基于納米孔測(cè)序技術(shù)的柑橘黃龍病檢測(cè)方法建立

盧慧林,陳大嵩,陳逢浩,葉靜文,歐陽(yáng)革成*

(1. 廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所，廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510260；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，廣州 510642)

柑橘黃龍病(Huanglongbing)是最具毀滅性的柑橘病害(Hall and McCollum, 2011; Wang, 2019)，在全球的分布超過(guò)50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)(Bové, 2006; 黃愛軍, 2014; European Food Safety Authority (EFSA),etal., 2019)，是全球柑橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸。由于目前無(wú)法選育出抗病樹種，除了防治其媒介昆蟲-柑橘木虱以外，及時(shí)移除病樹，避免感染擴(kuò)散，是防控黃龍病的關(guān)鍵措施之一，其中最重要的就是要及時(shí)快速地對(duì)柑橘黃龍病進(jìn)行早期檢測(cè)和診斷(鄭正, 2017)。近年來(lái)，分子生物學(xué)檢測(cè)、高光譜檢測(cè)等技術(shù)，越來(lái)越普遍地用于柑橘黃龍病的識(shí)別與監(jiān)測(cè)(許美容等, 2015)，但仍然達(dá)不到生產(chǎn)要求。多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)是目前應(yīng)用于柑橘黃龍病識(shí)別的一種較為可靠且普遍的技術(shù)，但該方法存在的問題是難以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線檢測(cè)(陸健強(qiáng)等, 2021)。高光譜檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)實(shí)地快速識(shí)別，但只對(duì)有明顯癥狀的染病樹有用，難以做到早期診斷。

隨著高通量測(cè)序方法的快速發(fā)展，測(cè)序成本的不斷降低，高通量測(cè)序被廣泛應(yīng)用于各種病原的測(cè)序或檢測(cè)中(陳大嵩等, 2021)。牛津納米孔技術(shù)公司(Oxford Nanopore Technologies, ONT)的掌上納米孔測(cè)序儀MinION是一款新研發(fā)的便攜式測(cè)序儀，它能夠直接進(jìn)行DNA和RNA測(cè)序，擁有超長(zhǎng)的讀長(zhǎng)、實(shí)時(shí)測(cè)序、隨時(shí)終止等特性，被廣泛應(yīng)用于多種病原體的檢測(cè)(Wongsurawatetal., 2019; Warwicketal., 2019; 陳大嵩等, 2021)。本文嘗試?yán)肕inION測(cè)序儀對(duì)感染黃龍病的柑橘DNA樣品進(jìn)行測(cè)序，對(duì)比不同軟件的比對(duì)結(jié)果，優(yōu)化分析手段，從而實(shí)現(xiàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)黃龍病菌進(jìn)行有效監(jiān)控和高效測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 DNA提取

4個(gè)柑橘葉片(砂糖桔Citrustrticulata，典型黃龍病斑駁葉片)標(biāo)本均取自廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所環(huán)境昆蟲研究中心養(yǎng)蟲室，葉片總DNA提取方法：采用Biospin植物基因組試劑盒，實(shí)驗(yàn)步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行調(diào)整：稱取0.1 g植物葉片葉脈，用滅菌剪刀剪碎，置于2.0 mL離心管中，加入100 μL LP Buffer，并放入研磨珠，將離心管放入研磨機(jī)內(nèi)研磨，研磨后在加入350 μL LP Buffer，并混合均勻；于65℃下溫浴15 min，每5 min顛倒混勻；加入150 μL DA緩沖液，混合均勻，放置冰浴中5 min；將管中混合物全部轉(zhuǎn)移至Shredder spin colum，于14 000 xg離心3 min；將上述濾液轉(zhuǎn)移到一個(gè)滅菌后的1.5 mL離心管；加750 μL或上述濾液體積1.5倍的P Binding緩沖液，并混合均勻；將上述混合液體轉(zhuǎn)移至Spin colum，然后6 000 xg離心60 s，并棄去接液管中液體；加入500 μL G Binding緩沖液至Spin colum，于10 000 xg離心30 s，并棄去接液管中液體；加入600 μL Wash緩沖液，于10 000 xg離心30 s，并棄去接液管中液體；空管離心Spin colum，10 000 xg離心1 min，并將Spin colum轉(zhuǎn)移至一個(gè)新滅菌的1.5 mL離心管；加入100～200 μL Elution緩沖液，室溫溫育1 min；12 000 xg離心1 min，并棄去Spin colum，1.5 mL離心管中液體含有DNA。

1.2 黃龍病病原菌檢測(cè)

參照許美容等(2016)檢測(cè)方法，用基于柑橘黃龍病菌16S rDNA基因的OI1/OI2c (5′-GCGCGTATCCAA-TACGAGCGGCA-3′/5′-GCCTCGC GACTTCGCAAC-CCAT-3′)引物擴(kuò)增目的DNA樣品，以健康柑橘材料提取的DNA分別作為陰性對(duì)照，以感染黃龍病的柑橘DNA為陽(yáng)性對(duì)照。PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取6 μL PCR產(chǎn)物和6×Loading Buffer相混合，于室溫下進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為120 V，時(shí)間為30 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，如在1 167 bp處出現(xiàn)條帶，則為陽(yáng)性樣品。

