用于白蟻防治的聯(lián)苯菊酯微膠囊的制備及性能研究

馬英劍，孫金諾，錢 坤*，徐 維，呂 培，馮建國*

(1.揚州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥230036)

白蟻，屬節(jié)肢動物門昆蟲綱蜚蠊目，喜群居，生存能力強，會對人類生產(chǎn)和生活造成重要危害(權(quán)永兵等，2012)。白蟻蛀食多種大田作物、果樹林木和花卉種苗，造成減產(chǎn)乃至絕產(chǎn)。 破壞或損壞建筑物承重點，造成房屋突然倒塌，危害人類生命財產(chǎn)安全。 古往今來，素有“千里之堤，潰于蟻穴”之說，雨水充沛季節(jié)，大壩承受能力因白蟻蛀蝕而大幅減弱，容易造成決堤現(xiàn)象，給人們帶來巨大的災(zāi)難。

聯(lián)苯菊酯以觸殺和胃毒作用為主，是目前重要的白蟻防治藥劑之一(李新, 2016)。然而，其主要加工劑型是水乳劑、懸浮劑以及微囊懸浮劑，這些劑型都屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，生產(chǎn)和貯存過程中容易出現(xiàn)奧氏熟化、分層和沉淀等物理不穩(wěn)定問題，嚴(yán)重影響使用效果，且持效期短(史雅麗等, 2016; 華乃震, 2019)。此外，聯(lián)苯菊酯屬于中等毒性殺蟲劑，傳統(tǒng)劑型難以避免藥劑與人畜直接接觸，容易發(fā)生中毒現(xiàn)象(Sapkotaetal., 2020)。

微膠囊通過壁材對活性成分進(jìn)行包覆而獲得均勻的粉狀制劑，直接使用或者現(xiàn)場兌水稀釋使用，可以克服水乳劑和懸浮劑等物理穩(wěn)定性差的不足。此外，微膠囊能夠延長持效期，減少施藥量和施藥次數(shù)，既可以降低防治成本，又可以避免人畜中毒，符合未來農(nóng)藥劑型的發(fā)展方向(Liuetal., 2016; 閆曉靜等, 2019)。

本文在考察各工藝參數(shù)對微膠囊理化性能影響的基礎(chǔ)上，獲得了溶劑蒸發(fā)法制備聯(lián)苯菊酯微膠囊的優(yōu)化配方，并對微膠囊相關(guān)理化性能進(jìn)行表征，同時測試了微膠囊的生物活性和持效性，旨在為白蟻防治提供高效、安全的防治藥劑。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

原藥：96%聯(lián)苯菊酯，揚農(nóng)化工股份有限公司；乳化劑：Tween-80，壁材：乙基纖維素(粘度為40～100 mPa·s)，溶劑：二氯甲烷，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；25 g/L聯(lián)苯菊酯乳油，山東百農(nóng)思達(dá)生物科技有限公司；自制去離子水。

供試儀器：BSA型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；BT9300R激光粒度儀，丹東百特科技有限公司；S-4800冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立有限公司；FA25高剪切分散乳化機，上海弗魯克流體機械制造有限公司；RE-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市瑞德儀器設(shè)備有限公司；循環(huán)水式多用真空泵，上海大顏儀器設(shè)備有限公司。

供試試蟲：臺灣乳白蟻CoptotermesformosanusShiraki采自江蘇揚州，在實驗室內(nèi)以松木板飼養(yǎng)(27℃±1℃, RH 65%±5%, L ∶D=0 h ∶24 h)。試驗時挑取個體大小一致、活力較好的臺灣乳白蟻工蟻。

1.2 微膠囊制備

1)稱取0.4 g聯(lián)苯菊酯原藥溶于15 g二氯甲烷中，待原藥完全溶解后，在該溶液中加入0.6 g乙基纖維素，攪拌至完全溶解，得到透明溶液C。

2)稱取2.5 g Tween-80乳化劑溶解于去離子水，制成透明溶液D。

3)將透明溶液C和透明溶液D混合后經(jīng)高剪切(12 000 r/min)得到O/W乳狀液。

4)將步驟3)所得乳狀液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除其中的二氯甲烷，得到聯(lián)苯菊酯微膠囊的懸浮液。

