美國(guó)白蛾絲素蛋白基因的鑒定、時(shí)空表達(dá)及取食不同寄主植物后的表達(dá)響應(yīng)

趙旭東，韓芷琪，耿薏舒，胡天義，李文萱，郝德君*

(1. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037；2. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210037)

大多數(shù)鱗翅目幼蟲依靠唇腺分泌纖維蛋白(統(tǒng)稱為絲)，用于躲避天敵、抵御外界不良環(huán)境以及營(yíng)造化蛹場(chǎng)所(Robert, 2002; Chinnaswamyetal., 2012)。絲素作為絲的主要成分，約占75%～80%，是由絲素重鏈(Fibroin Heavy Chain, fib-H鏈)、絲素輕鏈(Fibroin Light Chain, fib-L鏈)和P25三種蛋白組成(Rouhovaetal., 2021)。絲素重鏈與絲素輕鏈通過(guò)二硫鍵形成H-L復(fù)合體，fib-H和fib-L之間的二硫鍵位點(diǎn)被鑒定為fib-H的羧基末端的第20位殘基(Cys-20)以及 fib-L羥基末端第172位殘基(Cys-172)，這類H-L復(fù)合體對(duì)于絲蛋白在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸及有效分泌必不可少(Tanakaetal., 1999a)。同時(shí)，P25蛋白通過(guò)非共價(jià)鍵疏水作用與H-L復(fù)合體結(jié)合，以維系絲素蛋白分子復(fù)合體的三維構(gòu)造(Yonemuraetal., 2009; Matthewetal., 2011)。已有研究表明，家蠶Bombyxmori一個(gè)基本的絲素單位由6個(gè)fib-H、6個(gè) fib-L和1個(gè)P25分子組裝成(Takeietal., 1987; Songetal., 2002; Matthewetal., 2011; Tsubotaetal., 2016)。但并非所有鱗翅目幼蟲絲素蛋白均由這三種蛋白構(gòu)成，如天蠶AntheraeayamamaiGuerin-Meneville、柞蠶Antheraeapernyi等大蠶蛾科柞蠶屬昆蟲的絲纖維則缺少fib-L和P25組分，是由絲素重鏈二聚體組成(Hwangetal., 2001; Tanaka and Mizuno, 2001; Naoyukietal., 2009)；毛翅目幼蟲的絲纖維主要由fib-H和fib-L構(gòu)成，缺少P25(Yonemuraetal., 2006)。

不同的鱗翅目幼蟲由于其生物學(xué)習(xí)性的差異，幼蟲吐絲發(fā)揮不同的作用，同時(shí)伴隨絲素蛋白基因特異的表達(dá)模式。家蠶Bmfib-H、Bmfib-L和BmP25的表達(dá)量均隨著幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，老熟幼蟲時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值(趙曉明, 2017)。同樣地，在米蛾Corcyracephalonica中，隨著幼蟲齡期的增加，絲腺組織分泌絲的能力逐漸增強(qiáng)，Ccfib-H、Ccfib-L和CcP25的表達(dá)量也隨之升高，在末齡幼蟲時(shí)達(dá)到峰值，在預(yù)蛹階段又顯著下降(Chaitanya and Dutta-Gupta, 2010; Chaitanyaetal., 2013)。稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis通過(guò)用絲包裹稻葉形成網(wǎng)幕，幼蟲在網(wǎng)幕中取食水稻上表皮和葉片組織，其絲素蛋白的表達(dá)量也與產(chǎn)生網(wǎng)幕的時(shí)期呈現(xiàn)正相關(guān)(Suetal., 2016)。

