglobulin

    2.3 高壓結(jié)合熱處理對(duì)β-乳球蛋白R(shí)MSF的影響

    相比于平均構(gòu)象,RMSF是蛋白中每一個(gè)氨基酸殘基的均方根位移,反映殘基的波動(dòng)情況。加熱樣品在100 ns后結(jié)構(gòu)才比較穩(wěn)定,因此計(jì)算RMSF時(shí)均提取100~150 ns的蛋白結(jié)構(gòu)。由圖3可以看出,氨基酸殘基波動(dòng)較大的處理有100 ℃、常壓下330 K加熱、600 MPa-330 K樣品,這與RMSD和回旋半徑的分析結(jié)果基本一致。RMSF較大的一些殘基主要有77號(hào)賴氨酸、51號(hào)谷氨酸、63號(hào)天冬酰胺、8號(hào)賴氨酸、87號(hào)亮氨酸、112號(hào)谷氨酸、1號(hào)亮氨酸、162號(hào)異亮氨酸、159號(hào)谷氨酰胺、114號(hào)谷氨酸等,說明這些殘基在高壓處理過程中柔性較大,是導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的主要氨基酸。這與劉祥雨等報(bào)道的結(jié)果基本一致,他們在模擬β-乳球蛋白加熱過程中,發(fā)現(xiàn)35、51、87號(hào)位氨基酸波動(dòng)較大[18]。

    圖3 不同處理?xiàng)l件對(duì)β-乳球蛋白R(shí)MSF的影響Fig. 3 Effect of different treatments on the RMSF of β-lactoglobulin

    2.4 高壓結(jié)合熱處理對(duì)β-乳球蛋白氫鍵數(shù)量的影響

    氫鍵是穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的一種重要的非共價(jià)結(jié)構(gòu)力,由圖4可知,加熱或加壓處理均可減少蛋白的氫鍵數(shù)量,300 MPa處理組比常壓處理組平均少了2個(gè)氫鍵,600 MPa處理組比300 MPa處理組平均少了3個(gè)氫鍵;330 K處理組比300 K處理組的樣品平均少了1個(gè)氫鍵,而100 ℃加熱處理組氫鍵在330 K處理組的基礎(chǔ)上氫鍵數(shù)量又平均減少了4個(gè)左右。氫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要作用力之一,因此氫鍵數(shù)量的減少會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。劉祥雨等的模擬研究表明100 ℃及以下的溫度對(duì)β-乳球蛋白的氫鍵數(shù)量影響不大,而120 ℃的加熱才會(huì)顯著減少蛋白的氫鍵數(shù)量[18],這與本研究得到的結(jié)果有所差異。

    圖4 不同處理?xiàng)l件對(duì)β-乳球蛋白氫鍵數(shù)量的影響Fig. 4 Effect of different treatments on the number of hydrogen bonds in β-lactoglobulin

    2.5 高壓結(jié)合熱處理對(duì)β-乳球蛋白體積的影響

    各處理對(duì)蛋白體積的影響如圖5所示,加熱處理可以增加蛋白體積,溫度越高增加幅度越大;而壓力增加則減小蛋白體積,壓力越大則蛋白體積減小幅度也越大。因此加熱和加壓對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響是不同的,加熱使蛋白膨脹,而加壓使蛋白收縮從而變得更加致密。這些結(jié)果與前面回旋半徑的結(jié)果一致。Kurpiewska等報(bào)道了胰島素在100 MPa下體積減小1.4%[22]。根據(jù)Le Chatelier原理,高壓下蛋白朝著體積減小的方向進(jìn)行,主要是高壓下水分子進(jìn)入疏水腔使疏水腔變形進(jìn)而體積減小[29]。

    圖5 不同處理?xiàng)l件對(duì)β-乳球蛋白體積的影響Fig. 5 Effect of different treatments on the volume of β-lactoglobulin

    2.6 高壓結(jié)合熱處理對(duì)β-乳球蛋白溶劑可及表面積的影響

    由表1可知,不同處理顯著影響蛋白的溶劑可及表面積。具體來看,100 ℃的加熱可顯著增加溶劑可及表面積,疏水表面積和親水表面積都顯著增加,這可能是該溫度下蛋白充分變性所致,這與劉祥雨等報(bào)道的結(jié)果[18]一致。而高壓結(jié)合300、330 K的處理相比常溫常壓組(0.1 MPa-300 K)則顯著降低了總?cè)軇┛杉氨砻娣e和疏水表面積,親水表面積除了0.1 MPa-330 K和300 MPa-300 K處理組外也顯著降低。300 MPa-300 K處理組總?cè)軇┛杉氨砻娣e及疏水表面積均降低最多,這可能與高壓下蛋白體積減小有關(guān),而處理?xiàng)l件更劇烈時(shí),如溫度增加或壓力繼續(xù)升高,可能導(dǎo)致部分蛋白變性聚集,使溶劑可及表面積反而有所增加。本研究中親水表面積始終大于疏水表面積,因此無論是在加熱還是高壓處理過程中,β-乳球蛋白總體上都是水溶性的。疏水表面積的減少可能是高壓下水分子滲透進(jìn)入蛋白分子內(nèi)部使更多的疏水區(qū)域暴露在極性水溶液中[30]。有關(guān)壓力作用下蛋白疏水性的變化有一些報(bào)道,但結(jié)果不一致,有的學(xué)者報(bào)道隨壓力的增加蛋白的疏水作用減弱[29,31],而另一些學(xué)者報(bào)道高壓下蛋白的疏水性增加[32-33]。但上述兩種報(bào)道是以表面疏水性為測定指標(biāo),采用實(shí)驗(yàn)手段得出的結(jié)論,而本研究測定的指標(biāo)為疏水表面積,是通過分子模擬得出的結(jié)論,兩者不能完全劃等號(hào)。

