PR結(jié)構(gòu)域蛋白5過表達(dá)對(duì)人急性髓系白血病細(xì)胞系U937遷移侵襲的影響及其機(jī)制

蘇杰 楊小靜 周雪

急性髓系白血病(AML)是造血干細(xì)胞惡性克隆引起的造血功能異常疾病，可浸潤(rùn)肝臟、脾臟、淋巴結(jié)等各個(gè)臟器[1-2]。目前治療AML的方案主要為造血干細(xì)胞移植和藥物治療，但只對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病有效，其余類型的AML均無明顯療效[3]。因此，尋找新治療靶點(diǎn)和深入研究AML的發(fā)病分子學(xué)機(jī)制對(duì)提高AML療效至關(guān)重要。PR結(jié)構(gòu)域蛋白(PRDM)屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)家族之一，主要參與細(xì)胞增殖凋亡、生長(zhǎng)發(fā)育及代謝等過程，過表達(dá)PRDM5可促進(jìn)AML細(xì)胞系U937的遷移和侵襲[4]。微小RNA(miRNA)是由19～24個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，可與mRNA序列結(jié)合并誘導(dǎo)其降解，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程[5]。在AML的發(fā)生發(fā)展過程中，PRDM5和miRNA的作用尚不清楚，且PRDM5對(duì)AML細(xì)胞系U937遷徙侵襲的分子學(xué)機(jī)制仍不明確。基于此，本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對(duì)AML細(xì)胞系U937進(jìn)行過表達(dá)或沉默PRDM5和miR-489-3p，探討PRDM5和miR-489-3p對(duì)U937的影響、機(jī)制及與Wnt通路的相關(guān)性。

材料與方法

1.材料：AML細(xì)胞系U937購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。FBS胎牛血清、MEM培養(yǎng)基和0.05%的胰蛋白酶(Thermofisher scientific lnc)；LipofectamineTM2000(Merck lnc)；Trizol試劑和BCA試劑(Thermofisher scientific lnc)；0.25%甲紫溶液(索萊寶科技有限公司)；侵襲遷移小室(Transwell小室，密理博科技有限公司)；PrimeScriptTMRT試劑盒(Takara bio lnc)；SYBR-Green qPCR Master Mix(北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司)；RIPA緩沖液、SDS-PAGE和PVDF膜(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；鼠抗人PRDM5、GSK3β、β-catenin和GAPDH單分子抗體(Cell signaling technology lnc)；兔抗鼠二抗(Cell signaling technology lnc)。

2.方法

(1)骨髓樣本收集：收集2018年～2019年我院收治的40例AML患者(AML組)和20例健康志愿者(正常組)骨髓樣本，AML均通過骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等方法檢查確診。本研究通過我院倫理委員會(huì)審批，所有受試者均簽署知情同意書。

(2)細(xì)胞培養(yǎng)：U937細(xì)胞通過常規(guī)復(fù)蘇后，采用含10% FBS的MEM培養(yǎng)液，于37 ℃恒溫、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天傳代1次，實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞無血清培養(yǎng)12 h后，分別將無效序列過表達(dá)質(zhì)粒、含PRDM5過表達(dá)序列的質(zhì)粒、shRNA陰性對(duì)照質(zhì)粒、PRDM5沉默shRNA質(zhì)粒、miRNA過表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒、miR-489-3p模擬物轉(zhuǎn)染至U937細(xì)胞作為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-PRDM5組、shNC組、shPRDM5組、NC組和miR-489-3p mimics組。miR-489-3p+pcDNA3.1-PRDM5組是PRDM5過表達(dá)質(zhì)粒干預(yù)后，再用miR-489-3p干擾U937細(xì)胞。具體轉(zhuǎn)染步驟參考LipofectamineTM2000試劑盒說明書。

(4)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：各組細(xì)胞長(zhǎng)至80%，用10 μl槍頭尖端在培養(yǎng)皿中央垂直劃一道痕跡，在0 h、24 h觀察劃痕兩側(cè)細(xì)胞遷移的距離，遷移率(%)=(劃痕寬度0 h-劃痕寬度24 h)/ 劃痕寬度0 h×100%，需獨(dú)立重復(fù)3次取平均值。

(5)Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力:各組細(xì)胞于Transwell小室中培養(yǎng)12 h。甲醇固定15 min，0.25%甲紫溶液染色30 min。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200)拍照記錄遷移下室的細(xì)胞總數(shù)。