美國(guó)白蛾HyphantriacuneaDrury是國(guó)際性檢疫害蟲，具有適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖量大，寄主種類多，傳播途徑廣，危害嚴(yán)重等特點(diǎn)(楊忠岐等, 2007)，自1979年在遼寧省丹東市首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，目前已經(jīng)擴(kuò)散至13個(gè)省(區(qū)、市)608個(gè)縣級(jí)行政區(qū)(國(guó)家林業(yè)和草原局2021年第7號(hào)公告)。對(duì)森林、園林、果樹業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)國(guó)土生態(tài)安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅(Tangetal., 2021; 盧修亮等, 2021)。研究發(fā)現(xiàn)，美國(guó)白蛾幼蟲具有吐絲結(jié)網(wǎng)的習(xí)性，一旦卵孵化后即可分泌絲蛋白形成絲狀網(wǎng)幕，1～4齡幼蟲在網(wǎng)幕內(nèi)取食寄主植物(Wuetal., 2019; 王光宇等, 2020)，網(wǎng)幕也為其提供適宜的生長(zhǎng)溫度以及躲避天敵的攻擊(Rehnberg, 2002)。關(guān)于美國(guó)白蛾絲素蛋白的表達(dá)特性研究還未見報(bào)道。本研究通過(guò)克隆三條美國(guó)白蛾絲素蛋白，利用熒光定量PCR技術(shù)探究絲素蛋白基因在美國(guó)白蛾不同發(fā)育階段和不同組織的表達(dá)特性，以期明確絲素蛋白表達(dá)特性與幼蟲產(chǎn)絲時(shí)期的關(guān)系。同時(shí)，分別選擇美洲黑楊Populusdeltoides、日本晚櫻Cerasusserrulatavar．lannesiana、山櫻花Cerasusserrulata、喜樹CamptothecaAcuminata和落羽杉Taxodiumdistichum等5種植物，研究美國(guó)白蛾取食不同寄主植物后絲素蛋白基因的表達(dá)特性，為解析網(wǎng)幕介導(dǎo)的美國(guó)白蛾對(duì)不同寄主的適應(yīng)性和擴(kuò)散機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為未來(lái)防治美國(guó)白蛾提供潛在的基因靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

美國(guó)白蛾2齡幼蟲于2020年5月采自江蘇省淮安市淮安區(qū)楊樹上(33.52°N，119.16°E)。將幼蟲帶回室內(nèi)參照曹利軍等(2014)方法進(jìn)行人工飼養(yǎng)，人工氣候培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為26℃±1℃，相對(duì)濕度65%±5%，光周期16 L ∶8 D。待成蟲羽化后，提供新鮮的楊樹葉片供其產(chǎn)卵。取室內(nèi)繁殖的第2代幼蟲用于試驗(yàn)。

1.2 美國(guó)白蛾幼蟲總RNA的分離與cDNA模板的合成

取10頭生長(zhǎng)發(fā)育一致的美國(guó)白蛾3齡幼蟲用液氮速凍后置于研缽中，研磨成粉末狀，再用提取試劑盒(上海生工技術(shù)公司)提取總RNA。利用紫外分光光度計(jì)及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度及質(zhì)量，選擇電泳圖譜良好且OD260/OD280值在1.8～2.0之間的mRNA樣品合成cDNA模板。cDNA模板用HiScript II Q Select RT SuperMix(南京諾唯贊生物技術(shù)公司)兩步法合成，第一步：4× gDNA Wider Mix 4 μL，Oligo (dT) 1 μL，RNA 1 μL，ddH2O 10 μL，42℃ 2 min；第二步：將4 μL 5× HiScript II Select qRT SuperMix II加入混合液，85℃ 5 s，50℃ 15 min，-20℃保存或直接用于PCR反應(yīng)。

1.3 美國(guó)白蛾絲素蛋白基因的克隆

美國(guó)白蛾3條絲素蛋白基因HcP25、HcFib-H、HcFib-L的cDNA序列由美國(guó)白蛾幼蟲轉(zhuǎn)錄組(由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，未發(fā)表數(shù)據(jù))篩選獲得，利用Prime Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，送至上海生工生物公司合成。以美國(guó)白蛾3齡幼蟲RNA合成的cDNA為模板，利用ApexHF FS PCR Master Mix(艾科瑞生物，中國(guó))聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：ApexHF FS PCR Master Mix 25 μL、上下游引物各1 μL、cDNA模板2 μL，ddH2O 21 μL；擴(kuò)增條件為：98℃ 10 s、50℃ 15 s、72℃ 30 s，循環(huán)30次；72℃ 5 min延伸，擴(kuò)增后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠純化，克隆于pCE2載體(南京諾唯贊生物技術(shù)公司)，導(dǎo)入大腸桿菌EscherichiacoliTrans1-T1(南京諾唯贊生物技術(shù)公司)之后在含有氨芐抗性的LB瓊脂板上37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆于LB液體培養(yǎng)基中37℃ 200 r/min孵育2 h，再進(jìn)行菌液PCR鑒定。將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用分子生物學(xué)軟件DNAMAN 8.0比對(duì)測(cè)序序列與美國(guó)白蛾cDNA文庫(kù)中的絲素蛋白序列相似性。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.4 美國(guó)白蛾不同發(fā)育階段和不同組織RNA的提取以及cDNA模板合成

