血管內皮生長因子-2578基因多態(tài)性與下肢動脈粥樣硬化的相關性

李愛英，趙曉斐 (.山東省軍區(qū)青島第五離職干部休養(yǎng)所，山東 青島 66000；.連云港市第二人民醫(yī)院，江蘇 連云港 006)

下肢動脈粥樣硬化是一種退行性變，嚴重者可引起下肢供血動脈管腔狹窄、閉塞，表現(xiàn)為皮溫降低、疼痛、間歇性跛行，降低患者生活質量[1]。由動脈粥樣硬化導致截肢引起的急性死亡率達30%,5年后生存率<30%。周圍血管性病變與心腦血管性疾病的發(fā)生相關聯(lián)，動脈粥樣硬化是其危險因素[2-4]，其發(fā)病率高達正常人的6倍[5]。研究周圍血管病變，盡早及時干預顯得尤為重要。下肢動脈粥樣硬化除了與高血脂、吸煙、高血壓等可控制因素有關外，還和不可調控的因素基因有關[6]。

1 資料與方法

1.1一般資料：本次研究經過本院醫(yī)學倫理委員會同意。選擇2018年9月～2019年11月在連云港市第二人民醫(yī)院老年科年齡45～80歲之間的患者267例。根據下肢血管超聲檢查結果，分為內中膜(intima-mediathickness,IMT)增厚組171例和對照組96例，其中，增厚組男92例，女79例，年齡(64.30±9.29)歲，對照組男59例，女37例,年齡(67.15±9.63)歲。排除炎性反應、腫瘤、肝腎功能嚴重損害的患者。受試者均簽署知情同意書。

1.2采集樣本：抽取患者靜脈血3 ml置乙二胺四乙酸二納(EDTA)抗凝管中，-80℃冰箱儲存，提取DNA備用。

1.3提取DNA：將-80℃冰箱儲存的備用血于4℃冰箱隔夜。取全血200 μl，根據離心柱型全血基因組DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)說明書提取DNA。經紫外分光光度計比色定量，總DNA 12.05～30.1 μg。提取的DNA放置在-20℃的冰箱保存。

1.4檢測VEGF基因-2578C/A多態(tài)性：將含VEGF 2578C/A的DNA片段PCR擴增，引物序列[7]由上海生工生物工程股份有限公司合成，上游引物序列分別為5'-CTCCACCAAACCACAGCAAC-3'，下游引物序列為5'-GGCTACTTCTCCAGGCTCAC-3' 。反應體系50 μl:2 ×Reaction Mix 25 μl,上下游引物(10 μM)分別2 μl,Taq DNA聚合酶(2.5 U/μl)1 μl,用超純水補至50 μl。PCR反應：94℃預變性5 min,94℃變性45 s,60.5℃退火45 s,72℃延伸45 s，循環(huán)35次，然后72 ℃延伸7 min。擴增的片段用1.5%瓊脂糖凝膠電泳[8]。見圖1；并送融智公司測序。見圖2。

圖1 PCR擴增后于1.5%瓊脂糖凝膠電泳

分別為基因CC/CA/AA序列圖2 PCR基因測序圖

1.5測量下肢血管IMT：利用無創(chuàng)性的B型超聲測量下肢血管內中膜厚度 。所有受檢者均接受日本ALOKA5500 彩色多普勒超聲檢測儀檢查。患者取平臥位充分暴露雙下肢，對受檢者的足背動脈、脛后動脈、脛前動脈、腘動脈、股動脈等進行檢查。診斷標準[ 9]: 觀察指標利用血管內中膜厚度作為動脈粥樣硬化的評定標準: IMT≥1.0 mm表示管壁增厚。

2 結果

2.1兩組間一般情況的比較：增厚組和對照組比較，年齡、體重指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。吸煙、高血壓、總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 下肢動脈IMT增厚組與對照組基本資料的比較

2.2IMT增厚組和對照組基因型與等位基因頻率比較：兩組基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性。兩組間VEGF-2578C/A基因型及等位基因的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05， 2值分別為6.85、3.977)。見表2。

表2 位點VEGF-2578C/A基因型與等位基因分布[例(%)]

2.3血管內皮生長因子2578位點基因多態(tài)性與下肢動脈內中膜增厚易患性的關聯(lián)分析：以高血壓、吸煙、總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白為自變量，IMT增厚為應變量進行多變量Logistic回歸分析，吸煙(OR2.232，CI%1.096～4.545；P=0.026)、高血壓(OR7.539，CI%1.886～3.014；P=0.004)以及CC基因型(OR1.695，CI%1.694～1.695；P=0.002)是下肢動脈IMT增厚的獨立危險因素。

3 討論

下肢動脈粥樣硬化是中老年人中發(fā)生率最高的一種動脈粥樣硬化疾病[10]。損傷的下肢血管內皮引起粥樣硬化，進一步導致動脈血管狹窄或閉塞，逐年呈上升趨勢[7]。

VEGF基因全長14kb，位于6 p12染色體上,由7個內含子和8個外顯子構成[11]。VEGF作為一種生長因子，廣泛表達于正常組織和病變組織，在血管生成中發(fā)揮重要作用，并且和腫瘤、心腦血管疾病、風濕性關節(jié)炎、視網膜增生等疾病相關。VEGF在血管的保護、重塑中發(fā)揮重要作用。Howell等發(fā)現(xiàn)VEGF-2578基因型與冠心病的嚴重程度高度相關，基因型AA為獨立危險因素[12]。故本實驗探討VEGF啟動子(2578)的單基因核苷酸基因多態(tài)性與下肢動脈粥樣硬化的相關性，研究發(fā)現(xiàn)-2578C/A基因型C/C、C/A、A/A的構成比和等位基因C、A的頻率在IMT增厚組和對照組之間存在顯著差異，在IMT增厚組中-2578C/A位點等位基因C的頻率明顯高于對照組。進一步行多因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)基因型CC與下肢動脈內皮增厚存在顯著相關性。既往的研究-2578C/A位點基因型與IMT厚度無關聯(lián)[13]，CC基因型為動脈粥樣硬化的保護因素，AA基因型為獨立危險因素。本研究的結果與之相反，不排除與樣本選擇差異、種族或其他基因存在交互作用等因素有關。

綜上所述，本研究表明漢族人群中VEGF啟動子-2578位點的單核苷酸多態(tài)性與IMT有相關性， C等位基因可能增加下肢動脈粥樣硬化發(fā)生的風險，其確切機制有待于進一步研究。下肢動脈粥樣硬化是環(huán)境、遺傳共同影響的疾病，本研究樣本量小，可能存在偏倚，需增加樣本量證實結果的可靠性。