(6)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)法檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平：提取各組RNA，采用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度，采用miRNA第一鏈cDNA合成(加尾法)試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增為cDNA。按照熒光定量試劑盒使用步驟進(jìn)行PCR，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。分別以GAPDH和U6作為mRNA和miRNA的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，基因表達(dá)結(jié)果均以2-△△Ct進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。本實(shí)驗(yàn)所有PCR引物序列見表1。

(7)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平：提取各組總蛋白，采用BCA試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。各組蛋白上樣量20 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗滌3次，加入對(duì)應(yīng)的一抗(β-catenin、GSK3β和GAPDH)，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，放入二抗，室溫孵育2 h。采用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影，Image J軟件分析結(jié)果，相對(duì)蛋白表達(dá)水平以GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。

(8)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測(cè)使用Dual Luciferase Reporter Assay System試劑盒，使用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。

結(jié) 果

1.AML組和正常組受試者骨髓miR-489-3p及PRDM5 mRNA表達(dá)水平比較：AML組受試者骨髓miR-489-3p表達(dá)水平低于正常組(0.189±0.017比0.528±0.011，P<0.05)，而AML組受試者骨髓PRDM5 mRNA表達(dá)水平高于正常組(0.489±0.009比0.147±0.006，P<0.05)。

2.NC組和miR-489-3p mimics組AML細(xì)胞系U937 miR-489-3p、PRDM5 mRNA表達(dá)水平、侵襲能力及遷移能力比較：miR-489-3p mimics組AML細(xì)胞系U937 miR-489-3p表達(dá)水平高于NC組(1.836±0.102比1.012±0.063，P<0.05)，PRDM5 mRNA表達(dá)水平、穿過基質(zhì)膠膜的細(xì)胞數(shù)量及24 h內(nèi)遷移率均低于NC組[0.497±0.039比1.003±0.046;(31±2)個(gè)比(63±5)個(gè)；(34.26±6.92)%比(57.56±10.25)%，P均<0.05]。

3.pcDNA3.1組和pcDNA3.1-PRDM5組、shNC組和shPRDM5組AML細(xì)胞系U937 PRDM5 mRNA表達(dá)水平、侵襲能力及遷移能力比較：pcDNA3.1-PRDM5組AML細(xì)胞系U937 PRDM5 mRNA表達(dá)水平、穿過基質(zhì)膠膜的細(xì)胞數(shù)量及24 h內(nèi)遷移率均高于pcDNA3.1組[2.231±0.184比1.015±0.141;(252±5)個(gè)比(68±4)個(gè)；(86.53±8.42)%比(59.76±7.42)%，P均<0.05]。shPRDM5組AML細(xì)胞系U937 PRDM5 mRNA表達(dá)水平、穿過基質(zhì)膠膜的細(xì)胞數(shù)量及24 h內(nèi)遷移率均低于shNC組[0.237±0.039比1.085±0.071;(34±2)個(gè)比(75±4)個(gè)；(36.91±4.15)%比(58.46±5.28)%，P均<0.05]。

4.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)TargetScan的預(yù)測(cè)，miR-489-3p 3’-UTR中的靶向位點(diǎn)與PRDM5部分互補(bǔ)(圖1)。雙熒光素酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，miR-489-3p-Wt組相對(duì)熒光素酶活性低于NC組(0.417±0.049比1.021±0.075，P<0.05)，但miR-489-3p-Mut組和NC組螢光素酶活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明PRDM5是miR-489-3p的靶基因。

圖1 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果miR-489-3p與PRDM5存在結(jié)合位點(diǎn)

5.miR-489-3p mimic組和miR-489-3p+pcDNA3.1-PRDM5組AML細(xì)胞系U937侵襲能力及遷移能力比較：miR-489-3p+pcDNA3.1-PRDM5組穿過基質(zhì)膠膜的細(xì)胞數(shù)量及24 h內(nèi)遷移率均高于miR-489-3p mimic組[(121±7)個(gè)比(31±2)個(gè)，(56.49±4.52)%比(34.58±4.13)%，P均<0.05]。

