昆蟲病原線蟲對煙苗的保護效果

谷星慧，崔永和，阮維斌，曹 莉，薛 丹，李江舟*，

屠婭玲1，杭德發(fā)1，韓日疇3*

(1. 云南省煙草公司玉溪市公司，煙草行業(yè)病蟲害生物防治工程研究中心，云南玉溪 653100；2. 南開大學(xué)，天津 300071；3. 廣東省科學(xué)院動物研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室, 廣州510260)

小地老虎Agrotisypsilon屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是危害煙草的重要害蟲(蒲小明等, 2016; 伍紹龍等, 2017)。此害蟲活動范圍大，食性廣泛，除水稻等水生植物外，幾乎對所有植物的幼苗均能取食(李建一等, 2019)。小地老虎幼蟲可將移栽期靠近地面的煙草幼嫩莖部咬斷，使幼苗整株死亡，但對大煙株的危害不大，是煙草栽培中非常重要的一種苗期害蟲(李根等, 2017)。目前，煙草苗期小地老虎幼蟲防治，主要為化學(xué)防治(Zhangetal., 2018)，但農(nóng)藥殘留嚴(yán)重影響卷煙的品質(zhì)和安全性(何發(fā)林等, 2018)。為保護煙田環(huán)境和煙草產(chǎn)品質(zhì)量，以強調(diào)自然因子的控制作用為主的多種生物防控手段越來越受到重視，并應(yīng)用于煙草苗期小地老虎的防控(李建一等, 2019)。

昆蟲病原線蟲(主要包括斯氏屬Steinernema和異小桿屬Heterorhabditis)，作為新型生物殺蟲制劑已廣泛用于防治農(nóng)林、牧草、花卉和衛(wèi)生等害蟲(Grewaletal., 2005; Peters, 2013; Labaudeetal., 2018)。這類殺蟲制劑具有廣泛寄主范圍；對寄主具主動搜尋能力，對土棲性害蟲特效；可規(guī)模化培養(yǎng)，使用方便；對人畜、環(huán)境安全(Ehlers, 2001)。分布于工業(yè)化國家的生物農(nóng)藥生產(chǎn)公司致力于這類生物農(nóng)藥的研制和商業(yè)化，如德國的BASF公司(www.basf.com)和E-nema公司(www.e-nema.de)，瑞典Andermatt Biocontrol (www.biocontrol.ch)，荷蘭Koppert公司(www.koppert.nl)等(Ehlers, 2001)。昆蟲病原線蟲業(yè)已應(yīng)用于防治蔬菜(Chenetal., 1989; Shapiroetal., 1999; Yangetal., 2000; Ebssaetal., 2012; Yanetal., 2014; 武海斌等, 2015)和盆栽或煙田小區(qū)煙苗(楊建全等, 2000; 李根等, 2017)的小地老虎幼蟲。但存在與種類、測定方法有關(guān)的效果不穩(wěn)定現(xiàn)象(Ebssaetal., 2012; Yanetal., 2014)，因此，有必要利用昆蟲病原線蟲以及小地老虎幼蟲誘食劑保護煙苗免受這一昆蟲幼蟲危害。

本研究在煙苗移栽時，添加誘食劑距8 cm環(huán)繞煙苗，同時施用生物制劑，測定昆蟲病原線蟲S.carpocapsaeAll 品系對小地老虎幼蟲的控制作用，研究其對剛移栽煙苗的保護作用，同時，比較綠僵菌和化學(xué)農(nóng)藥對小地老虎的控制作用，為利用昆蟲病原線蟲防控?zé)熖镄〉乩匣⒂紫x提供方法。

1 材料與方法

1.1 試驗地簡介

本實驗實施于云南省煙草公司玉溪市公司華寧煙草種植場?？緹熎贩N為MSK326，每667 m21 100株，株行距120 cm×50 cm。經(jīng)調(diào)查，供試試驗田中未發(fā)現(xiàn)小地老虎成蟲及幼蟲，本研究采用人工添加小地老虎幼蟲于移栽煙苗周圍以實施實驗。

1.2 供試?yán)ハx及材料

供試?yán)ハx：本研究使用的小地老虎4齡幼蟲于實驗室25℃下以人工飼料(購自河南省濟源白云實業(yè)有限公司)飼養(yǎng)而得(幼蟲購自滄州育康農(nóng)業(yè)科技有限公司)；小地老虎食物為每 667 m2將 0.15 kg白糖用1 L溫水溶化后倒入0.05 kg白酒、0.05 kg醋、配制成混合液，噴灑到切碎的白菜Brassicapekinensis(Lour.) Rupr.和麥麩(10 kg白菜加1 kg麩皮)上均勻攪拌，堆悶1 h，每株煙苗10 g。