5)將步驟4)得到的微膠囊懸浮液進(jìn)行離心(8 000 r/min, 15 min)、使用去離子水洗滌3次后進(jìn)行冷凍干燥，即可獲得聯(lián)苯菊酯微膠囊。

1.3 粒徑及跨距測定

將微膠囊分散在適量去離子水中制成懸浮液，超聲處理30 s后，在激光粒度儀上進(jìn)行粒徑和跨距測定，重復(fù)測定3次，取其平均值。其中，跨距大小是對樣品粒徑大小分布寬度的一種度量，跨距數(shù)值越小表示粒徑分散度越集中。

(1)

式中：D10表示樣品粒徑分布中占10%所對應(yīng)的粒徑；D50表示樣品粒徑分布中占50%所對應(yīng)的粒徑；D90表示樣品粒徑分布中占90%所對應(yīng)的粒徑。

1.4 光學(xué)顯微鏡(OM)觀察

取旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的微膠囊懸浮液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片后在光學(xué)顯微鏡下觀察其外觀形貌。

1.5 掃描電鏡(SEM)觀察

將充分干燥的聯(lián)苯菊酯微膠囊樣品固定在樣品臺上，經(jīng)真空干燥、噴金等操作后，置于掃描電鏡下進(jìn)行掃描觀察。

1.6 紅外光譜測定

將聯(lián)苯菊酯、乙基纖維素、乙基纖維素/聯(lián)苯菊酯混合物和聯(lián)苯菊酯微膠囊的樣品分別與溴化鉀粉末混合后壓片，使用紅外光譜儀進(jìn)行測定。

1.7 包封率和載藥量測定

通過高效液相色譜測定微膠囊的包封率和載藥量。色譜條件：Agilent SB-C18色譜柱(25 mm×4.6 mm×5 μm)，檢測波長：203 nm；柱溫：25 ℃；流動相：V(乙腈) ∶ V(水)=80 ∶ 20；流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：1 μL。最后按照公式(2)和(3)計算聯(lián)苯菊酯微膠囊包封率及載藥量。

(2)

(3)

1.8 微膠囊緩釋性能測定

采用透析袋法測定(Fanetal., 2014)。以乙醇和水的混合溶液(體積比為1 ∶1)作為釋放介質(zhì)。分別稱取相同質(zhì)量的聯(lián)苯菊酯原藥和微膠囊于盛有3 mL釋放介質(zhì)的透析袋中，將袋口密封后置于裝有30 mL釋放介質(zhì)的錐形瓶中，以200 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩。分別于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和12 h時取緩釋介質(zhì)1 mL；12 h后每間隔12 h取緩釋介質(zhì)1 mL，每次取樣后立即補充1 mL緩釋介質(zhì)。采用高效液相色譜法測定樣品中聯(lián)苯菊酯含量，最后繪制其累積釋放標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.9 生物測定

1.9.1毒力測定

采用濾紙片-藥膜法測定(鄒文娟和尹紅, 2009; 林雁等, 2014)。分別將市售聯(lián)苯菊酯乳油與制備的微膠囊用去離子水配成25、50、100、200、400、800 mg/L的藥液，移取1.2 mL該藥液滴加在濾紙(Ф90 mm)上，自然晾干后放入到干凈培養(yǎng)皿(Ф90 mm)內(nèi)。滴加1 mL去離子水，投入30頭工蟻，持續(xù)接觸。每濃度重復(fù)3次，設(shè)空白對照，觀察和記錄白蟻的死亡蟲數(shù)(死亡是指用鈍器輕觸其腹部，其身體所有部位均無反應(yīng))，試驗在27℃±1℃、黑暗條件下進(jìn)行，注意保持濾紙濕潤。