6.不同組別AML細(xì)胞系U937 Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平比較：miR-489-3p mimic組AML細(xì)胞系U937 β-catenin蛋白表達(dá)水平低于NC組(0.43±0.05比1.02±0.09)，GSK3β蛋白表達(dá)水平高于NC組(1.53±0.12比0.96±0.11)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。pcDNA3.1-PRDM5組AML細(xì)胞系U937 β-catenin蛋白表達(dá)水平高于pcDNA3.1組(1.62±0.15比1.08±0.12)，GSK3β蛋白表達(dá)水平低于pcDNA3.1組(0.47±0.05比0.98±0.09)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。shPRDM5組AML細(xì)胞系U937 β-catenin蛋白表達(dá)水平低于shNC組(0.56±0.06比0.95±0.09)，GSK3β蛋白表達(dá)水平高于shNC組(1.51±0.13比1.07±0.10)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-489-3p+pcDNA3.1-PRDM5組AML細(xì)胞系U937 β-catenin蛋白表達(dá)水平高于miR-489-3p mimic組(1.73±0.15比1.10±0.12)，GSK3β蛋白表達(dá)水平低于miR-489-3p mimic組(0.46±0.06比1.07±0.09)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(P<0.05)。

討 論

白血病是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，包括淋巴系白血病和髓系白血病[6]。AML的發(fā)生主要是髓系細(xì)胞的終末分化受阻礙，髓系前體細(xì)胞無限制的增殖，導(dǎo)致骨髓造血功能衰竭[7-8]。PRDM5蛋白屬于一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，位于人類染色體區(qū)域4q26，該區(qū)域具有許多活躍于幾種惡性腫瘤中的抑癌基因[9]。PRDM5對(duì)造血功能、細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲均有明顯作用[10]。本研究通過RT-qPCR檢測(cè)AML患者骨髓，發(fā)現(xiàn)PRDM5 mRNA表達(dá)水平明顯降低。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，過表達(dá)PRDM5可抑制人AML細(xì)胞系U937的侵襲和遷移能力，而沉默U937中的PRDM5后，其侵襲和遷移能力明顯被激活，表明PRDM5對(duì)AML細(xì)胞系U937的侵襲和遷移能力均有抑制作用。

近年來對(duì)miRNA功能的深入研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過與靶基因結(jié)合，影響靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，從而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[11]。白血病中miRNA可以作為診斷的新生物標(biāo)記，并為白血病提供有希望的治療方法和新穎的藥物篩選策略[12]。本研究結(jié)果顯示，AML患者骨髓miR-489-3p表達(dá)水平低于對(duì)照組。過表達(dá)miR-489-3p mimic后，U937的侵襲和遷移能力受到抑制，且PRDM5 mRNA表達(dá)水平也明顯減少。Targetscan軟件預(yù)測(cè)miR-489-3p與PRDM5有互補(bǔ)序列。而雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRDM5是miR-489-3p的靶基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-489-3p靶向PRDM5對(duì)U937侵襲和遷移能力的影響，本研究在miR-489-3p mimic轉(zhuǎn)染U937后，采用PRDM5過表達(dá)質(zhì)粒干擾，結(jié)果顯示，miR-489-3p+pcDNA3.1-PRDM5組U937侵襲和遷移能力高于miR-489-3p mimic組，表明PRDM5可拯救miR-489-3p對(duì)AML細(xì)胞系U937侵襲和遷移能力的抑制作用。綜上可知，miR-489-3p可通過靶向PRDM5抑制AML細(xì)胞系U937的侵襲和遷移能力。

為了進(jìn)一步探究miR-489-3p靶向PRDM5調(diào)控AML細(xì)胞系U937侵襲和遷移能力的分子學(xué)機(jī)制，本研究觀察了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的變化。既往研究表明，PRDM5影響Wnt/β-catenin信號(hào)的傳導(dǎo)，抑制癌基因表達(dá)從而起到抑癌作用[3]。過表達(dá)miR-489-3p后，AML細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)被阻礙，AML細(xì)胞的生長(zhǎng)從而受到抑制[13]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-489-3p后，β-catenin蛋白表達(dá)水平降低，GSK3β蛋白表達(dá)水平升高，表明miR-489-3p可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。過表達(dá)PRDM5后，β-catenin蛋白表達(dá)水平升高，GSK3β蛋白表達(dá)水平降低，但沉默PRDM5后，結(jié)果與之相反，表明PRDM5可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路的傳導(dǎo)。過表達(dá)miR-489-3p后，再過表達(dá)PRDM5后，U937中Wnt/β-catenin信號(hào)通路傳導(dǎo)恢復(fù)，表明miR-489-3p通過靶向PRDM5抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

綜上所述，AML患者骨髓miR-489-3p和PRDM5呈異常表達(dá)，miR-489-3p通過靶向抑制PRDM5的表達(dá)，進(jìn)一步抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而降低AML細(xì)胞系U937的遷移和侵襲能力。