球孢白僵菌對黃瓜代謝產物及西花薊馬取食行為的影響

張 妍，王子豪，李凱月，王俊平

(青島農業(yè)大學植物醫(yī)學學院，山東青島 266000)

球孢白僵菌是一種廣泛用于農林害蟲生物防治的昆蟲病原真菌，同時球孢白僵菌對植物的生長具有促進作用，并且能提高植物的抗病性(隋麗等, 2018)。在煙草上接種球孢白僵菌后，煙蚜的死亡率在第4～5天達到死亡高峰，對煙草植株上的煙蚜具有較強的致病侵染力(徐繼偉等, 2019)。在研究中還發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌處理植物可提高植物的防御能力，降低害蟲對其危害程度，球孢白僵菌處理玉米和高粱后，發(fā)現(xiàn)兩種植物中棉鈴蟲Helicoverpaarmigera蛀食減少，并且未在植株上觀察到白僵菌引起的傷害(Cherryetal., 1999; Reddyetal., 2009)；隨后發(fā)現(xiàn)用球孢白僵菌接種的番茄和棉花飼喂棉鈴蟲，棉鈴蟲死亡率高于對照組(Powelletal., 2009; Lopez and Gregory, 2015)，并且球孢白僵菌可促進植物的生長(Lopez and Gregory, 2015)。球孢白僵菌處理罌粟和香蕉后可減少鉆蛀性害蟲罌粟抗莖癭蜂和香蕉莖象甲Cosmopolitessordidus的危害(Akelloetal., 2008; Quesadaetal., 2009)。除球孢白僵菌處理植物就有抗蟲能力以外，其他真菌也有相似的功能，頂孢霉Acremoniumhansfordii接種蠶豆后飼喂棉鈴蟲其死亡率高于對照組，發(fā)現(xiàn)了還可延長棉鈴蟲的生長周期(Jaberetal., 2010)。

本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌灌根處理黃瓜后，西花薊馬對葉片危害面積顯著低于對照組，但是未見針對這一問題的相關研究。為了探討該現(xiàn)象出現(xiàn)的原因，采用球孢白僵菌對黃瓜進行灌根，以確定處理過的黃瓜植株體內幾種防御酶、次生代謝物、可溶性蛋白的含量變化；并利用EPG技術分析西花薊馬在黃瓜上的取食行為，以期為進一步利用球孢白僵菌防控西花薊馬提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

西花薊馬種群在室內以蕓豆為食物連續(xù)飼養(yǎng)120代以上，飼養(yǎng)條件為溫度27℃±1℃，相對濕度75%±5%，光周期L ∶D=16 ∶8；從僵蠶上分離純化獲得球孢白僵菌菌株Bb33A (KU517852)，保存于青島農業(yè)大學昆蟲生理生態(tài)研究室；黃瓜種子(津研四號)，基質(草炭土 ∶蛭石 ∶珍珠巖=1 ∶1 ∶1)，購于青島德地得農化服務有限公司；直流刺吸電位儀(Direct current electrical penetration graph, DC-EPG)。

1.2 球孢白僵菌的培養(yǎng)和分生孢子液的制備

1.2.1球孢白僵菌的培養(yǎng)

參考張志建等(2017)方法將球孢白僵菌在SDAY培養(yǎng)基上于25℃，光照L ∶D=10 ∶14的條件下培養(yǎng)7 d，無菌棒刮取分生孢子粉于1.5 mL Eppendorf管中(張志建等, 2017)。

1.2.2球孢白僵菌分生孢子液的制備

將球孢白僵菌溶于0.05% Tween-80中，并以0.05% Tween-80、無菌水作為對照。在渦旋震蕩器上震蕩10 min，使白僵菌孢子充分分散。梯度稀釋至適宜濃度，用血球計數(shù)板在顯微鏡下統(tǒng)計溶液中的孢子數(shù)量，每株菌株觀察5個視野。重復 3次，分生孢子終濃度為1×108和1×109spores/mL。