美國(guó)白蛾不同蟲齡幼蟲和蛹的cDNA模板的合成：選取200～300粒卵、20～30頭1齡、2齡幼蟲；5～10頭3齡、4齡幼蟲；3～5頭5齡、6齡幼蟲、蛹各3～10頭為一個(gè)生物學(xué)處理，3次重復(fù)。RNA提取及cDNA合成方式參考1.2。

美國(guó)白蛾不同組織cDNA模板的合成：選取2日齡3齡幼蟲10～15頭，在生理鹽水中解剖，獲得頭、中腸、血淋巴、馬氏管、脂肪體、表皮、絲腺、足等組織，置于RNA later中短時(shí)保存，通過(guò)離心法將RNA later去除。RNA提取及cDNA合成方式參考1.2。

1.5 不同寄主植物處理

將初羽化的雌雄成蟲置于10 cm×10 cm×10 cm的飼養(yǎng)盒中，提供30%蜂蜜水補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，讓其自由交配，第2天收集卵塊。將收集的卵卡分別放入盛有5種新鮮寄主的的飼養(yǎng)盒(13.5 cm×8.0 cm×0.5 cm)中，待幼蟲孵化，每隔1 d清理1次蟲糞便并更換食料。由于美國(guó)白蛾幼蟲在1～4齡時(shí)形成網(wǎng)幕，因此選擇取食5種寄主植物的3齡幼蟲為供試?yán)ハx進(jìn)行絲素蛋白的表達(dá)特性分析。取10～15頭蛻皮后1 d的3齡幼蟲為一個(gè)處理，5次重復(fù)。RNA提取及cDNA合成方式參考1.2。

1.6 熒光定量PCR引物的合成與擴(kuò)增效率的檢測(cè)

依據(jù)cDNA文庫(kù)所得到的基因序列設(shè)計(jì)引物(退火溫度均在50℃～60℃之間)，以美國(guó)白蛾核糖體基因Ribosomal Protein S26 (RPS26)為內(nèi)參基因(實(shí)驗(yàn)室前期篩選，數(shù)據(jù)未發(fā)表)，引物設(shè)計(jì)運(yùn)用Primer 5.0軟件，由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。取美國(guó)白蛾3齡幼蟲的cDNA模板，稀釋濃度為500、50、5、0.5和0.05 ng/μL。分別利用上述引物進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)濃度重復(fù)5次。利用公式E = 10-1/Slope (E為擴(kuò)增效率，Slope為5個(gè)濃度平均Ct值所構(gòu)成直線的斜率值)計(jì)算引物的擴(kuò)增效率，比較待測(cè)絲素蛋白基因與內(nèi)參基因RPS26擴(kuò)增效率的數(shù)值，確定本研究所用的熒光定量PCR引物是否達(dá)到要求。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

依據(jù)克隆獲得的絲素蛋白基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物。引物設(shè)計(jì)采用Primer 5.0軟件由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在Applied Biosystem 7500 System(美國(guó))上進(jìn)行。反應(yīng)體系：UltraSYBR mix (with R) 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算絲素蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量(Livaketal., 2001)。

1.8 美國(guó)白蛾絲素蛋白基因序列分析以及進(jìn)化樹分析

通過(guò)在線軟件(http://web.expasy.org/compute_pi/)分析美國(guó)白蛾絲素蛋白核苷酸序列的物理性狀。已知鱗翅目昆蟲的絲素蛋白基因氨基酸序列相似性搜索使用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)工具利用NCBI的CD search (www. ncbi. nlm. nih. gov/structure/ cdd/cdd.shtml)預(yù)測(cè)蛋白的保守功能域；ClustalX軟件進(jìn)行氨基酸多重序列完全比對(duì)；利用MEGA 9.0軟件包中的鄰位相連法(Neighbor-Joining)構(gòu)建進(jìn)化樹并經(jīng)1 000次Bootstrap自舉重復(fù)檢驗(yàn)。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

美國(guó)白蛾不同發(fā)育階段、不同組織以及取食不同寄主的絲素蛋白相對(duì)表達(dá)量變化采用2-ΔΔCt法計(jì)算。利用IBM SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Origin 2018繪制圖表。采用單因素分析法中的Duncan氏多重檢驗(yàn)法對(duì)美國(guó)白蛾絲素蛋白基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析，差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 美國(guó)白蛾絲素蛋白基因的鑒定

