毛木耳野生菌株Aa-019的鑒定與菌絲生長(zhǎng)條件優(yōu)化*

楊 杰，郭 尚，劉 虹，車(chē)星星，駢躍斌

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，山西 太原 030031）

木耳屬（Auricularia）真菌是我國(guó)分布較廣的木腐真菌，人們常見(jiàn)且較熟悉的物種有黑木耳（Auricularia auricula） 和毛木耳 （Auricularia cornea）[1]，該屬中多數(shù)種不但味美質(zhì)脆、營(yíng)養(yǎng)豐富，且在民間也常用作藥材使用[2-3]。開(kāi)展野生木耳菌株的搜集、鑒定以及生物學(xué)特性研究工作，不僅可為進(jìn)一步了解我國(guó)木耳屬真菌的系統(tǒng)發(fā)育情況提供參考，還可為黑木耳、毛木耳等可栽培木耳屬真菌的品種選育提供種質(zhì)材料[4]。

山西擁有豐富的野生木耳屬種質(zhì)資源，除黑Aa-015等少數(shù)品種被利用外[5-6]，其他有關(guān)山西木耳屬菌株搜集、馴化等方面的報(bào)道較少。通過(guò)鑒定山西太原地區(qū)所搜集木耳屬野生菌株Aa-019并優(yōu)化其菌絲生長(zhǎng)條件，旨在為該菌株的穩(wěn)定性栽培和商業(yè)化選育提供必要參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株Aa-019，原采自山西省太原市，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所分離、復(fù)壯和保存。

1.2 供試配方

子實(shí)體分離配方：PDA培養(yǎng)基46.0 g·L-1、蛋白胨 2.5 g·L-1、KH2PO41.0 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1[1]。

適宜碳源試驗(yàn)配方：供試碳源分別為葡萄糖、乳糖、蔗糖和甘露醇，濃度梯度設(shè)置均為10 g·L-1、20 g·L-1和 30 g·L-1，其他添加物質(zhì)為蛋白胨 3.0 g·L-1、KH2PO41.00 g·L-1、MgSO40.45 g·L-1和瓊脂 12.0 g·L-1[1]。

適宜氮源試驗(yàn)配方：供試氮源分別為蛋白胨（濃度梯度為1.0 g·L-1、3.0 g·L-1、5.0 g·L-1）、酵母浸出粉（濃度梯度為2.0 g·L-1、4.0 g·L-1、6.0 g·L-1）、尿素（濃度梯度為1.0 g·L-1、2.0 g·L-1、3.0 g·L-1）和 （NH4）2SO4（濃度梯度為 1.0 g·L-1、2.0 g·L-1和3.0 g·L-1），其他添加物質(zhì)還有葡萄糖20.0 g·L-1、KH2PO42.0 g·L-1、MgSO40.45 g·L-1和瓊脂 15.0 g·L-1[1]。

適宜pH篩選配方：以PDA為基礎(chǔ)配方，在倒平板前于超凈工作臺(tái)上用1.0 mol·L-1的NaOH溶液和 1.0 mol·L-1HCl溶液配成 pH分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的供試培養(yǎng)基[1]。

適宜溫度篩選配方為PDA配方。

1.3 菌株Aa-019的ITS鑒定

將供試菌株Aa-019接種于PDA培養(yǎng)皿上于26℃培養(yǎng)7 d，進(jìn)行菌株活化。將活化后的菌株Aa-019交于山西修同生物科技有限公司，委托其采用快速抽提試劑盒進(jìn)行DNA提取，ITS-PCR擴(kuò)增、測(cè)序和檢索，并用Neighbor Joining法構(gòu)建遺傳發(fā)育樹(shù)。

1.4 菌絲生長(zhǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)

1.4.1 碳源、氮源和pH優(yōu)化試驗(yàn)

選取活化后大小和生長(zhǎng)一致的供試菌種塊接種于供試碳源、氮源和pH培養(yǎng)基中，于25℃暗培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)至培養(yǎng)皿2/3時(shí)，采用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)定菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度，記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4.2 適宜生長(zhǎng)溫度篩選試驗(yàn)

將供試菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和 35℃條件下暗培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。菌絲生長(zhǎng)情況測(cè)定參見(jiàn)1.4.1。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析采用WPS和SAS 8.1完成，涉及多重比較的采用Duncan新復(fù)極差法[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Aa-019的鑒定結(jié)果

野生菌株Aa-019的形態(tài)特征見(jiàn)圖1。

通過(guò)圖1形態(tài)觀察，該菌株子實(shí)體無(wú)柄，膠質(zhì)，呈杯狀，有明顯髓層。正面光滑，顏色為紅棕色，背面顏色灰白，不光滑，與典型的木耳子實(shí)體特征相似，可初步鑒定為木耳屬菌株。通過(guò)在線Blast對(duì)比，發(fā)現(xiàn)菌株Aa-019與毛木耳（MH213359） 的序列相似度達(dá)97.75%，通過(guò)對(duì)菌株Aa-019和相似度較高的20個(gè)種的同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。

圖1 菌株Aa-019鮮子實(shí)體Fig.1 Fresh fruit body of strain Aa-019

圖2 菌株Aa-019的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogentic tree constructed by strain Aa-019

由圖2同樣發(fā)現(xiàn)與毛木耳（MG696594） 親緣關(guān)系最近。根據(jù)Landeweert[8]的理論，序列相似性≥99%為同一種，序列相似性<99%，且≤95%時(shí)為同屬不同種，序列相似性<95%時(shí)，該菌株則為同科不同屬。結(jié)合吳芳等[9]對(duì)木耳屬各種拉丁名的修訂結(jié)論，菌株Aa-019與毛木耳種高度同源，但又存在于獨(dú)立分支上，所以菌株Aa-019（MN294455） 為尚未報(bào)道的毛木耳（Auricularia cornea） 菌株。