1.3 球孢白僵菌灌根處理黃瓜

大小均勻飽滿的黃瓜種子浸于水中6 h，將其栽種到花盆中。栽培7 d后將50 mL無菌水、0.05% Tween-80溶液和球孢白僵菌分生孢子溶液(濃度分別為1×108spores/mL和1×109spores/mL)，分別倒入生長一致的黃瓜幼苗中，于25℃，光照L ∶D=16 h ∶8 h下培養(yǎng)7 d。

1.4 西花薊馬對黃瓜為害

將15頭西花薊馬初孵雌成蟲接于栽培7 d后的黃瓜苗上，24 h后移除西花薊馬，處理后第4，5，6，7天記錄西花薊馬成蟲和幼蟲數(shù)量，17 d后進行為害葉片拍照，每處理重復5次，利用使用Image J軟件對葉片危害面積進行分析。

1.5 球孢白僵菌處理的黃瓜葉片物質測定

1.5.1丙二醛MDA、可溶性蛋白含量、CAT、POD和SOD活性測定

丙二醛MDA、可溶性蛋白含量、CAT、POD和SOD活性測定分別用蘇州科銘生物技術有限公司的MDA-1-Y丙二醛(MDA)試劑盒、KMSP-1-W考馬斯亮藍法蛋白含量測試盒、CAT-1-Y過氧化氫酶(CAT)試劑盒(紫外吸收法)、POD-1-Y過氧化物酶(POD)試劑盒和SOD-1-Y超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(NBT法)進行測定。取處理后第7天和第14天的黃瓜葉片，嚴格按照試劑盒中方法提取待測物質，然后進行相關指標測定，每處理均重復3次。

1.5.2次生代謝物質類黃酮和單寧含量測定

類黃酮和單寧的含量分別用LHT-1-G植物類黃酮測試盒和DN-1-Y單寧含量試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司生產)進行測定。取處理后第7、9、11、13和15天取黃瓜葉片，按照相關說明書要求提取待測物質后進行含量測定，每處理均重復3次。

1.6 刺吸電位波形EPG分析

對經球孢白僵菌(1×108spores/mL)處理后7 d的黃瓜幼苗進行EPG分析，采用具有八通道EPG刺吸電位儀(DC-EPG型)進行取食行為觀察(胡想順等, 2006; 張玉秀等, 2014)。首先將西花薊馬成蟲置于冰袋上，然后用銀膠將金絲線粘合在其背板上；待銀膠干后，將薊馬置于平面上自由活動1 h，使其適應背部粘合金線的狀態(tài)。然后，將長約10 cm的銅質棒狀植物電極插人植株盆栽土壤中，再將粘好薊馬的銅釘插人對應的插槽內，薊馬置于供試植株頂端第2片真葉的葉面上，使其可以相對自由地活動。整個試驗置于80 cm×70 cm×80 cm的金屬籠中，以避免噪音干擾，試驗條件為溫度(27±1)℃，相對濕度75%±5%。采用軟件Stylet對西花薊馬取食行為進行記錄。

1.7 數(shù)據處理與分析

采用Microsoft Excel 2016對試驗數(shù)據進行統(tǒng)計，并以平均值±標準偏差表示。通過SPSS 20.0軟件進行方差和Duncan氏多重比較差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 西花薊馬對根施球孢白僵菌黃瓜上為害的情況

在處理后不同時間點檢查各處理黃瓜葉片上西花薊馬的數(shù)量，結果表明，各時間點兩個濃度球孢白僵菌處理與對照組黃瓜上的西花薊馬數(shù)量差異不顯著(圖1)，但是該蟲在球孢白僵菌處理的黃瓜葉上的危害面積明顯低于對照組，但兩個分生孢子濃度處理后的黃瓜葉片上西花薊馬的危害面積無明顯差異(圖2和圖3)。

圖1 西花薊馬在黃瓜葉片上的蟲口數(shù)量Fig.1 Insect population of Frankliniella occidentalis on cucumber leaves注：柱狀圖中小寫字母表示組間差異顯著性(P<0.05)，相同小寫字母表示組間差異不顯著，不同小寫字母表示組間差異顯著，各值為均值。下圖同。Note: In the histogram, different small letters indicated significant differences between groups (P<0.05), same small letters indicated no significant differences between groups and each value was the mean value.The same below.