昆蟲病原線蟲粉劑：昆蟲病原線蟲S.carpocapsaeAll粉劑采用人工培養(yǎng)基固體培養(yǎng)(韓日疇, 1995)，以蛭石粉貯存于4℃冰箱中(購自濰坊宏潤農(nóng)業(yè)科技有限公司)，實驗前檢查線蟲的存活率均高于98%，每株煙苗施用2×105條感染期線蟲。

蟲尸劑：S.feltiaeSN感染末齡大蠟螟Galleriamellonella幼蟲的蟲尸劑由南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，每株煙苗放置2頭蟲尸，約含2×105條感染期線蟲。

綠僵菌：金龜子綠僵菌顆粒劑(CQMa421)含2億活孢子/g(購自重慶聚立信生物工程有限公司)，每株煙苗施用4.5 g(即5 kg/667 m2)。

化學(xué)農(nóng)藥：敵殺死的有效成分為25 g/L溴氰聚酯乳油(德國拜耳公司產(chǎn)品)，用量4 mL/667 m2，兌15 kg水，即每株煙噴14 g。煙用肥料包括復(fù)合肥(N ∶P2O5∶K2O=12 ∶6 ∶24)移栽時施用15 g/株(即16.5 kg/667 m2)、鈣鎂磷肥(P2O5含量14%～18%)6.5 g/株(即7 kg/667 m2)。

誘食劑：供試的小地老虎幼蟲食物分別為小白菜B.chinensis(A)、蕹菜Ipomoeaaquatica(B)、人工飼料(C)和含水量60%的麩皮(D)。小白菜、蕹菜和麩皮均購自市場，小白菜、蕹菜用清水清洗后晾干，經(jīng)飼喂實驗未發(fā)現(xiàn)含有高毒化學(xué)農(nóng)藥殘留。人工飼料配方同上。

1.3 小地老虎幼蟲對食物偏好性測定

實驗室飼養(yǎng)的小地老虎4齡幼蟲用于本實驗。食物分別為小白菜(A)、蕹菜(B)、人工飼料(C)和含水量60%的麩皮(D)。人工飼料配方同上。將小白菜和蕹菜以無菌水清洗并晾干，剪碎；將4種食物(約2 g)分別放置于玻璃培養(yǎng)皿(直徑=15 cm)的4個對角上；每皿移入10頭小地老虎4齡幼蟲，設(shè)置5個培養(yǎng)皿的重復(fù)；每30 min觀察并記錄分別選擇4種食物的小地老虎幼蟲數(shù)量，統(tǒng)計不同時間每種食物引誘幼蟲數(shù)量的百分率。

1.4 昆蟲病原線蟲等對移栽煙苗的保護作用

試驗實施前，以小地老虎成蟲性誘捕器(北京中捷四方生物科技股份有限公司產(chǎn)品)檢查實驗煙田的小地老虎發(fā)生情況。實驗期間，早中晚分別測量和記錄氣溫和土溫。實驗在下午黃昏時進(jìn)行，以避免強光和高溫對昆蟲病原線蟲或綠僵菌等的傷害。煙苗移栽前，將煙塘挖好(寬度45 cm；深度15 cm)。每塘澆定根水2.5 L，待水還未全部被沙土吸干前，明水深栽一株煙苗。待定根水全部落完后，取15 g煙用肥料在以每煙苗為圓心5 cm的區(qū)域進(jìn)行環(huán)施。粉劑(使用前將保存的昆蟲病原線蟲粉劑用水溶解并稀釋為濃度2×104/mL條感染期線蟲的懸浮液)處理，以每煙苗為圓心8 cm的區(qū)域分別環(huán)澆10 mL昆蟲病原線蟲懸液；蟲尸處理以每煙苗為圓心8 cm的區(qū)域放置2頭被S.feltiaeSN感染的大蠟螟幼蟲蟲尸；綠僵菌處理撒施綠僵菌顆粒劑；化學(xué)農(nóng)藥處理噴施農(nóng)藥敵殺死(溴氰菊酯)于煙苗根部；食物處理小區(qū)取10 g小地老虎誘食劑以每煙苗為圓心8 cm的區(qū)域進(jìn)行環(huán)撒后再分別施用線蟲懸液、蟲尸、綠僵菌和清水。然后，以每煙苗為圓心12 cm的區(qū)域?qū)羌尤?頭或三角加入3頭人工飼養(yǎng)的小地老虎4齡幼蟲，用細(xì)干土(土溫不超過25℃)進(jìn)行蓋塘(約0.5 cm土層)。實驗按照隨機區(qū)組設(shè)計，每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)45株，共135株。

