RNAi分析舞毒蛾谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因?qū)S酮和槲皮素脅迫響應(yīng)

齊 琪，孫麗麗，許力山，曹傳旺，2*

(1. 東北林業(yè)大學林學院，哈爾濱 150040；2. 東北林業(yè)大學森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

近年來，植物與昆蟲間的相互作用逐漸成為研究新熱點(Howe and Herde, 2015)。植物主要是通過產(chǎn)生化學物質(zhì)，尤其是次生代謝物質(zhì)來抵御昆蟲取食等脅迫，從而影響昆蟲取食行為，影響昆蟲生長發(fā)育，而昆蟲則通過改變體內(nèi)解毒酶活性來減少次生物質(zhì)對其影響(張永清, 1991; Heil, 2008; Royetal., 2016)。植物次生代謝物質(zhì)主要包括黃酮類、萜類和生物堿類化合物(高微微等, 2006; Constabel and Lindroth, 2009；郭映雪和孫墨瓏，2020)。黃酮和蘆丁是楊樹Populus等植物主要的次生代謝物，均屬于黃酮類化合物，對斜紋夜蛾Spodopteralitura、蘋果棉蚜Eriosomalanigerum、南方灰翅夜蛾Chrysodeixiseriosoma、桃蚜Myzuspersicae、美國白蛾Hyphantriacunea等多種農(nóng)林害蟲均有抑制生長發(fā)育或毒殺作用(Lindroth and Peterson, 1988; Ateyyatetal., 2012; Suetal., 2017; 劉鵬, 2018; 王沫等, 2020)。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase, GST)是一類多功能超家族酶系，廣泛分布在動植物、昆蟲以及微生物體內(nèi)(Danieletal., 2008)，根據(jù)GST的功能、編碼基因相似度、組織形式和生化特性，昆蟲體內(nèi)的GSTs可分為Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta和Zeta6個家族(Kettermanetal., 2011)。GST主要通過催化谷胱甘肽的疏基與有毒的親電、疏水底物發(fā)生共價軛合反應(yīng)(Nerinoetal., 2009)，從而參與昆蟲體內(nèi)多種解毒代謝過程。不同種類的次生代謝物可誘導不同GST程度上調(diào)。Zhang等(2012)發(fā)現(xiàn)槲皮素誘導家蠶Bombyxmori體內(nèi)GST活性最高為對照的4.1倍(Zhangetal.,2012)。Zou等(2016)發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾幼蟲SlGSTe1能被芥菜Brassicajuncea中的次生物質(zhì)吲哚-3-甲醇誘導上調(diào)(Zouetal., 2016)，Abdallah等(2019)從龍葵Solanumnigrum和紅果龍葵Solanumvillosum等茄屬植物中提取的糖苷生物堿可導致馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata死亡，抑制了馬鈴薯甲蟲GST活性(Abdallahetal., 2019)。Yuan等(2020)發(fā)現(xiàn)單寧酸可引起美國白蛾幼蟲GST活性高于對照組，說明單寧酸介導的GST解毒酶在美國白蛾解毒過程中起著關(guān)鍵作用(Yuanetal., 2020)。

舞毒蛾Lymantriadispar屬鱗翅目Lepidoptera毒蛾科Liparidae毒蛾屬Lymantria是一種危害多種林木的世界性害蟲。據(jù)報道，舞毒蛾可以取食500多種植物(Lazarevieetal., 1998; Robertetal., 2014)。通過前期研究，對舞毒蛾取食咖啡酸、水楊素、蘆丁、槲皮素、兒茶酚、黃酮等6種次生代謝物，對LdGSTe4、LdGSTe2等13個GSTs候選基因的功能進行了初步研究，證明LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1基因參與了舞毒蛾對植物次生物質(zhì)解毒代謝過程(Maetal., 2021)。因此，本文在前期研究基礎(chǔ)上，利用RNAi介導技術(shù)進一步探討舞毒蛾LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1基因的生理功能以及對黃酮、槲皮素等楊樹次生物質(zhì)的響應(yīng)機制，為舞毒蛾對植物次生物質(zhì)的適應(yīng)性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試昆蟲

舞毒蛾卵塊和人工飼料均購于中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)與環(huán)境保護研究所。幼蟲孵出后置于人工氣候箱(溫度25℃、光周期14 L ∶10 D、相對濕度70%)飼養(yǎng)。挑選健康、活潑、大小一致的舞毒蛾3齡幼蟲作為供試昆蟲。

1.1.2供試藥劑

黃酮(Flavone)購自Amresco公司，純度為99.0%；槲皮素(Quercetin)購自Scientific Instrument公司，純度為97.0%。

