血管生成相關(guān)生物標(biāo)志物與非小細(xì)胞肺癌PD-1免疫治療療效的相關(guān)性分析

文彩虹 馮曉慶

(1. 三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 腫瘤科， 湖北 宜昌 443003; 2. 三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 口腔科， 湖北 宜昌 443003)

近年來免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICI)的應(yīng)用改變了晚期腫瘤的治療模式，部分晚期腫瘤患者生存顯著獲益[1-2]。PD-1免疫治療在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益增加，尤其是驅(qū)動(dòng)基因陰性的晚期患者，免疫治療逐漸成為一線及后線的重要治療手段，但總體客觀緩解率(objective response rate，ORR)僅20%左右[3]。因此，篩選能夠預(yù)測療效的生物標(biāo)志物尤為重要。雖然目前已經(jīng)提出了一些預(yù)測ICI療效的標(biāo)志物，如PD-L1(programmed cell death 1 ligand 1)蛋白表達(dá)水平、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)和腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden，TMB)等[4-5]，但這些檢測往往需要腫瘤組織樣本，不便于動(dòng)態(tài)監(jiān)測和評估。

腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中的標(biāo)志性事件，主要用于傳遞腫瘤生長和轉(zhuǎn)移所需各種營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子、氧氣等[6]。血管生成是一個(gè)復(fù)雜、動(dòng)態(tài)的生物學(xué)過程，包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、出芽、遷移等[7]。血管生成是腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)變化的重要事件，ICI聯(lián)合抗血管治療已經(jīng)成為肺癌重要的治療手段[8]，血管生成相關(guān)生物標(biāo)志物與免疫治療的療效及預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。本研究探索了與血管生成相關(guān)的17種因子在肺癌患者行PD-1免疫治療時(shí)的表達(dá)差異，以期找到新的免疫治療療效預(yù)測標(biāo)記物，從而為臨床實(shí)踐提供更好的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2018年1月-2019年9月在我院腫瘤科行PD-1抗體免疫治療的56例晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)NSCLC患者作為研究對象。依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第8版分期標(biāo)準(zhǔn)對患者進(jìn)行TNM分期，患者臨床及隨訪資料完整。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～70歲；②病理診斷為NSCLC，臨床分期為Ⅲ期或Ⅳ期；③至少接受2個(gè)周期ICI治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在EGFR、ALK、ROS1、BRAF等驅(qū)動(dòng)基因突變；②存在第二部位原發(fā)腫瘤；③合并嚴(yán)重肝、腎功能損傷的基礎(chǔ)性疾病；④患有嚴(yán)重自身免疫性疾病。所有患者均對該研究內(nèi)容知情，并簽署知情同意書。

1.3 治療方法

所有患者在第1次PD-1抗體治療前1天，空腹抽取外周血4 mL，檢測血清血管生成相關(guān)生物標(biāo)志物濃度(詳見1.4檢測方法)。PD-1單抗用藥方法：派姆單抗(美國默沙東公司)采用標(biāo)準(zhǔn)的3周方案，劑量為2 mg/kg；納武單抗(美國百時(shí)美施貴寶公司)采用2周方案，劑量為3 mg/kg。持續(xù)用藥直至出現(xiàn)不可耐受的不良反應(yīng)或疾病明顯進(jìn)展，每6周進(jìn)行1次用藥療效評估。在接受免疫治療前，所有患者均進(jìn)行完整的基礎(chǔ)檢查，血液檢查包括血常規(guī)、肝腎功能、腫瘤標(biāo)記物等，影像學(xué)檢査包括MRI、CT和超聲等。從影像學(xué)角度，所有患者均至少有1個(gè)可供評估的病灶?；颊呙?個(gè)治療周期進(jìn)行1次血液和影像學(xué)檢査，評估免疫治療療效，觀察并記錄藥物相關(guān)不良反應(yīng)。

1.4 檢測方法

在Luminex?xMAP?檢測平臺(tái)(美國)上，使用多重蛋白檢測試劑盒Human Angiogenesis/Growth Factor Magnetic Bead Panel 1(Cat. No.HAGP1M AG-12K)(美國Bio-Rad公司)，檢測17種血管生成相關(guān)生物標(biāo)志物，分別是血管生成素-2(angiopoietin-2，ANG2)、骨形態(tài)生成蛋白-9(bone morphogenetic protein 9，BMP-9)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、內(nèi)皮糖蛋白(endoglin)、血漿內(nèi)皮素-1(endothelin-1)、纖維母細(xì)胞生長因子-1(acidic fibroblast growth factor，F(xiàn)GF-1)、FGF-2、卵泡抑素(follistatin)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、肝素結(jié)合表皮生長因子(heparin binding EGF-like growth factor，HB-EGF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)、瘦素(leptin)、胎盤生長因子(placenta growth factor，PLGF)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)、VEGF-C、VEGF-D。