2.2 黃瓜葉片MDA和可溶性蛋白的變化

球孢白僵菌分生孢子處理7 d和14 d后，黃瓜葉片的MDA含量顯著低于對照組，并且差異顯著，而可溶性蛋白含量顯著高于對照組(圖4)；球孢白僵菌分生孢子處理的黃瓜葉片內MDA和可溶性蛋白的含量隨分生孢子濃度增加無顯著變化(圖5)。

2.3 黃瓜葉片SOD、POD和CAT的變化

經球孢白僵菌處理黃瓜7 d和14 d，葉片中SOD、POD和CAT的活性高于對照組(圖6)；但是不同濃度的球孢白僵菌分生孢子處理黃瓜后，在相同處理時間上SOD和POD活性無明顯差異，而CAT的活性隨著球孢白僵菌分生孢子濃度的增加而提高。1×109spores/mL球孢白僵菌分生孢子處理黃瓜14 d后SOD和POD最高值為212.5661 U/g和4 400 U/g，分別是對照組水的1.33倍和1.09倍。1×108spores/mL和1×109spores/mL球孢白僵菌分生孢子處理黃瓜14 d后CAT活性達到最高值為0.4886 U/g和0.5275 U/g，分別是對照組水的1.25倍和1.34倍的。

圖2 西花薊馬對黃瓜葉片的危害Fig.2 Damage of cucumber leaf with Frankliniella occidentalis注：a，對照；b，吐溫80；c，1×108 孢子/mL；d，1×109 孢子/mL。Note: a, control; b,tween-80; c, 1×108 spores/mL; d, 1×109 spores/mL.

圖3 西花薊馬對黃瓜葉片危害面積Fig.3 Damage area of Frankliniella occidentalis to cucumber leaves

圖4 球孢白僵菌處理后黃瓜中MDA含量變化Fig.4 Changes of MDA content in cucumber treated with Beauveria bassiana

圖5 球孢白僵菌處理黃瓜后后對可溶性蛋白的變化Fig.5 Changes of soluble protein in cucumber treated with Beauveria bassiana

2.4 黃瓜葉片中類黃酮和單寧含量

經球孢白僵菌處理黃瓜7 d和15 d后，葉片類黃酮的含量明顯高于對照組，而單寧含量與對照組無明顯差異(圖7和圖8)。分生孢子濃度從1×108spores/mL提高到1×109spores/mL時，黃瓜葉片中類黃酮的含量也隨之增加，在7 d含量分別為57.42 mg/g和43.56 mg/g，13 d達到最大值(74.76 mg/g和70.88 mg/g)，之后含量下降(圖7)。

2.5 西花薊馬EPG取食行為分析

經球孢白僵菌處理黃瓜7 d后，西花薊馬第一刺探的持續(xù)時間、長取食次數(shù)、R波總持續(xù)時間以及平均取食時間分別為0.23 s、10.5 s、7 666.51 s和86.72 s，明顯低于兩個對照組，但是從EPG開始到第一次刺探的時間為228.67 s，明顯高于兩個對照組。

圖6.1 球孢白僵菌處理黃瓜后SOD的變化Fig.6.1 Changes of SOD in cucumber after Beauveria bassiana treatment

圖6.2 球孢白僵菌處理黃瓜后POD的變化Fig.6.2 Changes of POD in cucumber after Beauveria bassiana treatment

圖6.3 球孢白僵菌處理黃瓜后CAT的變化Fig.6.3 Changes of CAT in cucumber after Beauveria bassiana treatment

圖7 黃瓜經不同濃度球孢白僵菌處理后類黃酮含量變化Fig.7 Changes of flavonoids content in cucumber treated with Beauveria bassiana

圖8黃瓜經不同濃度球孢白僵菌處理后單寧含量變化Fig.8 Change of tannin content in cucumber treated with Beauveria bassiana

表1 球孢白僵菌處理黃瓜后西花薊馬在葉片上取食行為(Mean±SE)