1.2 RNAi分析

采用RNeasy Mini動物組織RNA提取試劑盒(Qiagen)提取舞毒蛾3齡幼蟲的總RNA。通過分析和比對舞毒蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計并合成CDS序列引物，以PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)合成的cDNA第1鏈為模板進行RT-PCR。將合成的cDNA使用RNase Free ddH2O稀釋10倍，作為基因克隆和熒光定量RT-qPCR的模板，采用含有T7啟動子序列的引物(表1)擴增靶基因的cDNA片段。PCR反應(yīng)體系為：目的基因質(zhì)粒2.5 μL，10×buffer(含Mg2+)5 μL，引物Primer-F/ Primer-R(10 μM)各2.5 μL，dNTPs(2.5 mM)1 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)1 μL，DEPC水補足至50 μL。PCR的反應(yīng)條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和切膠回收純化后作為合成dsRNA的模板，并使用MEGAscript RNAi試劑盒(Ambion)進行dsRNA的合成，經(jīng)電泳檢測并測定濃度，稀釋至1 000 ng/μL，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選取健康、活潑的舞毒蛾3齡幼蟲，使用顯微注射器將1.0 μL (1 μg/μL)LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2、LdGSTz1的dsRNA分別注射到幼蟲腹部倒數(shù)第2腹節(jié)間膜位置，以注射等量的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的dsRNA作為對照組。每個處理注射10頭幼蟲，重復3次。處理后48 h隨機挑取活潑的舞毒蛾3齡幼蟲，經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于GSTs基因沉默效率的檢測。

1.3 LdGSTs基因沉默效率檢測

采用實時熒光定量RT-PCR的方法檢測LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1基因的表達量。引物采用Primer 5.0軟件按照RT-qPCR要求進行設(shè)計。反應(yīng)體系為：10 μL 2×SYBR premix Ex Taq酶，l μL Primer mix (10 μmol /L)，2 μL cDNA，7 μL DEPC水，總體積20 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性12 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，81℃讀板1 s，45個循環(huán)，每個樣品重復3次。GSTs基因的熒光定量引物(Maetal., 2021)以及內(nèi)參Actin、EF1a、TUB基因引物序列(Yinetal., 2020)如表1。

表1 合成dsRNA和RTq-PCR所用引物

1.4 GSTs基因沉默對舞毒蛾幼蟲生長發(fā)育影響檢測

稱取注射dsRNA舞毒蛾3齡幼蟲的鮮重，待取食人工飼料120 h后，將幼蟲、取食后的飼料及糞便放入烘箱，50℃烘干24 h，再升溫至120℃溫烘至恒重，稱取幼蟲、糞便及飼料干重，每個處理20頭，重復3次。另取剛蛻皮的30頭舞毒蛾3齡幼蟲饑餓24 h后稱重，并取新鮮人工飼料稱重，按上述方法烘烤至恒重測定其干重, 以計算試前幼蟲和飼料的干濕比；計算幼蟲體重、存活率和營養(yǎng)指標。依據(jù)Waldbauer(1964)方法計算各營養(yǎng)指標(Waldbauer, 1964)。相對生長率(RGR)=(D-C)/((C+D)/ 2)×100%；相對取食量(RCR)=(A-B)/((C+D)/ 2)×100%；食物利用率(ECI)=(D-C)/(A-B)×100%；食物轉(zhuǎn)化率(ECD)=(D-C)/(A-B-E)×100%；近似消化率(AD)=(A-B-E)/(A-B)×100%。式中：A為試驗前的飼料干質(zhì)量；B為試驗后的飼料干質(zhì)量；C為試驗前的幼蟲干質(zhì)量；D為試驗后的幼蟲干質(zhì)量；E為幼蟲的糞便干質(zhì)量。

1.5 GSTs基因沉默的舞毒蛾幼蟲對次生物質(zhì)敏感性

為鑒定LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1基因是否參與舞毒蛾對次生物質(zhì)的響應(yīng)，使用含有次生物質(zhì)0.8%黃酮(w/w)和0.02%槲皮素(w/w)的人工飼料分別飼喂注射GSTsdsRNA或dsGFP舞毒蛾3齡幼蟲。對照組人工飼料中加入等量二甲基亞砜(DMSO)溶劑。基因沉默方法同1.2，生理指標檢測同1.4。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理和分析，實時熒光定量RT-PCR數(shù)據(jù)經(jīng)儀器自帶的Opticon Monitor 3軟件處理，利用SPSS 17.0進行差異性分析，采用Duncan方法進行顯著性差異分析(P<0.05)。舞毒蛾GSTs基因表達量用2-△△Ct方法進行相對表達量分析(Livak and Schmittgen, 2001)。