    表1 不同處理?xiàng)l件對(duì)β-乳球蛋白溶劑可及表面積的影響Table 1 Effect of different treatments on the solvent accessible surface area of β-lactoglobulin

    2.7 高壓結(jié)合熱處理對(duì)β-乳球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

    由表2可知,與常溫常壓(0.1 MPa-300 K)處理組相比,隨壓力增加或溫度的升高,蛋白的結(jié)構(gòu)也發(fā)生了明顯的變化,主要是α-螺旋和β-折疊數(shù)量減少而無規(guī)卷曲數(shù)量增加,其中100 ℃處理組樣品比所有壓力處理樣品變化更劇烈,這和前面的研究結(jié)果是一致的。劉祥雨等的模擬結(jié)果也表明加熱處理能顯著降低該蛋白的α-螺旋和β-折疊數(shù)量,而增加無規(guī)卷曲的數(shù)量[18];曹艷蕓也用實(shí)驗(yàn)手段測得加熱后蛋白的部分α-螺旋和β-折疊會(huì)向無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變[34]。與0.1 MPa-300 K組樣品相比,各組樣品中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化最顯著的為600 MPa-330 K處理組,其無規(guī)卷曲和β-折疊數(shù)量的變化尤為突出,而彎曲和轉(zhuǎn)角數(shù)量的變化相對(duì)較小且缺少規(guī)律性。因此,相對(duì)于100 ℃的高溫處理,高壓結(jié)合一定溫度的熱處理可以較好地穩(wěn)定蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),但600 MPa結(jié)合330 K的處理?xiàng)l件仍會(huì)使蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生較大的改變。邱春江研究表明肌原纖維蛋白在高壓下α-螺旋數(shù)量下降[32],α-螺旋對(duì)壓力比較敏感可能是高壓下蛋白的氫鍵受到一定程度破壞,因氫鍵對(duì)α-螺旋的穩(wěn)定至關(guān)重要[35];白雨鑫的研究表明500 MPa的壓力對(duì)β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響很小[33];Chen Gang等研究發(fā)現(xiàn)400 MPa的壓力處理能使大豆蛋白的α-螺旋數(shù)量減少而β-折疊數(shù)量增加[31],這些差異可能緣于蛋白不一樣或測定方法不一樣,他們大都采用實(shí)驗(yàn)手段測得??偟膩碚f,若將超高壓冷殺菌技術(shù)用于牛乳制品生產(chǎn)能更好地保持蛋白的結(jié)構(gòu)。

    表2 不同處理?xiàng)l件對(duì)β-乳球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of different treatments on the secondary structure of β-lactoglobulin

    2.8 APLSR分析的結(jié)果

    前面雖然分別描述了不同處理對(duì)β-乳球蛋白13個(gè)結(jié)構(gòu)指標(biāo)的影響,但還是不能直觀看出溫度、壓力對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)總的影響規(guī)律;再加上模擬時(shí)間為150 ns,1 ns提取10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn),因此分析前面分的指標(biāo)時(shí)均為500或1 500個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。為更好地了解高壓結(jié)合熱處理對(duì)β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)的影響,運(yùn)用偏最小二乘回歸分析的PLS2程序探究溫度和壓力對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響規(guī)律。

    APLSR分析結(jié)果如圖6所示,X軸代表7個(gè)0/1樣品變量,Y軸代表β-乳球蛋白13個(gè)結(jié)構(gòu)指標(biāo),第1、2主成分(principal component,PC)分別解釋了Y變量的58%和25%,大多數(shù)Y變量都位于r2=0.5(內(nèi)圓)和r2=1(外圓)之間,具有較好的解釋效果。可以看出100 ℃處理的樣品位于載荷圖的最右端,和其他樣品距離均較遠(yuǎn),說明其對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響不同于其他處理。具體來看,RMSD、RMSF、回旋半徑、總?cè)軇┛杉氨砻娣e、疏水表面積、親水表面積、蛋白體積等指標(biāo)均在其附近,說明加熱處理會(huì)增加這些指標(biāo),導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定;蛋白的α-螺旋、β-折疊、氫鍵數(shù)量等指標(biāo)位于載荷圖的左側(cè),說明高壓結(jié)合一定的熱處理相比100 ℃加熱處理能更好地維持蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和氫鍵。因100 ℃處理的樣品與其他樣品在蛋白結(jié)構(gòu)上差異較大,以至于不同壓力間樣品在載荷圖上差異不明顯。為更好地探究壓力結(jié)合熱處理對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響規(guī)律,將100 ℃處理的樣品去掉后,以6個(gè)0/1樣品變量和主要設(shè)計(jì)變量(壓力、溫度)為X軸,以蛋白結(jié)構(gòu)信息變量為Y軸,再次進(jìn)行APLSR分析,結(jié)果如圖7所示。