1.3 納米孔測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建

參考納米孔測(cè)序連接測(cè)序試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行納米孔測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建。首先，利用微量分光光度計(jì)測(cè)量溶液中DNA含量，并保證1 μg以上的DNA用于下一步實(shí)驗(yàn)；其次利用試劑盒NEBNext End repair / dA-tailing Module (NEB：E7546)對(duì)打斷的DNA進(jìn)行末端修復(fù)；第三步，利用磁珠AMPure XP beads(Agencourt)對(duì)DNA文庫(kù)進(jìn)行回收；第四步，利用末端連接試劑盒NEB Blunt / TA Ligase Master Mix (NEBZ: M0367)與連接測(cè)序試劑盒1 D Genomic DNA by ligation (Oxford Nanopore Technologies: SQK-LSK108)進(jìn)行DNA末端測(cè)序接頭的連接，完成DNA測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建；最后，參照試劑盒說(shuō)明書的方法進(jìn)行對(duì)測(cè)序芯片進(jìn)行質(zhì)檢(陳大嵩等, 2021)。

1.3 納米孔測(cè)序與分析

測(cè)序獲得的fastq文件利用長(zhǎng)序列比對(duì)軟件GraphMap、minimap2、bwa在mem模式下參數(shù)-x選擇ont2d以及bwa在mem模式下參數(shù)-A選擇2、參數(shù)-B選擇3比對(duì)到柑橘黃龍病亞洲種基因組序列(GenBank: NZ_CP010804.1)。測(cè)序獲得的fastq文件轉(zhuǎn)換成fasta文件后，利用blastn比對(duì)到柑橘黃龍病亞洲種基因組序列(GenBank: NZ_CP010804.1)。比較不同比對(duì)軟件與比對(duì)方案之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌檢測(cè)結(jié)果

采集的4個(gè)樣品中，經(jīng)常規(guī)PCR檢測(cè)顯示，樣品編號(hào)4的柑橘DNA擴(kuò)增到1條大小約1 167bp的條帶，確定為黃龍病菌(圖1)，以此DNA樣品進(jìn)行下一步的測(cè)序和分析。

圖1 柑橘樣品中黃龍病菌的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR amplification electrophoretogram of Candidatus Liberibacter asiaticus in citrus samples注：M，DL2000 DNA marker；+，陽(yáng)性對(duì)照(感染黃龍病的柑橘DNA樣品)；-，陰性對(duì)照(健康柑橘DNA樣品)；1～4，采自廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)室的柑橘樣品。Note: M, DL2000 DNA marker; +, Positive control (DNA sample of citrus infected CLas); -, Negative control (DNA sample of citrus un-infected CLas); 1～4, Citrus samples taken from the laboratory of Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization.

2.2 納米孔測(cè)序與分析

利用MinION測(cè)序儀對(duì)確診黃龍病菌感染的柑橘葉片總DNA進(jìn)行測(cè)序，獲得約25 M條序列共3.75 G個(gè)堿基(圖2)。序列最長(zhǎng)27 147 bp，序列長(zhǎng)度的中位數(shù)為1 239 bp，平均長(zhǎng)1 492 bp。利用Blast、GraphMap、minimap2以及兩種bwa的比對(duì)方法將測(cè)序結(jié)果比對(duì)到黃龍病基因組上，其中Blast、GraphMap、minimap2、bwa AB與bwa x分別比對(duì)上5 702、42 557、6 200、7 269與56 712條序列(圖3)，其中Blast、minimap2與bwa AB分析方法獲得的結(jié)果比較接近。將比對(duì)算法的軟件GraphMap、minimap2以及bwa得到的結(jié)果利用比對(duì)到黃龍病菌基因組的位置展示成圈圖(圖4)，可見比對(duì)結(jié)果均勻地比對(duì)到黃龍病菌基因組上，并未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的偏倚現(xiàn)象。

圖2 MinION測(cè)序原始序列長(zhǎng)度堆積圖Fig.2 Histogram of the raw sequences by MinION sequencer注：橫坐標(biāo)，序列長(zhǎng)度；縱坐標(biāo)，序列長(zhǎng)度的頻數(shù)，即每個(gè)序列長(zhǎng)度區(qū)間內(nèi)有多少個(gè)序列。Note: X-axis, Sequence length; Y-axis, Sequence frequency, namely the sum of the sequences within each sequence length interval.

圖3 比對(duì)結(jié)果的韋恩圖Fig.3 Venn diagram of comparison results注：bwa_x，bwa在mem模式下參數(shù)-x選擇ont2d；bwa_AB，bwa在mem模式下參數(shù)-A選擇2、參數(shù)-B選擇3。Note: bwa_x, bwa mem mapping mode with -x ont2d; bwa_AB, bwa mem mapping mode with -A 2 -B 3.