1.5 療效評價(jià)

根據(jù)RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)，接受治療的患者療效評價(jià)分為4級：完全緩解(complete remission，CR)、部分緩解(partial remission，PR)、疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)、疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)。其中疾病控制組(disease control，DCR)包含CR、PR和SD。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。臨床特征計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)(最小值，最大值)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)。采用logistic回歸分析影響晚期肺癌患者免疫治療療效的臨床因素，結(jié)果以比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)表示，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果分析

2.1 入組NSCLC患者的臨床資料分析

56例晚期NSCLC患者，經(jīng)PD-1抗體免疫治療后，根據(jù)首次療效評價(jià)結(jié)果將患者分為疾病控制組(DCR組)和疾病進(jìn)展組(PD組)，其中DCR組共34例患者(包含9例PR和25例SD)，PD組共22例患者，如表1。免疫治療近期療效與患者年齡、性別、ECOG評分、病理類型、臨床分期、PD-1單抗類型、是否聯(lián)合化療、免疫治療線數(shù)均無明顯相關(guān)(均P>0.05)，與遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移數(shù)和PD-L1蛋白表達(dá)水平明顯相關(guān)(P=0.041；P=0.027)。

表1 入組NSCLC患者免疫治療療效與臨床特征

2.2 DCR組與PD組血管生成相關(guān)生物標(biāo)志物基線水平比較

將不同療效分組的肺癌患者血管生成相關(guān)生物標(biāo)志物水平進(jìn)行比較，分析基線水平與免疫治療療效的關(guān)系，如表2。DCR組患者的基線血清HB-EGF、IL-8顯著低于PD組(P=0.023，P=0.012)；DCR組患者的基線血清VEGF-D顯著高于PD組(P=0.032)。兩組其余血管生成相關(guān)生物標(biāo)志物濃度均無顯著差異(均P>0.05)。

表2 DCR組與PD組血管生成相關(guān)生物標(biāo)志物基線水平比較[M(Min～Max)]

2.3 影響NSCLC患者免疫治療療效的臨床因素logistic回歸分析

Logistic回歸分析結(jié)果顯示，免疫治療前血清低水平IL-8、組織PD-L1陽性表達(dá)(TPS≥1%)為NSCLC患者PD-1抗體治療達(dá)到疾病控制的獨(dú)立影響因素(OR=14.882，P=0.038；OR=16.459，P=0.011)，見表3。

表3 影響NSCLC患者免疫治療療效的臨床因素Logistic回歸分析

3 討論

ICI的應(yīng)用逐步改變了晚期腫瘤患者的治療選擇，在黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、肺癌等治療中取得了突破性進(jìn)展，顯著提高了患者的5年生存期(overall survival，OS)[1-2,9]。然而，只有不到1/3的患者對免疫治療產(chǎn)生反應(yīng)，5%～10%患者表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性和副作用[10]。由于免疫治療起效慢，且存在超進(jìn)展和假性進(jìn)展現(xiàn)象，因此，臨床迫切需要尋找能夠預(yù)測免疫治療療效的生物標(biāo)志物，以便對患者進(jìn)行分群，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。當(dāng)前有關(guān)免疫治療的預(yù)測標(biāo)志物是研究熱點(diǎn)，其中腫瘤組織PD-L1表達(dá)水平是目前臨床應(yīng)用最廣泛的標(biāo)志物，另外MSI和TMB等指標(biāo)也被寫入指南和專家共識(shí)，但總體而言，預(yù)測能力有限且存在一定爭議[4-5]。免疫治療起效是一個(gè)復(fù)雜、多層次、動(dòng)態(tài)的反應(yīng)過程，單一的指標(biāo)預(yù)測能力往往有限，需要結(jié)合腫瘤自身及微環(huán)境綜合分析。本研究從血管生成相關(guān)生物標(biāo)志物的角度，分析其在疾病控制組和疾病進(jìn)展組中的表達(dá)水平差異，初步探索表達(dá)水平差異與免疫治療的相關(guān)性。