    圖6 7個(gè)0/1樣品變量與蛋白結(jié)構(gòu)信息的APLSR分析載荷圖Fig. 6 APLSR correlation loading plot of seven 0/1 indicator variables versus protein structural parameters

    圖7 6個(gè)0/1樣品變量與蛋白結(jié)構(gòu)信息的APLSR分析載荷圖Fig. 7 APLSR correlation loading plot of six 0/1 indicator variables versus protein structural parameters

    由圖7可知,PC1、PC2分別解釋了Y變量的51%和27%,13個(gè)Y變量基本都位于r2=0.5(內(nèi)圓)和r2=1(外圓)之間,因此能較好地反映不同處理樣品蛋白結(jié)構(gòu)上的差異。不同壓力處理樣品的差異主要反映在PC1,其中常壓處理組位于載荷圖最右端,高壓處理組在載荷圖左側(cè),300、600 MPa樣品的差異同時(shí)反映在PC2,前者位于載荷圖靠上位置,而后者在左下方。不同溫度處理樣品主要區(qū)別于PC2,其中300 K樣品位于上方,而330 K樣品位于下方。從Y變量來看,總?cè)軇┛杉氨砻娣e、疏水表面積、親水表面積、蛋白體積及回旋半徑均位于右側(cè),與0.1 MPa樣品距離很近,說明高壓處理會(huì)顯著減少蛋白的溶劑可及表面積和體積,并使蛋白的結(jié)構(gòu)更加致密,這與前面的分析結(jié)果是一致的。氫鍵數(shù)量與常溫常壓樣品(0.1 MPa-300 K)重疊在一起,說明不管是加熱還是加壓處理都會(huì)一定程度上破壞蛋白間氫鍵,從而影響蛋白的穩(wěn)定性。α-螺旋數(shù)量和RMSD兩個(gè)指標(biāo)主要區(qū)別于PC2,說明受溫度影響較大,溫度升高時(shí),會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)波動(dòng)增加,并使α-螺旋數(shù)量明顯減少。另外,轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲、β-折疊數(shù)量和RMSF分別位于載荷圖的遠(yuǎn)離坐標(biāo)軸的4個(gè)不同象限,說明這4個(gè)指標(biāo)同時(shí)受溫度和壓力的影響,具體來看,溫度的升高和壓力的增加都會(huì)減少β-折疊數(shù)量,并相應(yīng)地增加無規(guī)卷曲數(shù)量,常壓和330 K條件下蛋白氨基酸殘基數(shù)量波動(dòng)最大,高壓和常溫條件下轉(zhuǎn)角數(shù)量最高。從圖7還可以看出,在330 K條件下,涉及蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的3個(gè)指標(biāo)RMSD、RMSF、回旋半徑均與常壓樣品距離較近(0.1 MPa-330 K),而與高壓處理樣品,特別是300 MPa樣品距離較遠(yuǎn)(300 MPa-330 K),說明300 MPa的壓力處理能減小由于加熱導(dǎo)致的蛋白結(jié)構(gòu)破壞,即一定的壓力處理可以保護(hù)熱處理導(dǎo)致的蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。

    3 結(jié) 論

    100 ℃加熱對(duì)β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)破壞遠(yuǎn)大于600 MPa結(jié)合330 K的處理,說明相比于完全的高溫,高壓結(jié)合一定溫度的聯(lián)合處理是一種較溫和的方式,蛋白的空間結(jié)構(gòu)保留相對(duì)完整。與常溫常壓處理相比,高壓處理會(huì)導(dǎo)致蛋白的溶劑可及表面積、蛋白體積減小,而使蛋白結(jié)構(gòu)更加致密;330 K的加熱處理會(huì)破壞蛋白結(jié)構(gòu),特別是使α-螺旋數(shù)量減少;壓力的升高和溫度的升高均能使蛋白間氫鍵、β-折疊數(shù)量減少,相應(yīng)的無規(guī)卷曲數(shù)量增加;而氨基酸殘基波動(dòng)則隨溫度升高而增加,隨壓力增加而減小。一定的壓力處理,特別是300 MPa能減緩熱處理(330 K)導(dǎo)致的蛋白結(jié)構(gòu)波動(dòng)。本研究從分子動(dòng)力學(xué)角度分析了高壓結(jié)合一定溫度的熱處理對(duì)β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)的影響,為進(jìn)一步了解高壓對(duì)食品蛋白的影響和促進(jìn)高壓技術(shù)在含蛋白食品中的應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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