基于美國(guó)白蛾幼蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)基因克隆鑒定了3條美國(guó)白蛾絲素蛋白基因。其中HcP25具有完整的ORF，編碼221個(gè)氨基酸，HcFib-L、HcFib-H為部分片段。HcP25預(yù)測(cè)分子量為25.6 kDa，理論等電點(diǎn)預(yù)測(cè)為7.45。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HcP25N端均具有17個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列(圖1)，且有典型的絲素蛋白P25蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

圖1 美國(guó)白蛾絲素蛋白HcP25基因核苷酸序列以及其推導(dǎo)出來(lái)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of HcP25 from Hyphantria cunea注：紅色下劃線為推導(dǎo)的信號(hào)肽區(qū)域，灰色陰影部分為P25蛋白超家族結(jié)構(gòu)域。Note: The predicted signal peptide sequence was underlined. The gray shaded part was the fibroin P25 super family domain.

表2 3條絲素蛋白的BLASTX最佳匹配

2.2 美國(guó)白蛾與其他昆蟲絲素蛋白基因氨基酸序列的進(jìn)化樹分析

NCBI BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，絲素蛋白主要在鱗翅目昆蟲中特異性表達(dá)。MEGA 9.0鄰接法(Neighbor Joining methods)對(duì)包括美國(guó)白蛾HcP25、HcFib-H、HcFib-L在內(nèi)的不同科鱗翅目昆蟲的絲素蛋白基因核苷酸序列分別進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建。結(jié)果顯示(圖2)：美國(guó)白蛾HcP25、HcFib-H、HcFib-L均與車前燈蛾同源性最高，同屬于一個(gè)分支。P25、Fib-H、Fib-L在鱗翅目不同科之間在出現(xiàn)較大的分化；分化的原因可能是由于取食習(xí)性以及生物學(xué)習(xí)性的差異導(dǎo)致。P25以及Fib-L在美國(guó)白蛾所屬的燈蛾科中與夜蛾科的進(jìn)化關(guān)系較為接近，而在絲素蛋白Fib-H中燈蛾科與鳳蝶科進(jìn)化關(guān)系更為接近。

2.2 美國(guó)白蛾絲素蛋白基因在幼蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)

引物合成后，RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示無(wú)引物二聚體，亦無(wú)非特異性擴(kuò)增。絲素蛋白基因HcP25、HcFib-H、HcFib-L引物擴(kuò)增效率分別為106.03%、94.90%、108.14%；內(nèi)參基因RPS26的引物擴(kuò)增效率為104.15(表3)。確定本研究所用的熒光定量PCR引物均達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