以藥液濃度的對數(shù)值為自變量X，以24 h的白蟻平均死亡率的機率值為因變量Y，計算毒力回歸方程，求出兩種制劑的LC50值。

1.9.2持效性實驗

取1.2 mL 800 mg/L聯(lián)苯菊酯微膠囊藥液滴于濾紙(Ф90 mm)上，待自然晾干后放入干凈培養(yǎng)皿中，滴加1 mL去離子水保持濕潤，放入30頭工蟻，按上述實驗條件在24 h后觀察工蟻的死亡情況，計算死亡率。在15 d時清理前期放入的全部試蟲，重新放入30頭健康工蟻，按上述方法觀察24 h后的死亡情況，計算死亡率。按同樣方法，調(diào)查在30 d和45 d時放入工蟻24 h后的死亡率。以市售聯(lián)苯菊酯乳油為對照藥劑，設(shè)置空白對照，每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

溶劑蒸發(fā)法制備微膠囊過程中，影響微膠囊理化性能的因素主要包括壁材用量、乳化劑用量和剪切時間(張省委等, 2019)。本實驗依據(jù)外觀形貌，平均粒徑、包封率和載藥量等對壁材用量、乳化劑用量和剪切時間等因素進(jìn)行篩選，從而獲得聯(lián)苯菊酯微膠囊的優(yōu)化配方。

2.1 不同因素對微膠囊粒徑大小和外觀形貌的影響

2.1.1芯壁比的影響

芯壁比是微膠囊配方中芯材和壁材的質(zhì)量比，能夠顯著影響溶劑蒸發(fā)法制備微膠囊的粒徑大小和外觀形貌(王寧等, 2017)。實驗中分別以芯壁比為1 ∶1、1 ∶1.25、1 ∶1.5、1 ∶1.75、1 ∶2制備微膠囊，考察芯壁比對微膠囊性能的影響。隨著芯壁比從1 ∶1降低到1 ∶2，尺寸分布(跨距)保持相對恒定，微膠囊粒徑從34.4 μm增加到192.6 μm(圖1-A)。光學(xué)顯微照片(圖1-B)也顯示出相同的規(guī)律，芯壁比較大，即壁材較少時，微膠囊粒徑小，成球不均一。隨著壁材用量增加，微膠囊粒徑分布變均勻。當(dāng)壁材用量過多時，囊壁厚度明顯增加，粒徑增大(李宏英等, 2019)，然而，由于增加了分散相粘度，使微膠囊容易發(fā)生粘連。而芯壁比為1 ∶1.5時，微膠囊大小分布較均勻，外觀形貌較好，未出現(xiàn)破碎和粘連情況，因此，芯壁比的選擇為1 ∶1.5。

圖1 芯壁比對微膠囊粒徑大小(A)和外觀形貌(B)的影響Fig.1 Influence of core wall ratio on microcapsule particle size (A) and appearance morphology (B)注：a，芯壁比為1 ∶1；b，芯壁比為1 ∶1.25；c，芯壁比為1 ∶1.5；d，芯壁比為1 ∶1.75；e，芯壁比為1 ∶2。Note: a, core-wall ratio of 1 ∶1; b, core-wall ratio of 1 ∶1.25; c, core-wall ratio of 1 ∶1.5; d, core-wall ratio of 1 ∶1.75; e, core-wall ratio of 1 ∶2.

2.1.2乳化劑用量的影響

乳化劑用量通過影響溶劑蒸發(fā)法中乳狀液液滴大小及穩(wěn)定而影響微膠囊的粒徑大小及外觀形貌(熊記等, 2018)。實驗中以3%、5%、7%的用量制備微膠囊，通過測量粒徑大小以及微膠囊外觀形貌來確定乳化劑的最佳用量。隨著Tween-80用量從3%增加到7%時，微膠囊平均粒徑從235 μm減小到97.6 μm，跨距從1.90減小到1.73(圖2-A)。圖2-B結(jié)果表明，乳化劑用量較低(3%)時，微膠囊粒徑較大，容易粘連，部分微膠囊出現(xiàn)破損，當(dāng)乳化劑用量增大到7%時，微膠囊呈規(guī)則球形，表面光滑，平均粒徑最小，且分布較窄，這與粒徑測定結(jié)果一致。原因可能是乳化劑用量較少時，乳化劑分子無法完全覆蓋液滴表面，容易出現(xiàn)液滴合并變大以及相互粘連的現(xiàn)象，而用量較多時有利于乳化劑分子在油水界面形成致密吸附，從而保證液滴均勻分散，獲得粒徑更小的微膠囊(王安琪等, 2018)。因此，最佳乳化劑用量為7%。