2.2 不同碳源對(duì)菌株Aa-019菌絲生長(zhǎng)的影響

不同碳源對(duì)菌株Aa-019菌絲生長(zhǎng)的影響情況見(jiàn)表1。

表1 不同碳源對(duì)菌株Aa-019菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.1 Effect of different carbon source on mycelial growth of strain Aa-019

由表1可知，不同碳源條件下，菌株Aa-019的菌絲長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速度存在差異。以乳糖為碳源時(shí)，菌絲顏色雪白，菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好，但菌絲生長(zhǎng)速度慢。以甘露醇為碳源的菌絲生長(zhǎng)速度最快，且甘露醇添加量為20.0 g·L-1時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度達(dá)6.54 mm·d-1，與其他處理具有顯著差異。隨著葡萄糖添加量的增加，菌株Aa-019的菌絲生長(zhǎng)速度逐漸降低；隨著蔗糖添加量的增加，菌絲生長(zhǎng)速度變化不大。

2.3 不同氮源對(duì)菌株Aa-019菌絲生長(zhǎng)的影響

不同氮源對(duì)菌株Aa-019菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。

由表2可知，菌株Aa-019對(duì)氮源的利用程度不同。以酵母粉為氮源時(shí)，明顯優(yōu)于其他氮源處理，但菌絲生長(zhǎng)速度隨酵母粉添加量的增大差異不明顯，以蛋白胨和硫酸銨為氮源時(shí)也存在類(lèi)似的現(xiàn)象。結(jié)合菌絲長(zhǎng)勢(shì)、菌絲色澤等指標(biāo)，菌株Aa-019的最適氮源為酵母粉6.0 g·L-1，菌絲生長(zhǎng)速度可以達(dá)4.87 mm·d-1，其次是蛋白胨和硫酸銨，低濃度的尿素也可以被菌株Aa-019吸收，隨著尿素添加量的增加，菌絲生長(zhǎng)速度明顯降低，這與黃藝寧等[10]的結(jié)論相似。

表2 不同氮源對(duì)菌株Aa-019菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effect of different nitrogen source on mycelial growth of strain Aa-019

2.4 不同溫度對(duì)菌株Aa-019菌絲生長(zhǎng)的影響

不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株Aa-019菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同溫度對(duì)菌株Aa-019菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.3 Effect of different temperature on mycelial growth rate of strain Aa-019

由圖3可知，溫度是影響食用菌生長(zhǎng)發(fā)育最重要的因素[11]，菌株Aa-019的菌絲生長(zhǎng)速度隨著溫度的變化而不同。在5℃條件下，菌株Aa-019菌絲幾乎不生長(zhǎng)，在15℃以下，其菌絲生長(zhǎng)較為緩慢，20℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，后隨著溫度的升高，菌絲生長(zhǎng)速度減緩，在30℃～35℃時(shí)，菌株Aa-019雖能夠生長(zhǎng)，但出現(xiàn)了菌絲稀疏、菌落不完整等現(xiàn)象。

2.5 不同pH對(duì)菌株Aa-019菌絲生長(zhǎng)的影響

不同pH對(duì)菌株Aa-019菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同pH對(duì)菌株Aa-019菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.4 Effect of different pH on mycelial growth rate of strain Aa-019

由圖4可知，該菌株在pH為4.0～9.0時(shí)都能生長(zhǎng)，pH＜3.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)緩慢或無(wú)明顯生長(zhǎng)。通過(guò)趨勢(shì)線可得出趨勢(shì)線方程為：

該趨勢(shì)方程R2為0.882 1。

菌株Aa-019的適宜pH為5.0～7.0，最佳pH為6.7，即該菌株的理想培養(yǎng)環(huán)境為弱酸性。

3 討論與結(jié)論

長(zhǎng)期以來(lái)，毛木耳的命名存在同物異名的現(xiàn)象[12]，原來(lái)毛木耳被命名為A.polytricha[13]，后經(jīng)過(guò)多人研究后認(rèn)為我國(guó)的毛木耳也存在類(lèi)似情況，根據(jù)形態(tài)特征和ITS分析，將其學(xué)名修訂為A.cornea[14]，通過(guò)Blast對(duì)比結(jié)果可知菌株Aa-019為毛木耳。

葡萄糖為單糖，是小分子碳源，是大部分食用菌的培養(yǎng)基首選碳源，但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，甘露醇能更好的被毛木耳菌株吸收，與王謙等[15]研究結(jié)果不同，這可能是由于不同毛木耳菌株的特性造成。在氮源的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，該菌株不僅可以利用酵母粉、蛋白胨等大分子氮源，而且也可利用硫酸銨等小分子氮源。

在適宜生長(zhǎng)溫度的篩選和適宜pH的篩選中，發(fā)現(xiàn)該菌株的最適溫度為20℃，與大多數(shù)毛木耳菌株適宜溫度在25℃的情況是存在差異。多數(shù)毛木耳菌株的最適pH為4.0～7.0，而該菌株卻在pH為9.0時(shí)還可以生長(zhǎng)，表現(xiàn)出了一定的耐堿性。

通過(guò)對(duì)野生菌株Aa-019形態(tài)鑒定法和ITS分析，鑒定野生菌株Aa-019為毛木耳；通過(guò)進(jìn)行野生菌株Aa-019菌絲生長(zhǎng)的碳源、氮源、最適溫度以及適宜pH等的篩選試驗(yàn)，其菌絲生長(zhǎng)的最佳溫度條件為20℃，黑木耳Aa-019菌絲在含有甘露醇20.0 g·L-1和酵母粉6.0 g·L-1，且pH為6.7的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快。