每天觀察記錄煙苗危害情況，連續(xù)10 d。將大蠟螟1頭末齡幼蟲放在一個金屬茶漏里，移栽后3 d和10 d，每個小區(qū)隨機選取5株煙苗，每株煙苗在施用線蟲的圓圈上均勻放置10頭大蠟螟幼蟲，4 d后取出，查看大蠟螟死亡數(shù)量并解剖查看是否存在線蟲。實驗后第3天、第6天和第9天，各個處理和對照隨機取3株樣品，以取樣器或勺子從環(huán)撒線蟲的土層取一勺子土(約10 g)，準(zhǔn)確稱重后，于100℃烘箱中將土壤干燥至恒重，計算土壤含水量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對數(shù)據(jù)進(jìn)行開方根反正弦轉(zhuǎn)換，利用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布(Normality Plots with Tests)和方差齊性(Test of Homogeneity of Variances)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA)；重復(fù)測量數(shù)據(jù)先經(jīng)球形檢驗(Mauchly’s test of sphericity)，如果檢驗結(jié)果P>0.05, 說明重復(fù)測量數(shù)據(jù)之間不存在相關(guān)性，測量數(shù)據(jù)符合Huynh-Feldt條件。若方差存在顯著差異，則采用Tukey法進(jìn)行多重比較。對于不符合上述條件的數(shù)據(jù)則進(jìn)行非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis test followed by the Mann-Whitney U test檢驗)。顯著水平設(shè)置為P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 小地老虎幼蟲對食物的選擇作用

小地老虎幼蟲于不同時間對食物的選擇作用測定數(shù)據(jù)需要重復(fù)測量方差分析。經(jīng)球形檢驗(Mauchly’s test of sphericity)，檢驗結(jié)果P=0.072>0.05，說明重復(fù)測量數(shù)據(jù)之間不存在相關(guān)性。結(jié)果分析見圖1。測定后0.5 h，取食小白菜和蕹菜的小地老虎幼蟲數(shù)量顯著高于取食人工飼料和麩皮的幼蟲數(shù)量(H=15.487,P=0.001)；1 h后，取食小白菜和蕹菜的小地老虎幼蟲數(shù)量顯著高于取食人工飼料和麩皮的幼蟲數(shù)量，但取食人工飼料的幼蟲數(shù)量又顯著高于取食麩皮的(H=15.305,P=0.002)；2 h后，取食小白菜、蕹菜和麩皮的小地老虎幼蟲數(shù)量顯著高于取食人工飼料的幼蟲數(shù)量(F3,16=10.319,P=0.001)；3 h后，取食小白菜和蕹菜的小地老虎幼蟲數(shù)量顯著高于取食人工飼料的幼蟲數(shù)量(F3,16=10.559,P=0.000)；6 h后，取食小白菜和蕹菜的小地老虎幼蟲數(shù)量顯著高于取食人工飼料和麩皮的幼蟲數(shù)量(F3,16=23.519,P=0.000)；8 h后，取食蕹菜的小地老虎幼蟲數(shù)量顯著高于取食白菜、人工飼料和麩皮的幼蟲數(shù)量(H=15.949,P=0.001)。綜上所述，盡管不同時間每種食物引誘的幼蟲數(shù)量有差異，但是小地老虎幼蟲對鮮葉類蔬菜小白菜和蕹菜具有偏好性。