圖2 乳化劑用量對微膠囊粒徑大小(A)和外觀形貌(B)的影響Fig.2 Influence of emulsifier dosage on microcapsule particle size (A) and appearance morphology (B)注：a，乳化劑用量為3%；b，乳化劑用量為5%；c，乳化劑用量為7%。Note: a, emulsifier dosage of 3%; b, emulsifier dosage of 5%; c, emulsifier dosage of 7%.

圖3 剪切時間對微膠囊粒徑大小(A)和外觀形貌(B)的影響Fig.3 Influence of shear time on microcapsule particle size (A) and appearance morphology (B)注：a，剪切時間為4 min；b，剪切時間為6 min；c，剪切時間為8 min。Note: a, shear time of 4 min; b, shear time of 6 min; c, shear time of 8 min.

2.1.3剪切時間對微膠囊的影響

剪切時間是影響乳狀液形成及穩(wěn)定的重要因素，而乳狀液的穩(wěn)定又與微膠囊粒徑大小及外觀形貌密切相關(guān)(梁井瑞等, 2019)。實驗中將剪切速率固定為12 000 r/min，對剪切時間進(jìn)行篩選。圖3-A是固定轉(zhuǎn)速(12000 r/min)下，剪切時間對微膠囊粒徑大小及跨距的影響。隨著剪切時間增加，粒徑和跨距均是先減小后增大。光學(xué)顯微照片(圖3-B)可以顯示出，乳化時間為4 min時，形成的液滴數(shù)量少，且粒徑較大；乳化時間為8 min時，微膠囊出現(xiàn)破裂現(xiàn)象。而乳化時間為6 min時，微膠囊大小均勻，外觀呈規(guī)則球形，這也與粒徑測定結(jié)果相吻合。劉潤峰等(2016)在制備毒死蜱微膠囊發(fā)現(xiàn)相同的規(guī)律。原因可能是剪切時間太短，無法在剪切過程中提供足夠的能量以便形成較小的液滴。相反，剪切時間過長會使溶劑過量揮發(fā)而造成表面未固化的微膠囊相互聚結(jié)變大，也會使部分微膠囊破碎而出現(xiàn)乙基纖維素碎片，導(dǎo)致微膠囊粒徑增大。因此，確定剪切時間為6 min。

2.2 不同因素對包封率和載藥量的影響

包封率和載藥量是微膠囊性能的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)，對評價微膠囊制備方法優(yōu)劣具有重要參考價值(龔圣等, 2018)。實驗中分別設(shè)置了不同芯壁比(樣品1～5)，不同乳化劑用量(樣品3、6、7)和不同剪切時間(樣品3、8、9)制備微膠囊，考察以上因素對包封率和載藥量的影響。表1是采用不同工藝制備的聯(lián)苯菊酯微膠囊的包封率和載藥量。隨著芯壁比減小(樣品1～5)，包封率逐漸增大，載藥量逐漸減少。這可能是由于芯壁比較大時，壁材少，芯材不能被完全包覆，同時芯材濃度高時，容易向水相擴(kuò)散，導(dǎo)致包封率降低(韋佩彪等, 2020)。當(dāng)乳化劑用量從3%增加到7%時(樣品3、6、7)，包封率和載藥量均增大，這是由于乳化劑用量較低時，液滴周圍界面膜強度低，溶劑揮發(fā)過程中，微膠囊容易破裂，芯材外漏，包封率和載藥量降低(楊斌等, 2018)。隨著乳化劑用量增大，液滴周圍界面膜強度增加，避免了芯材流失，從而使微膠囊具有更高的包封率和載藥量。當(dāng)剪切時間不同時(樣品3、8、9)，微膠囊的包封率和載藥量不同，隨著剪切時間增加，液滴可以更好分散在介質(zhì)中，同時加快二氯甲烷揮發(fā)，減少芯材向水相擴(kuò)散，所以包封率和載藥量增加。但當(dāng)剪切時間過長(8 min)時，微膠囊容易出現(xiàn)破損，造成芯材流失，從而導(dǎo)致包封率和載藥量減少(張微等, 2017)。