3 結論與討論

西花薊馬取食經球孢白僵菌處理的黃瓜葉片，西花薊馬的數(shù)量和繁殖能力并無明顯差異，但西花薊馬對黃瓜葉片的危害面積是降低的。本研究發(fā)現(xiàn)經球孢白僵菌處理的黃瓜葉片中可溶性蛋白、SOD、CAT、POD及類黃酮的含量上升，而MDA的含量呈現(xiàn)下降趨勢，單寧含量則無明顯變化。

植物體內氧化酶濃度的提升，次生代謝物的產生，或通過誘導植物的間接系統(tǒng)防御反應從而對昆蟲的取食產生抗性(秦秋菊和高希武, 2005)。棉花接種球孢白僵菌和內生淡紫擬青霉菌后對其生長有促進作用，同時對棉鈴蟲的存活和發(fā)育有毒害作用(Lopezetal., 2015)。番茄幼苗接種球孢白僵菌后，番茄幼苗根部的PAL、POD、PPO、SOD活性均高于對照，可溶性蛋白的含量也顯著增加，對番茄根結線蟲病害具有較好的防治效果(陳增齊等, 2009)。本研究也發(fā)現(xiàn)黃瓜經球孢白僵菌菌株處理后，葉片SOD、POD、CAT的活性和可溶性蛋白含量高于對照組。同時研究中還發(fā)現(xiàn)施用球孢白僵菌的黃瓜葉片中的MDA含量呈現(xiàn)下降趨勢。MDA用來衡量膜脂過氧化程度的強弱，MDA含量多，則細胞膜流動性下降，膜功能受到損傷(Ariasetal., 2005)，因此MDA含量降低的同時，細胞膜的耐氧化程度提高。植物體內類黃酮的含量與植物的抗蟲性呈正相關關系，其含量越高，美國白蛾對植株的取食量越低(李路莎等, 2018)。本研究也發(fā)現(xiàn)黃瓜經球孢白僵菌菌株處理后，葉片類黃酮活性高于對照組。綜合分析本試驗和已有研究結果，推斷球孢白僵菌處理黃瓜體內相關物質的變化是西花薊馬對其葉片的危害面積低于對照組的原因。

采用EPG技術對西花薊馬在不同處理的黃瓜上的刺探行為進行分析，西花薊馬在取食期間產生了6種不同的波形，分別是非刺探波(np波)、上顎口針刺入波(P波)、上顎口針重復刺吸波(S波)、下顎口針刺入(Q波)、細胞內取食波(R波)、不規(guī)則波形(X波)(Kindtetal., 2003)。并且西花薊馬在取食中的細胞內取食波(R波)與蚜蟲取食中的韌皮部取食波(E2波)具有相似的生物學功能。麥長管蚜Sitobionavenae在吡蟲啉、噻蟲嗪、呋蟲胺和吡蚜酮等藥劑處理下的E2波的總持續(xù)時間明顯低于對照組(彭建紅, 2018)；禾縊管蚜Rhopalosiphumpadi和苜蓿斑蚜Theriaphistrifolii在抗性品種上E2波的總持續(xù)時間明顯低于抗性小的品種(Beantetal., 2020; 周雪飛等, 2020)；說明E2波的總持續(xù)時間與寄主對昆蟲取食抵抗能力相關。西花薊馬需對寄主進行表面物質識別，進而完成取食的下一步的“刺探”。本試驗研究發(fā)現(xiàn)西花薊馬在接種球孢白僵菌的黃瓜上從EPG開始到第一次刺探時間為228.67 s，而在清水處理黃瓜上的時間為4.9 s，表明西花薊馬對接種球孢白僵菌的黃瓜選擇性傾向低于對照組。而西花薊馬在接種球孢白僵菌的黃瓜上第一次刺探的持續(xù)時間、R波的總持續(xù)時間、長取食次數(shù)以及平均取食時間均低于對照組，表明了西花薊馬對接種球孢白僵菌的黃瓜取食量低，反映出西花薊馬在對寄主植物分析完成后會對取食策略進行了調整。

綜上所述，黃瓜植株接種球孢白僵菌后，黃瓜體內相關物質的變化，造成西花薊馬取食行為的改變，并且其對黃瓜葉片危害下降，使其具有一定的抗蟲性，為提高植物的抗蟲性提供了理論依據。