圖2 鱗翅目昆蟲絲素蛋白進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of lepidopteran Fibroins注： A表示鱗翅目昆蟲P25基因進(jìn)化樹； B表示鱗翅目昆蟲Fib-L進(jìn)化樹；圖C表示鱗翅目昆蟲Fib-H進(jìn)化樹。不同顏色區(qū)域代表鱗翅目不同科；Note: A represents phylogenetic tree of lepidopteran P25s; B represents phylogenetic tree of lepidopteran Fib-Ls; C represents phylogenetic tree of lepidopteran Fib-Hs. Different color regions represent different families of Lepidoptera. 物種名以及P25s登錄號(hào)：菜粉蝶 Pieris rapae；Prp25(XP 022115373.1)；白粉蝶Pieris macdunnoughi；PmP25(CAF4741365.)；菊黃花粉蝶Zerene cesonia；ZcP25(XP 038217613.1)；條紋小粉蝶 Leptidea sinapis；LsP25(VVD01372.1)；黑脈金斑蝶 Danaus plexippus plexippus；DpP25(XP 032525475.1)； 金鳳蝶 Papilio machaon；PmaP25(XP 014362623.1)；赤松毛蟲 Dendrolimus spectabilis；DsP25(BAB39502.1)；桑野蠶 Bombyx mandarina； BmP25(BAB39500.1)；米蛾 Corcyra cephalonica；CceP25(ACX50393.1)；蠟螟 Galleria mellonella； GmP25(XP 026750282.1)；海波斯莫科馬屬尖蛾 Hyposmocoma kahamanoa；HkP25(XP 026325402.1)；棉褐環(huán)野螟 Haritalodes derogata；HdP25(ARE31005.1);亞洲玉米螟 Ostrinia furnacalis;OfP25(XP 028174026.1)；粉紋夜蛾 Trichoplusia ni；TniP25(XP 026736911.1)；車前燈蛾Arctia plantaginis；ApP25(CAB3237372.1) ；美國(guó)白蛾 Hyphantria cunea；HcP25；棉鈴蟲 Helicoverpa armigera；HaP25(XP 021180832.1)；斜紋夜蛾 Spodoptera litura； SlP25(XP 022817133.1)；草地貪夜蛾 Spodoptera frugiperda；SfP25(XP 035455615.1)；幕衣蛾 Tineola bisselliella；TbP25(QRN45216.1)；稠李巢蛾 Yponomeuta evonymella； YeP25(BAE97692.1)；小菜蛾 Plutella xylostella； PxP25(QQP17683.1)。物種名以及Fib-Ls登錄號(hào)：蠟螟 Galleria mellonella；GmFibL(XP 026751556.1)；米蛾 Corcyra cephalonica；CcFibL(ACX50392.1)；臍橙螟蛾 Amyelois transitella；AtFibL(XP 013191394.1)；亞洲玉米螟 Ostrinia furnacalis；OfFibL(XP 028170825.1)；棉褐環(huán)野螟 Haritalodes derogata；HdFibL(AFS32690.1)；玉帶鳳蝶 Papilio polytes；PpFibL(XP 013148799.1)；柑橘鳳蝶 Papilio xuthus；PxFibL(NP 001299492.1)；特美紅蛺蝶 Vanessa tameamea；VtFibL(XP 026488043.1)；黑脈金斑蝶 Danaus plexippus plexippus；DpFibL(OWR43595.1)；菊黃花粉蝶 Zerene cesonia；ZcFibL(XP 038218698.1)；白粉蝶 Pieris macdunnoughi；PmFibL(CAF4952403.1)；菜粉蝶 Pieris rapae；PrFibL (XP 022120941.1)；袋衣蛾 Tineola bisselliella；TbFibL(QRN45215.1)；煙草天蛾 Manduca sexta；MsFibL(XP 037303618.1)；家蠶 Bombyx mori；BmFibL (AAL83649.1)；粉紋夜蛾 Trichoplusia ni；TnFibL(XP 026736676.1)；車前燈蛾Arctia plantaginis；ApFibL (CAB3225488.1)；美國(guó)白蛾 Hyphantria cunea；HcFibL；棉鈴蟲 Helicoverpa armigera；HaFibL (XP 021187436.1)；斜紋夜蛾 Spodoptera litura；SlFibL (XP 022823583.1)；草地貪夜蛾 Spodoptera frugiperda；SfFibL (XP 035443377.1)；物種名以及Fib-H登錄號(hào)：車前燈蛾Arctia plantaginis；ApFib-H (CAB3248753.1)；美國(guó)白蛾Hyphantria cunea；HcFib-H；玉帶鳳蝶 Papilio polytes；PpFib-H(XP 013147704.1)；柑橘鳳蝶 Papilio xuthus；PxFib-H (KPJ01470.1)；棉褐環(huán)野螟 Haritalodes derogata；HdFib-H(ANA52002.1)；桑野蠶 Bombyx mandarina； BmFib-H (CAA27612.1)；家蠶 Bombyx mori；BmFib-H (NP 001106733.1)；棉鈴蟲 Helicoverpa armigera；HaFib-H (PZC72456.1)；斜紋夜蛾 Spodoptera litura；SlFib-H (XP 022817907.1)；草地貪夜蛾 Spodoptera frugiperda；SfFib-H (XP 035449581.1)

表3 候選基因qRT-PCR引物的擴(kuò)增效率及線性相關(guān)系數(shù)Table 3 Amplification efficiency and R2 of qRT-PCR primers for candidate genes

RT-qPCR結(jié)果顯示美國(guó)白蛾絲素蛋白HcP25、HcFib-H、HcFib-L相對(duì)表達(dá)量在美國(guó)白蛾幼蟲不同發(fā)育階段存在明顯差異。HcP25與HcFib-H具有相似的表達(dá)特點(diǎn)，HcP25與HcFib-H在初孵幼蟲以及2齡時(shí)相對(duì)表達(dá)量顯著高于其它齡期(P<0.05)；在2齡后隨著齡期增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，4齡之后HcP25與HcFib-H表達(dá)量顯著下降，在蛹期時(shí)相對(duì)表達(dá)量最低(圖3-A，C)。HcFib-L在2齡幼蟲體內(nèi)表達(dá)量達(dá)到峰值，顯著高于其它齡期(P<0.001)，之后同樣隨著齡期增長(zhǎng)顯著下降，且在蛹期時(shí)相對(duì)表達(dá)量最低，顯著低于卵期與幼蟲期(P<0.05，圖3-B)。