綜合粒徑大小、外觀形貌以及包封率和載藥量的測定結(jié)果，芯壁比為1 ∶1.5，乳化劑用量為7%，剪切時間為6 min時，獲得的微膠囊形狀大小均勻，無破裂粘連現(xiàn)象，且具有較高包封率和載藥量，為最佳制備工藝。

表1 不同工藝制備的聯(lián)苯菊酯微膠囊的包封率和載藥量

2.3 微膠囊的微觀形貌

微膠囊表面的細(xì)微結(jié)構(gòu)能夠影響囊芯物的釋放，是評價微膠囊理化性能的重要指標(biāo)(馮建國等, 2011)。實驗中通過SEM對最佳制備工藝獲得的聯(lián)苯菊酯微膠囊外觀形貌進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4所示。微膠囊形狀規(guī)則，大小均勻，結(jié)構(gòu)完整，這與光學(xué)顯微鏡下所觀察的結(jié)果一致。進(jìn)一步放大倍數(shù)觀察(見圖4-b)，微膠囊表面無原藥晶體吸附，且表面微孔較多，這有利于聯(lián)苯菊酯的釋放，從而獲得更好的殺滅效果。

圖4 聯(lián)苯菊酯微膠囊的SEM照片F(xiàn)ig.4 SEM photographs of bifenthrin microcapsules

2.4 紅外光譜分析

圖5 樣品的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrogram of the samples注：a，聯(lián)苯菊酯原藥；b，乙基纖維素；c，聯(lián)苯菊酯原藥+乙基纖維素混合物；d，聯(lián)苯菊酯微膠囊。Note: a, technical bifenthrin; b, ethyl cellulose; c, technical bifenthrin+ethyl cellulose mixture; d, microcapsule sample.

2.5 微膠囊釋放性能

最佳制備工藝獲得的聯(lián)苯菊酯微膠囊和原藥在釋放介質(zhì)(乙醇-水的體積比1 ∶1)中的累計釋放曲線見圖6。與原藥相比，聯(lián)苯菊酯微膠囊具有更好的緩釋性能。進(jìn)一步通過零級動力學(xué)模型、一級動力學(xué)模型、Higuchi模型和Ritger-peppas模型進(jìn)行動力學(xué)模型擬合(見表2)，結(jié)果表明：擬合程度最高的是Ritger-peppas模型(lgQ=lgk+nlgt)，式中，Q為任意時刻藥物的釋放分?jǐn)?shù)；k為動力學(xué)參數(shù)；t為釋放時間；n為藥物的擴(kuò)散指數(shù)，n值大小代表藥物不同的釋放機制(馮建國等, 2017)。當(dāng)n≤0.43時，主要為Fickian擴(kuò)散；當(dāng)0.43

圖6 聯(lián)苯菊酯微膠囊與原藥在釋放介質(zhì)中的累積釋放曲線Fig.6 Cumulative release curve of bifenthrin microcapsule and technical bifenthrin in release medium