2 結(jié)果與分析

2.1 舞毒蛾GSTs基因沉默效率分析

采用實時熒光定量RT-PCR檢測LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1基因的沉默效率(圖1)。處理48 h，靶基因的相對表達量均低于對照組dsGFP，且LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1基因相對表達量均顯著下降，分別比對照組降低了45.00%±10.4%、42.92%±6.7%和32.71%±2.8%(P<0.05)。處理72 h，注射LdGSTe2處理組的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，為對照組dsGFP的0.42倍(P<0.01)。結(jié)果表明通過舞毒蛾體內(nèi)注射目的基因dsRNA可有效沉默靶標基因。

圖1 舞毒蛾GST基因沉默效率Fig.1 Silencing effiency of GST genes in Lymantria dispar larvae注：柱形圖中*表示同一處理時間處理組與對照組間差異顯著P<0.05；**表示差異極顯著P<0.01，獨立樣本t檢驗。Note:* showed significantly difference between treatments and control groups by student’s t test at 0.05 level. ** showed significantly difference between treatments by student’s t test at 0.01 level.

2.2 GSTs基因沉默對舞毒蛾幼蟲生長發(fā)育和存活率的影響

注射GST基因dsRNA舞毒蛾幼蟲飼喂正常人工飼料，注射dsGFP對照組舞毒蛾鮮重均高于注射dsGSTs基因處理組(表2)。處理72 h，注射LdGSTsdsRNA處理組體重為dsGFP對照組的29.83%～71.68%。注射dsGFP與dsGSTs后舞毒蛾幼蟲存活率均在90.00%以上，所有注射GST基因dsRNA處理組與注射dsGFP對照組存活率無顯著性差異，表明GST基因沉默對舞毒蛾幼蟲存活無影響(圖2)。

表2 舞毒蛾幼蟲GST基因沉默對體重增長的影響

圖2 舞毒蛾GST基因沉默對幼蟲存活率的影響Fig.2 Effects of GST gene silencing on survival rate of Lymantria dispar larvae注：不同小寫字母表示同一時間不同處理組間差異顯著性(P<0.05)。Note: Different lowercase letter showed significantly difference between different treatment groups at the same time (P<0.05).

注射dsGFP、dsGSTe2、dsGSTs1、dsGSTs2和dsGSTz1舞毒蛾3齡幼蟲營養(yǎng)利用指標如表3所示。除近似消化率外，dsGSTe2、dsGSTs1和dsGSTs2處理組相對生長率、相對取食量、食物利用率和食物轉(zhuǎn)化率依次為對照組dsGFP的53.67%～73.94%、59.33%～82.08%和77.41%～90.46%，均顯著低于對照組dsGFP；除食物轉(zhuǎn)化率外，dsGSTz1處理組相對生長率、相對取食量、食物利用率和近似消化率依次為對照組dsGFP的73.94%、82.08%、90.46%和76.98%，顯著低于對照組dsGFP。

2.3 GSTs基因沉默舞毒蛾幼蟲對黃酮和槲皮素脅迫響應(yīng)

分別飼喂含黃酮和槲皮素的人工飼料72 h后，dsGFP對照組舞毒蛾3齡幼蟲體重顯著高于dsGSTs處理組(圖3)。其中，dsGSTe2處理組舞毒蛾幼蟲體重最低，分別為dsGFP對照組體重的80.83%和85.65%(P<0.05)；dsGSTz1處理組舞毒蛾幼蟲體重最高，分別為dsGFP對照組體重的93.57%和92.62%(P<0.05)。dsGSTs2處理組與dsGSTe2處理組間體重差異不顯著，分別為對照組體重的81.34%和88.66%。

經(jīng)次生物質(zhì)黃酮和槲皮素分別飼喂GSTs沉默后的舞毒蛾幼蟲存活率顯著降低(圖4)。注射dsGSTe2和dsGSTs1的舞毒蛾幼蟲飼喂黃酮后存活率分別為對照組dsGFP的66.67%和71.43%，飼喂槲皮素后存活率更低，為對照組dsGFP的65.00%和62.85%(圖4-A和4-B)；注射dsGSTs2和dsGSTz1的舞毒蛾幼蟲飼喂槲皮素后存活率分別為對照組dsGFP的83.33%和65.00%；飼喂黃酮后，存活率分別為對照組dsGFP的62.97%和69.84%，差異性顯著(圖4-C和4-D)。

表3 舞毒蛾GSTs基因沉默對營養(yǎng)利用的影響

圖3 不同次生物質(zhì)處理72 h對GSTs基因沉默舞毒蛾幼蟲體重影響Fig.3 Effects of different secondary metabolites on body weight of silenced Lymantria dispar larvae for 72 h注：不同小寫字母表示同一時間、喂食同種飼料、不同基因沉默組之間的差異顯著性(P<0.05)。Note: Different lowercase letters showed significantly difference between treatments at the same time and fed by Duncan’s analysis at 0.05 level.