圖3 美國(guó)白蛾絲素蛋白基因 HcP25 (A)、HcFib-L (B)、HcFib-H (C)在不同發(fā)育階段的表達(dá)特性Fig.3 Expression profiles of HcP25 (A), HcFib-L (B), HcFib-H (C) in different developmental stages of Hyphantria cunea注：L1～L6：分別表示1齡至6齡美國(guó)白蛾幼蟲。數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,柱上不同小寫字母表示差異顯著P<0.05，Duncan氏多重比較。下圖同。Note: L1～L6 1st～6th instar larva, respectively. Data in the figure were mean±SE, and different small letters above bars indicated significant difference (P<0.05, Duncan’s multiple comparison).The same below.

2.3 美國(guó)白蛾絲素蛋白基因在幼蟲不同組織的表達(dá)分析

美國(guó)白蛾HcP25、HcFib-H和HcFib-L基因在3齡幼蟲的不同組織中具有不同的表達(dá)模式。RT-qPCR結(jié)果表明3條絲素蛋白基因均在絲腺組織中表達(dá)量最高，且極顯著高于其它組織(P<0.001)；其中HcFib-H在脂肪體、頭中特異性地高表達(dá)，且在脂肪體中相對(duì)表達(dá)量高于頭部(P<0.05)，顯著高于其他組織(P<0.05)。HcP25、HcFib-L除了在絲腺組織中特異性表達(dá)之外，在表皮、脂肪體、頭中也有表達(dá)，且在這3個(gè)組織之間差異不顯著(P>0.05)(見圖4)。

圖4 美國(guó)白蛾絲素蛋白基因HcP25 (A)、HcFib-L (B)、HcFib-H (C)在幼蟲不同組織的表達(dá)特性Fig.4 Expression profiles of HcP25 (A), HcFib-L (B), HcFib-H (C) in different tissues of the 3th instar larvae of Hyphantria cunea

2.4 美國(guó)白蛾絲素蛋白基因在取食不同寄主植物后的表達(dá)譜分析

取食不同寄主植物后美國(guó)白蛾3齡幼蟲絲素蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異。取食楊樹的美國(guó)白蛾幼蟲的HcP25和HcFib-H基因相對(duì)表達(dá)量種群極顯著高于其它寄主的種群(P<0.001，圖5-A，B)，取食喜樹的美國(guó)白蛾也相對(duì)較高。HcP25和HcFib-H基因表達(dá)量高低依次為楊樹種群>喜樹種群>山櫻花種群>日本晚櫻種群、落羽杉種群。HcFib-L表達(dá)特性與HcP25和HcFib-H不同，取食山櫻花與日本晚櫻幼蟲的HcFib-L相對(duì)表達(dá)量顯著高于其它種群(P<0.05)，取食楊樹幼蟲的HcFib-L表達(dá)相對(duì)較低且與取食落羽杉、喜樹的無(wú)顯著性差異(P>0.05)；取食落羽杉幼蟲的HcP25、HcFib-H和HcFib-L表達(dá)量均低于取食其它寄主植物(圖5-C)。

圖5 美國(guó)白蛾幼蟲取食不同寄主植物后絲素蛋白基因HcP25 (A)、HcFib-L (B)、HcFib-H (C)的表達(dá)特性Fig.5 Relative expression levels of HcP25 (A)，HcFib-L (B)，HcFib-H (C) in the 3th instar larvae of Hyphantria cunea after feeding on different host plants

3 結(jié)論與討論

絲是一種從螨類、蜘蛛等節(jié)肢動(dòng)物外胚層腺體中分泌形成的聚合纖維，而節(jié)肢動(dòng)物產(chǎn)絲能力是由多個(gè)昆蟲譜系中進(jìn)化而來(lái)的(Gatesyetal., 2001; 王孟卿和彩萬(wàn)志, 2004; Addisetal., 2014)。吐絲現(xiàn)象在膜翅目、長(zhǎng)翅目、管蚤目、雙翅目、毛翅目和鱗翅目等昆蟲的幼蟲中均有發(fā)生(Matthewetal., 2012; Yanetal., 2021)。絲的主要作用吐絲結(jié)成網(wǎng)幕保護(hù)幼蟲躲避天敵或者是化蛹時(shí)制作繭室以及一些肉食性昆蟲利用絲收集食物或用作捕獲獵物的“陷阱”(Johnetal., 2001)。產(chǎn)絲能力、絲的功能以及性能在不同的昆蟲種類中有很大的不同。美國(guó)白蛾幼蟲聚集在寄主植物葉片以及樹枝上通過(guò)分泌絲纖維形成網(wǎng)幕，幼蟲通常白天群聚在網(wǎng)幕中，夜晚擴(kuò)張網(wǎng)幕并將植物葉片包裹起來(lái)供其取食(Rehnberg, 2002; Chenetal., 2020)。網(wǎng)幕為美國(guó)白蛾幼蟲提供適宜的生長(zhǎng)溫度以及躲避天敵的攻擊。此外，網(wǎng)幕還可以調(diào)節(jié)熱量，減緩網(wǎng)內(nèi)的空氣流動(dòng)，從而促進(jìn)幼蟲的發(fā)育(Rehnberg, 2002; Takuyaetal., 2016)。