圖4 分析軟件比對(duì)到基因組的位置Fig.4 The location of the genome mapped by each software注：外環(huán)，黃龍病菌基因組長(zhǎng)度的示意圖；中環(huán)，各軟件比對(duì)到黃龍病菌基因組位堆積圖，高度表示比對(duì)到該基因組位置的堿基數(shù)量；內(nèi)環(huán)，黃龍病菌基因組的GC含量。Note: Outer, Diagram of genome length of Huanglongbing; Central, Histogram of each software mapping to Huanglongbing genomic, and the height indicates the sum of bases mapped to the genomie; Inner, GC content of Huanglongbing genome.

3 結(jié)論與討論

納米孔測(cè)序技術(shù)Nanopore sequencing為近幾年興起的第三代測(cè)序技術(shù)，由牛津納米孔技術(shù)公司(Oxford Nanopore Technologies, ONT)開發(fā)，與以往的測(cè)序方法不同，該技術(shù)基于電信號(hào)的測(cè)序技術(shù)，通過(guò)電流信號(hào)的特征性改變，來(lái)確定正在通過(guò)該孔的DNA或RNA的堿基序列，進(jìn)行實(shí)時(shí)單分子測(cè)序(Senol Calietal., 2019; 陳大嵩等, 2021; 張皓博等, 2021)。該技術(shù)能夠邊解鏈邊測(cè)序，無(wú)需PCR擴(kuò)增和化學(xué)樣品標(biāo)記，極大簡(jiǎn)化了測(cè)序試驗(yàn)流程，有效降低了假陽(yáng)性，而且不需要模板設(shè)計(jì)引物，甚至可以鑒定新病原等的特性，可以與PCR鑒定方法形成互補(bǔ)(Fengetal., 2015; 陳大嵩等, 2021)，該技術(shù)具有高通量、實(shí)時(shí)、長(zhǎng)片段讀長(zhǎng)、易集成、時(shí)效性強(qiáng)、體積較小便于攜帶等優(yōu)勢(shì)，可應(yīng)用于動(dòng)植物和微生物基因組測(cè)序、宏基因組測(cè)序、RNA直接測(cè)序、微生物檢測(cè)、DNA與RNA甲基化檢測(cè)、mRNA的polyA長(zhǎng)度定量等研究(Senol Calietal., 2019; 曹影等, 2020; 陳大嵩等, 2021)。杜宇等(2021)利用納米孔技術(shù)構(gòu)建和注釋了蜜蜂球囊菌的首個(gè)高質(zhì)量全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，為探究球囊菌轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性、完善參考基因組的序列和功能注釋信息以及深入開展球囊菌可變剪接體的功能研究提供了關(guān)鍵依據(jù)。在人類疾病檢測(cè)中，納米孔測(cè)序也顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)有著先前基因測(cè)序技術(shù)沒有的優(yōu)勢(shì)，其能夠提供動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)的測(cè)序，可在數(shù)小時(shí)或更短的時(shí)間內(nèi)獲取和分析DNA或RNA序列，且文庫(kù)制備簡(jiǎn)單，不受環(huán)境限制，便于攜帶，使現(xiàn)場(chǎng)基因測(cè)序成為可能，從而進(jìn)一步加快了檢測(cè)時(shí)間，有助于迅速診斷疾病并及時(shí)進(jìn)行針對(duì)性治療(Euskirchenetal., 2017; 張皓博等, 2021)。

柑橘黃龍病的實(shí)時(shí)實(shí)地早期檢測(cè)和快速診斷技術(shù)是防控黃龍病的關(guān)鍵措施之一，目前尚無(wú)滿足生產(chǎn)實(shí)際要求的技術(shù)和產(chǎn)品。本文利用納米孔測(cè)序技術(shù)對(duì)攜帶黃龍病菌葉片樣品的DNA進(jìn)行測(cè)序，并利用Blast、GraphMap、minimap2以及兩種bwa的比對(duì)方法將測(cè)序結(jié)果比對(duì)到黃龍病基因組上，比對(duì)結(jié)果均勻的比對(duì)到黃龍病菌基因組上，并未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的偏倚現(xiàn)象，驗(yàn)證了其測(cè)序結(jié)果的可靠性。隨著技術(shù)發(fā)展和產(chǎn)品成本的降低，可以為柑橘黃龍病的檢測(cè)診斷提供一種新的技術(shù)方案。由于本技術(shù)能夠一次性地對(duì)同一樣品中混和存在的不同物種基因信息進(jìn)行靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)識(shí)別，在未來(lái)的病蟲智能監(jiān)控系統(tǒng)中整合這一技術(shù)，對(duì)收集(如燈光誘集、機(jī)械吸取或掃網(wǎng)采集等)到的害蟲樣本進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)，以彌補(bǔ)因柑橘木虱蟲體過(guò)小或損壞難以進(jìn)行光學(xué)識(shí)別的不足，并可同時(shí)檢測(cè)蟲體是否攜帶有黃龍病菌，對(duì)有黃龍病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)但尚未有黃龍病實(shí)際發(fā)生的柑橘種植區(qū)提供實(shí)時(shí)實(shí)地的監(jiān)控與預(yù)警,同樣也可用于對(duì)其它危險(xiǎn)性入侵害蟲的監(jiān)控。