圖4 不同次生物質(zhì)對GSTs基因沉默舞毒蛾幼蟲存活率的影響Fig.4 Survival rate of silenced Lymantria dispar under different secondary metabolites stress注：A、B、C和D分別為注射dsGSTe2、dsGSTs1、dsGSTs2和dsGSTz1基因72 h時舞毒蛾的存活率。柱形圖中*表示同一處理時間不同處理組和對照組間差異顯著P<0.05；**表示差異極顯著P<0.01，獨立樣本t檢驗。Note: A, B, C and D showed the survival rates of Lymantria dispar injected with dsGSTe2, dsGSTs1, dsGSTs2 and dsGSTz1 respectively at 72 h. * showed significantly difference between treatments and control group by student's t test at 0.05 level; ** showed significantly difference between treatments by student’s t test at 0.01 level.

3 結(jié)論與討論

植物次生物質(zhì)能影響昆蟲取食、生長發(fā)育、繁殖，甚至對昆蟲有毒殺作用。這些次生物質(zhì)能夠誘導昆蟲體內(nèi)解毒酶活性發(fā)生變化(陳澄宇等, 2015)。GST家族作為昆蟲三大解毒酶系之一，在抵御植物次生代謝物脅迫的過程中發(fā)揮著重要的解毒作用(Weinholdetal., 1990)。次生代謝物進入昆蟲體內(nèi)后，GST可保護昆蟲細胞抵御有毒物質(zhì)的侵害，同時在抗氧化和運輸內(nèi)生性親脂化合物上發(fā)揮著不可替代的作用(Lietal., 2007)。Zhang等(2018)通過飼喂方式沉默亞洲玉米螟OstriniafurnacalisOfGST1，幼蟲取食含dsOfGST1和6-甲氧基-2-苯并噁唑酮的飼料，死亡率高達54.00%，表明GST1在亞洲玉米螟的解毒過程中具有重要作用(Zhangetal., 2018)；研究報道舞毒蛾幼蟲經(jīng)蘆丁和水楊苷飼喂后，LdGSTe1、LdGSTd1、LdGSTo1和LdGSTz1基因的表達被誘導，且經(jīng)水楊苷處理后LdGSTz1基因轉(zhuǎn)錄水平是對照的29.24倍(Maetal., 2021)；陳銳等(2020)發(fā)現(xiàn)抗蟲品種科農(nóng)1006小麥中阿魏酸含量高于其它感蟲品種，阿魏酸能夠誘導麥紅吸漿蟲Sitodiplosismosellena體內(nèi)GST家族基因的表達(陳銳等, 2020)。本文利用RNAi介導技術(shù)分別有效沉默舞毒蛾LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1基因，注射LdGSTsdsRNA處理組幼蟲的體重顯著低于注射dsGFP對照組舞毒蛾體重。進一步分析舞毒蛾幼蟲營養(yǎng)利用指標顯示，注射dsGSTs處理組的RGR、RCR、ECI均顯著低于對照組dsGFP。但注射dsGFP與dsGSTs舞毒蛾幼蟲存活率均在90%以上，差異不顯著，這表明GST基因表達量降低對舞毒蛾幼蟲存活無影響，但對舞毒蛾幼蟲生長發(fā)育產(chǎn)生影響。

王曉麗等(2014)將單寧酸、綠原酸分別飼喂舞毒蛾2齡幼蟲后蛻皮困難，不能正常生長發(fā)育，分別飼喂水楊酸和丁香酸后產(chǎn)卵率顯著降低(王曉麗等, 2014)。Yang等(2017)對稻飛虱Nilaparvatalugens若蟲飼喂dsNlGSTD1，dsNlGSTE1和dsNlCE3 d后，繼續(xù)飼喂含阿魏酸的飼料3 d，發(fā)現(xiàn)若蟲死亡率顯著高于飼喂對照飼料的若蟲，死亡率分別提高了92.90%、119.90%和124.6%，表明沉默NlGSTD1、NlGSTE1和NlCE增強了阿魏酸對稻飛虱的毒性(Yangetal., 2017)。分別沉默LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1后，飼喂含次生物質(zhì)黃酮和槲皮素的人工飼料，注射dsGSTe2、dsGSTs1、dsGSTs2和dsGSTz1基因的舞毒蛾體重同注射dsGFP對照組相比分別下降了6.25%～19.17%和7.38%～14.35%，幼蟲取食黃酮和槲皮素的人工飼料后存活率分別為對照的62.97%～71.43%和62.85%～83.33%，舞毒蛾幼蟲存活率、體重顯著下降，這可能與解毒酶活性降低有關(guān)。GST解毒酶活性降低使舞毒蛾對植物次生物質(zhì)的敏感性增加，導致寄主適應(yīng)性降低。因此，LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1可能參與了黃酮和槲皮素的代謝和解毒，舞毒蛾GST基因沉默通過抑制取食和消化過程降低幼蟲體重，進而影響舞毒蛾幼蟲的生長發(fā)育，導致死亡率上升。