絲素蛋白是研究節(jié)肢動(dòng)物適應(yīng)性進(jìn)化的理想材料，因?yàn)樗鼈儶?dú)立地出現(xiàn)在許多節(jié)肢動(dòng)物的譜系中。通常情況下，絲主要由甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸等非必需氨基酸組成。擁有特殊功能的絲蛋白往往具有特定的屬性，這些屬性在很長(zhǎng)一段時(shí)間的進(jìn)化過(guò)程中一直保持不變(Goslineetal., 1999)。這些保守的蛋白質(zhì)特征可以從單一半胱氨酸殘基的均勻定位，到更復(fù)雜的特征，如序列同源性高的長(zhǎng)片段區(qū)域。對(duì)于蜘蛛絲來(lái)說(shuō)，研究這些蛋白保守的特征有助于確定重要的絲蛋白序列元件和分子進(jìn)化模式(Johnetal., 2001)。本研究中篩選出美國(guó)白蛾幼蟲3條絲素蛋白基因即HcP25、HcFib-H、HcFib-L，核苷酸序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)3條絲素蛋白基因均與車前燈蛾同源性最高，可能是由于兩種昆蟲均隸屬于燈蛾科，具有同源的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。P25、Fib-H、Fib-L在鱗翅目不同科之間在出現(xiàn)較大的分化；P25以及Fib-L在美國(guó)白蛾所屬的燈蛾科中與夜蛾科的進(jìn)化關(guān)系較為接近，而在Fib-H中燈蛾科與鳳蝶科進(jìn)化關(guān)系更為接近。可能是由于不同科的鱗翅目幼蟲的網(wǎng)幕行使不同的功能，以及生物學(xué)習(xí)性的差異導(dǎo)致絲素蛋白功能上的分化(Robert., 2002)。如在谷蛾總科和螟蛾總科中，幼蟲通常藏匿于用絲構(gòu)成的紡絲管中，在紡絲管中取食，還可以躲避天敵；而一些尺蛾科和夜蛾科的老熟幼蟲吐絲幫助它們從樹冠上下落到地面上化蛹(Frantisek and Michal, 2004; Tsubotaetal., 2020)。

同樣，絲在在鱗翅目幼蟲不同的發(fā)育時(shí)期行使不同的功能。如一些斑蛾科、卷葉蛾科以及毒蛾科昆蟲的初孵幼蟲利用絲線借助風(fēng)的作用擴(kuò)大分布范圍，蠶蛾科昆蟲在老熟幼蟲化蛹時(shí)吐絲作繭以保護(hù)蛹(Inoueetal., 2000)。本研究中，美國(guó)白蛾絲素蛋白HcP25、HcFib-H、HcFib-L相對(duì)表達(dá)量在美國(guó)白蛾幼蟲不同發(fā)育階段處于動(dòng)態(tài)的變化過(guò)程。HcP25與HcFib-L在初孵幼蟲及2齡時(shí)相對(duì)表達(dá)量顯著高于其它齡期，HcFib-L在2齡幼蟲時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，之后隨著齡期增長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明絲素蛋白的表達(dá)量與美國(guó)白蛾的產(chǎn)絲量密切相關(guān)。美國(guó)白蛾在其幼蟲孵化后立即大量吐絲結(jié)網(wǎng)幕，而這一階段HcP25、HcFib-H、HcFib-L相對(duì)表達(dá)量較高。美國(guó)白蛾幼蟲4齡后開始分散取食，不群居結(jié)成網(wǎng)幕(Wuetal., 2019)，因而HcP25、HcFib-H、HcFib-L相對(duì)表達(dá)量較低，而蛹期幾乎不形成網(wǎng)幕，相對(duì)表達(dá)量最低。在對(duì)絲素蛋白在不同組織表達(dá)水平研究中，絲素蛋白基因HcP25、HcFib-L和HcFib-H均在絲腺組織中特異性表達(dá)，說(shuō)明3條基因參與絲腺組織中絲纖維的合成。美國(guó)白蛾幼蟲的絲腺是一對(duì)特異化程度非常高的器官，由下唇腺特化而成，主要功能是合成和分泌絲蛋白，而頭部器官是幼蟲分泌絲的主要場(chǎng)所(Wuetal., 2019; Chenetal., 2020)，3條基因在美國(guó)白蛾頭部均有分布和表達(dá)說(shuō)明絲素蛋白在可能頭部參與絲的分泌。