2.2 昆蟲病原線蟲對移栽煙苗的保護作用

試驗期間未有降雨，氣溫范圍為17～31℃；5 cm和 10 cm下的土溫范圍分別為19～34℃和19～30℃。當(dāng)每株煙苗放置2頭小地老虎4齡幼蟲時，10 d后不同處理和對照的煙苗累計被害率見圖2。未加入小地老虎幼蟲食物的情況下，施用昆蟲病原線蟲粉劑后的煙苗死亡率為56.7%，顯著低于綠僵菌74.2%、昆蟲病原線蟲蟲尸劑70.0%和對照78.3%，但高于敵殺死(溴氰菊酯)處理的煙苗死亡率37.5%；加入小地老虎幼蟲食物后，可見小地老虎幼蟲停留于食物上取食，施用昆蟲病原線蟲粉劑后的煙苗死亡率為40.8%顯著低于綠僵菌62.5%、昆蟲病原線蟲蟲尸劑67.6%和對照62.5%，但與敵殺死(溴氰菊酯)處理的煙苗死亡率39.2%差異不顯著(F9,20=29.094;P=0.000)。相比之下，加入小地老虎幼蟲食物后，施用昆蟲病原線蟲粉劑處理的煙苗死亡率為40.8%顯著低于未添加幼蟲食物的煙苗死亡率56.7%。

當(dāng)每株煙苗放置3頭小地老虎4齡幼蟲時，10 d后不同處理和放置2頭小地老虎幼蟲處理的煙苗累計被害率結(jié)果類似，只是各處理和對照的煙苗死亡率比放置2頭小地老虎幼蟲時普遍提高10%～20%(圖2)。不論是否加入小地老虎幼蟲誘食劑，施用昆蟲病原線蟲后的煙苗死亡率均顯著低于綠僵菌、蟲尸劑或?qū)φ盏?，但與敵殺死(溴氰菊酯)處理的煙苗死亡率未見顯著差異(F9,20=25.249;P=0.000)。同樣，加入小地老虎幼蟲食物后，施用昆蟲病原線蟲的煙苗死亡率為36.7%，顯著低于未加入小地老虎幼蟲食物的處理71.7%。

圖2 不同處理的煙苗死亡率Fig.2 Mortalities of the young tobacco seedings注：Steinernema carpocapsae All粉劑(A)、S. feltiae SN蟲尸劑(B)、綠僵菌Metarhizium anisopliae(C)或化學(xué)農(nóng)藥敵殺死(溴氰菊酯)(D)處理小地老虎幼蟲后煙田移栽期煙苗的死亡率。E為對照。添加食物(鮮草)時的處理分別標(biāo)記為A-1，B-1，C-1，D-1和E-1。圖1-A，當(dāng)每株煙苗存在2頭小地老虎幼蟲時；圖1-B，當(dāng)每株煙苗存在3頭小地老虎幼蟲時。柱狀圖上不同字母表示處理間煙苗被危害率在5%水平差異顯著。Note: Mortalities of the young tobacco seedings from the black cutworm larvae after treated by Steinernema carpocapsae All in vermiculite (A), S. feltiae SN in Galleria cadavers (B), Metarhizium anisopliae (C) or chemical insecticide (deltamethrin) (D) in the tobacco field. E, the control. A-1, B-1, C-1, D-1 and E-1 indicated the treatments with attractant food (cut fresh weeds). A, two black cutworm larvae were present in a tobacco seeding; B, three black cutworm larvae were present in a tobacco seeding. Columns with different letters indicated significant differences in the mortalities of the young tobacco seedings at 0.05 level.

由此可見，每株煙苗施用2×105條感染期線蟲，10 d的保苗效果高于60%，與敵殺死(溴氰菊酯)效果相當(dāng)。說明昆蟲病原線蟲粉劑對煙草幼苗期小地老虎具有明顯的控害作用，從而對煙草幼苗具有較好的保護作用。且2×105條感染期線蟲的批量生產(chǎn)成本約為0.1元，與一株煙苗的成本相當(dāng)，同時節(jié)省煙苗被害后補苗的人工費用，因此，在經(jīng)濟上是可行的。

為檢測試驗期間土壤的含水量和昆蟲病原線蟲的存活情況，每天通過水分測定儀測定煙塘表面土層的含水量，其范圍為10.99%～37.95%；以末齡大蠟螟幼蟲檢測施用昆蟲病原線蟲10 d后的存活情況，結(jié)果表明，86.37%大蠟螟幼蟲被昆蟲病原線蟲感染。如果為昆蟲病原線蟲持效期的測定，建議可將測定時間延長，10 d的時間設(shè)置較短。