表2 不同動力學(xué)模型擬合結(jié)果

2.6 生物測定

2.6.1毒力測定

以市售的聯(lián)苯菊酯乳油為對照，通過藥膜法測定最佳制備工藝獲得的聯(lián)苯菊酯微膠囊對臺灣乳白蟻的毒力。供試蟻與藥膜連續(xù)接觸24 h后，25 g/L聯(lián)苯菊酯乳油對臺灣乳白蟻的LC50為144.2 mg/L，聯(lián)苯菊酯微膠囊的LC50為174.9 mg/L，兩者對臺灣乳白蟻的滅殺效果相當(dāng)。運用LSD顯著性差異分析，乳油與微膠囊無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 聯(lián)苯菊酯兩種制劑對臺灣乳白蟻觸殺毒力的致死中濃度

2.6.2持效性實驗

通過兩種制劑對臺灣乳白蟻的持效性實驗結(jié)果來看(圖7)，施藥后的0和15 d，二者的殺滅效果相差不多，但與乳油相比，微膠囊的持效期更長，施藥后30 d在培養(yǎng)皿中重新放入白蟻，24 h后平均死亡率仍高達(dá)78.9%，顯著高于對照乳油處理后的平均死亡率(57.8%)。施藥后45 d后，乳油處理后的白蟻死亡率下降到50%以下，而微膠囊處理后的平均死亡率仍在70%以上。

圖7 聯(lián)苯菊酯兩種制劑對臺灣乳白蟻的持效性Fig.7 Long-lasting effect of bifenthrin formulations against Coptotermes formosanus Shiraki

3 結(jié)論與討論

白蟻是地球上最古老的社會性昆蟲之一，在進(jìn)化過程中獲得了獨特的生存和繁衍能力，幾乎占領(lǐng)了熱帶、亞熱帶的各個角落，其危害面積約占世界陸地總面積的一半。我國也是白蟻危害嚴(yán)重的國家之一，其中40%陸地均有分布(林雁, 2015)。近年來，隨著白蟻活動范圍的不斷擴(kuò)大，其對人類生產(chǎn)和生活造成的危害明顯加重。目前，白蟻防治方法主要包括物理防治、生物防治和化學(xué)防治等。綜合考慮操作難度、用戶體驗、時間成本和防治效果等，化學(xué)防治仍是白蟻防治最有效的途徑(劉曉燕和鐘國華, 2019)。截止2020年8月，通過農(nóng)業(yè)農(nóng)村部登記的用于白蟻防治的殺蟲劑品種主要包括聯(lián)苯菊酯，吡蟲啉，氟蟲腈和毒死蜱等，其中，聯(lián)苯菊酯是白蟻防治的主流藥劑(張曉杰等, 2017)，常規(guī)加工劑型為懸浮劑(25個)，水乳劑(13個)，乳油(12個)，粉劑(7個)和餌劑(3個)，但是在應(yīng)用過程中容易出現(xiàn)產(chǎn)品物理穩(wěn)定性差和持效期短等問題。此外，聯(lián)苯菊酯潛在的生物富集效應(yīng)對水生環(huán)境造成不可接受的風(fēng)險，傳統(tǒng)加工劑型也難以消除這些弊端。

微膠囊技術(shù)通過壁材對農(nóng)藥有效成分進(jìn)行包覆，具有減少有效成分降解和揮發(fā)，緩慢釋放，延長持續(xù)期，降低對非靶標(biāo)生物毒性等優(yōu)勢，符合高效、低毒、持久、環(huán)保的白蟻預(yù)防理念(金占寶和趙興華, 2012；朱艷燕, 2013)。盡管當(dāng)前在白蟻防治中也有微囊懸浮劑產(chǎn)品登記使用，但是與常規(guī)劑型相比數(shù)量有限。此外，針對白蟻防治藥劑微囊化的研究并不多，且主要集中于藥效試驗，缺乏微膠囊制備技術(shù)的深入研究，這在一定程度上限制了微囊化技術(shù)在白蟻防治中的推廣使用。本文采用溶劑蒸發(fā)法成功制備了聯(lián)苯菊酯微膠囊，與市售乳油制劑相比，兩者對臺灣乳白蟻的毒力相近，但微膠囊具有優(yōu)異的持效性，為安全、高效防治白蟻提供了技術(shù)手段，也為農(nóng)藥微膠囊的制備技術(shù)提供了一定的理論參考。