TME是由一些基質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)組成的、腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞發(fā)生相互作用的場所[11]。因此，TME的特征可反映機(jī)體對腫瘤的免疫狀態(tài)，可能為ICI治療提供潛在的療效預(yù)測標(biāo)志物[12]。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展離不開新生血管。新生血管不僅提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，清除廢物，還能為腫瘤干細(xì)胞提供有利的生存環(huán)境，為腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫細(xì)胞浸潤提供通道[7]。血管異常能幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞的攻擊，這些異常與血管生成相關(guān)生物標(biāo)志物水平升高密切相關(guān)，如ANG2和VEGF。Wu等[13]探索了ANG2與免疫檢查點(diǎn)治療黑色素瘤療效的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)治療前血漿中ANG2水平較低的患者在接受細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)/PD-L1抗體治療時(shí)，均具有顯著較長的OS。Yuan 等[14]則發(fā)現(xiàn)接受CTLA-4抗體治療的晚期黑色素瘤患者中，治療前血漿VEGF含量高的患者OS顯著降低。本研究通過分析17種血管生成相關(guān)生物標(biāo)志物在DCR和PD組中的表達(dá)，DCR組患者的基線血清HB-EGF、IL-8顯著低于PD組，VEGF-D顯著高于PD組。進(jìn)一步經(jīng)logistic回歸分析顯示，IL-8基線低水平為NSCLC患者PD-1免疫治療達(dá)到疾病控制的獨(dú)立影響因素。PD-L1表達(dá)陽性是預(yù)測免疫治療療效的指標(biāo)，已被寫入多個(gè)腫瘤治療指南[4-5]。本研究同樣證實(shí)PD-L1表達(dá)陽性是免疫治療達(dá)到疾病控制的獨(dú)立影響因素。HB-EGF被報(bào)道在多種腫瘤的診斷和預(yù)后中發(fā)揮作用，包括卵巢癌、胃癌等，提示高水平的HB-EGF與預(yù)后不良相關(guān)[15-16]。HB-EGF表達(dá)水平與免疫治療療效的關(guān)系尚未見報(bào)道。

IL-8是一種血管生成相關(guān)細(xì)胞因子，存在趨化因子受體1(CXC-chemokine receptor 1，CXCR1)和CXCR2兩個(gè)受體。IL-8由單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和各種上皮細(xì)胞產(chǎn)生，可招募嗜中性粒細(xì)胞，刺激腫瘤增殖和血管生成[17]。Alfaro等[18]研究發(fā)現(xiàn)，IL-8高表達(dá)與腫瘤分期及腫瘤負(fù)荷明顯相關(guān)。Hodi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，采用PD-1/CTLA-4免疫聯(lián)合治療黑色素瘤患者，高IL-8與低IL-8水平患者之間的生存風(fēng)險(xiǎn)比超過3倍。IL-8水平和PD-L1表達(dá)相關(guān)性較低，IL-8對生存的影響是獨(dú)立的[20]。血清IL-8水平與腫瘤組織CXCL8基因表達(dá)、嗜中性粒細(xì)胞/單核細(xì)胞計(jì)數(shù)呈明顯正相關(guān)[21]。血清IL-8水平與CD8+T細(xì)胞活化標(biāo)志物表達(dá)水平、T細(xì)胞浸潤相關(guān)轉(zhuǎn)錄、干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)水平負(fù)相關(guān)，提示IL-8對適應(yīng)性免疫存在一定的抑制作用，影響抗原遞呈效率和效應(yīng)T細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷能力[22]，而靶向IL-8可能是破解免疫治療耐藥的方法之一[23]。

本研究較系統(tǒng)地分析了血管生成相關(guān)生物標(biāo)志物與肺癌PD-1免疫治療療效的相關(guān)性，找到了3個(gè)表達(dá)差異的因子，其中IL-8水平可能是NSCLC患者PD-1免疫治療療效相關(guān)的影響因素。本研究作為初步的探索性研究，尚存在一些不足：①療效的評估需要參考更多指標(biāo)，如ORR、無進(jìn)展生存期(progression free survival，PFS)、OS等；②納入的樣本數(shù)量較少，需要在更大規(guī)模的多中心研究中驗(yàn)證。

為了進(jìn)一步研究血管生成標(biāo)志物與免疫治療的相關(guān)性，我們接下來會(huì)做兩個(gè)方面的延續(xù)工作：①除檢測血管生成相關(guān)生物標(biāo)志物基線水平外，在治療的過程中動(dòng)態(tài)檢測，以期得到變化趨勢與治療療效的相關(guān)性；②從分子、細(xì)胞、動(dòng)物及臨床病例中進(jìn)一步研究IL-8預(yù)測免疫治療療效的分子機(jī)制；③HB-EGF、VEGF-D表達(dá)水平與免疫治療療效的相關(guān)性尚不明確，對于這兩個(gè)有差異的分子，需要進(jìn)一步挖掘其臨床意義?？偨Y(jié)而言，本文的研究結(jié)果對免疫治療療效預(yù)測標(biāo)志物的研究提供了依據(jù)，具有一定的臨床參考價(jià)值。