植物作為重要的生態(tài)因子和食物資源，直接影響昆蟲的地理分布與擴(kuò)散。美國(guó)白蛾為多食性食葉害蟲，具有特定的食物結(jié)構(gòu)和適應(yīng)性。本研究中，取食不同寄主植物的美國(guó)白蛾3齡幼蟲絲素蛋白呈現(xiàn)不同的表達(dá)水平。已有研究表明家蠶幼蟲血淋巴中貯藏的蛋白積累是由寄主植物直接誘導(dǎo)的(Nagata and Kobayashi, 1990)，絲素蛋白的表達(dá)水平因取食不同的桑葉品種而有所差異(Micheal and Subramanyam, 2014)。誘導(dǎo)絲素蛋白高表達(dá)的桑樹品種的葉片含有較高的蛋白質(zhì)和碳水化合物，直接有助于家蠶幼蟲產(chǎn)生更多的絲素(Ruthetal., 2019)。在這些寄主富含較多的微量營(yíng)養(yǎng)素、氨基酸和碳水化合物，以及促進(jìn)絲腺生長(zhǎng)成熟和血淋巴分泌的促生酶(Chinnaswamyetal., 2012; Ruthetal., 2020)。本研究發(fā)現(xiàn)取食楊樹的美國(guó)白蛾幼蟲HcP25與HcFib-H基因相對(duì)表達(dá)量種群極顯著高于其它寄主種群，可能是由于楊樹葉片中蛋白質(zhì)、碳水化合物的豐度高于其它寄主，從而誘導(dǎo)HcP25與HcFib-H基因的高表達(dá)，繼而使其在楊樹上產(chǎn)生更多的網(wǎng)幕，造成危害。HcFib-L與HcP25、HcFib-H表達(dá)模式呈現(xiàn)不同的表達(dá)特性，取食山櫻花和日本晚櫻幼蟲的HcFib-L表達(dá)量顯著升高，可能是由于美國(guó)白蛾網(wǎng)幕形成過(guò)程中不同類型的絲素蛋白行使不同的功能。在家蠶的研究中，幼蟲取食不同品種桑葉后，5齡家蠶幼蟲的Fib-L與Fib-H同樣呈現(xiàn)了不同的表達(dá)模式(Ruthetal., 2020)。在不同鱗翅目昆蟲中Fib-H具有同源性，其氨基酸序列重復(fù)區(qū)具有多樣性，同時(shí)氨基酸組成、基本序列重復(fù)單元的復(fù)雜性以及這些重復(fù)單元的排列決定了絲纖維的特性(Frantisek and Michal, 2004; Takuyaetal., 2020)。而Fib-L和P25主要是參與絲基本單元的構(gòu)成以及Fib-H的分泌，與Fib-H在絲形成的過(guò)程中發(fā)揮不同的作用(Frantisek and Michal, 2004)。下一步將測(cè)定不同寄主的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以及美國(guó)白蛾在不同寄主植物上網(wǎng)幕發(fā)生量，明確寄主植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、美國(guó)白蛾在不同寄主上的發(fā)生量以及與形成網(wǎng)幕大小的關(guān)系。

美國(guó)白蛾是一種多食性的入侵害蟲，以幼蟲取食寄主植物葉片造成危害，其幼蟲吐絲合成絲狀物形成網(wǎng)幕對(duì)寄主植物造成危害。本研究在克隆出美國(guó)白蛾三條絲素蛋白的基礎(chǔ)上，探究了其時(shí)空表達(dá)特性以及美國(guó)白蛾幼蟲取食不同寄主植物后的表達(dá)譜，為進(jìn)一步研究深網(wǎng)幕介導(dǎo)的美國(guó)白蛾對(duì)不同寄主的適應(yīng)機(jī)制、寄主介導(dǎo)的擴(kuò)散機(jī)制奠定基礎(chǔ)。