3 結(jié)論與討論

政策和市場驅(qū)動的煙草行業(yè)綠色化發(fā)展戰(zhàn)略業(yè)已實施。關(guān)鍵是如何從技術(shù)上促進(jìn)戰(zhàn)略目標(biāo)的實現(xiàn)。影響現(xiàn)代煙草行業(yè)綠色發(fā)展的主要因素之一是煙葉蟲害防控過程中的化學(xué)農(nóng)藥殘留。小地老虎、煙青蟲Heliothisassulta、斜紋夜蛾Spodopteralitura是煙區(qū)主要害蟲，施用化學(xué)農(nóng)藥是目前煙草蟲害的主要防控手段(周孚美等, 2018)。利用生物農(nóng)藥防控?zé)焻^(qū)蟲害是綠色之選(Yanetal., 2014)。昆蟲病原線蟲便是本研究的選擇之一。試驗證明，煙苗周圍存在2或3頭小地老虎4齡幼蟲的情況下，施用S.carpocapsaeAll線蟲粉劑對剛移栽煙苗具有保護作用，在剛移栽煙苗周圍添加食物顯著降低煙苗的被危害率。

小地老虎幼蟲活動力很強，在煙田中很快便可找到剛移栽的煙苗并咬斷其莖部(李根等, 2017)。由于生物制劑作用時間相對高毒化學(xué)農(nóng)藥緩慢，因此，有必要利用食物引誘小地老虎幼蟲停留于施用生物制劑的區(qū)域，以便讓小地老虎幼蟲有足夠時間被感染。本研究利用幼蟲喜歡的鮮草或蔬菜距8 cm環(huán)繞煙苗，同時施用生物制劑，幼蟲取食鮮草或蔬菜時可被昆蟲病原線蟲或綠僵菌感染。結(jié)果表明，添加食物和施用昆蟲病原線蟲粉劑可有效保護煙苗，同時，根據(jù)煙苗和線蟲的成本核算，這一方法在經(jīng)濟上也是可行的。施用昆蟲病原線蟲粉劑保護煙苗的效果明顯好于蟲尸劑或綠僵菌，這可能與蟲尸劑或綠僵菌需要更長的時間感染昆蟲有關(guān)。

昆蟲病原線蟲蟲尸劑是將被線蟲感染的昆蟲(一般為大蠟螟或黃粉蟲Tenebriomolitor幼蟲)尸體直接施用于田間防治害蟲的劑型(Gaugleretal., 2002)。這種劑型可從蟲尸中釋放線蟲，對靜止性且發(fā)育周期長的昆蟲(如蠐螬和韭蛆Bradysiaodoriphaga)具有防控優(yōu)勢(Shapiro-Ilanetal., 2001; Lewis & Shapiro-Ilan, 2002; Shapiro-Ilanetal., 2003; Del Valleetal., 2008; Wangetal., 2014; Baietal., 2016)，但對于活動性強、生活史比較短的昆蟲(如小地老虎等)不適合，因為蟲尸中的線蟲還未及時釋放出來時，昆蟲幼蟲可能業(yè)已離開蟲尸放置區(qū)域。

真菌可用于田間防控小地老虎幼蟲。球孢白僵菌Beauveriabrongniartii與多殺菌素混用防治小地老虎有協(xié)同增效作用，并能明顯降低小地老虎幼蟲的體重和大小(Gosselinetal., 2009)。卵孢白僵菌菌株NEAU30503對小地老虎具有較高的殺蟲活性，土壤處理防治高齡幼蟲效果好，對低齡幼蟲需要加入少量的高效氯氫菊酯或茶皂素(劉聰鶴等, 2016)。中國擬青霉Paecilomycessinensis是冬蟲夏草寄主昆蟲蝙蝠蛾幼蟲的一種病原真菌，也可用于致死小地老虎幼蟲(張燦明等, 2018)。本實驗使用綠僵菌保護移栽煙苗的效果不佳，主要原因同樣是小地老虎幼蟲活動能力太強，移栽時使用的綠僵菌未能及時感染幼蟲，如果在翻犁或起壟前施用綠僵菌可能對移栽煙苗具有較好的保護作用。

昆蟲根據(jù)揮發(fā)性氣味對寄主或食物具有趨向性(Francisetal., 2004; Bruceetal., 2005; Carlssonetal., 2011)。如亞洲飛蝗Locustamigratoria對不同的寄主植物取食頻數(shù)存在差異性(族米娜等, 2019)。本實驗發(fā)現(xiàn)，在限制空間中存在小白菜、蕹菜、人工飼料和麩皮的情況下，小地老虎幼蟲對小白菜和蕹菜具有明顯偏好性。這為進(jìn)一步篩選幼蟲食物提供了思路，同時有助于研究引誘幼蟲的揮發(fā)性物質(zhì)。