血漿Nesfatin-1、DKK-1水平與股骨頭壞死的關(guān)系

龐士龍， 王 漢， 張志強， 李 強， 朱如森

（1.天津市寧河區(qū)醫(yī)院骨科，天津 301500；2.天津市人民醫(yī)院脊柱外科，天津 300121）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是由多種因素引起股骨頭慢性血供不足、骨細胞凋亡而引發(fā)的疾病，可導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變和髖關(guān)節(jié)功能障礙。多數(shù) ONFH患者在確診后的數(shù)年內(nèi)可能發(fā)展為股骨頭塌陷和嚴重髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎，需要手術(shù)治療[1]。ONFH發(fā)病機制尚不清楚。有研究結(jié)果顯示，脂肪因子通過與骨細胞表面受體結(jié)合參與骨代謝調(diào)節(jié)過程[2]。攝食抑制因子1（Nesfatin-1）是一種新型脂肪因子，對攝食活動、糖脂代謝具有調(diào)節(jié)作用[3]。骨結(jié)構(gòu)重建失衡、骨細胞凋亡是ONFH主要的病理改變環(huán)節(jié)，Wnt信號通路參與成骨細胞/破骨細胞系統(tǒng)調(diào)節(jié)和骨重建過程，與ONFH發(fā)病有關(guān)[4]。Dickkopf-1（DKK-1）是內(nèi)源性Wnt信號通路拮抗劑，可抑制成骨細胞分化，促使破骨細胞生成，導(dǎo)致骨量流失，介導(dǎo)各類骨骼疾病的發(fā)生[5]。目前，Nesfatin-1、DKK-1在ONFH發(fā)病機制中的作用尚不清楚。本研究擬探討血漿Nesfatin-1、DKK-1水平與ONFH病情嚴重程度和股骨頭塌陷的關(guān)系，以期為臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年5月—2020年1月天津市寧河區(qū)醫(yī)院骨科收治的ONFH患者85例（ONFH組），其中男36例、女49例，年齡24～37歲，病程10～42個月。病因包括激素性（39例）、酒精性（21例）、創(chuàng)傷性（15例）、特發(fā)性（10例）。國際骨循環(huán)學(xué)會（the Association Research Circulation Osseous，ARCO）分期[6]Ⅱ期（21例）、Ⅲ期（36例）、Ⅳ期（28例）。85例ONFH患者中股骨頭塌陷[X線片或電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）提示股骨頭表面骨質(zhì)缺損，呈凹陷狀]50例。納入標準：（1）存在典型臨床癥狀或髖關(guān)節(jié)疼痛、活動受限，經(jīng)X線片、CT、MRI或放射性核素顯像檢查確診，符合《成人股骨頭壞死臨床診療指南》標準[7]；（2）年齡＞18周歲；（3）未進行骨科手術(shù)治療。排除標準：（1）合并骨折、骨腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、脊椎或大關(guān)節(jié)病等其他骨科疾?。唬?）肥胖、代謝綜合征、系統(tǒng)性硬化癥患者；（3）合并高血壓、糖尿病、高脂血癥等疾病。另選取同期天津市寧河區(qū)醫(yī)院體檢中心體檢健康者50名作為正常對照組，其中男21名、女29名，年齡26～39歲；均排除糖尿病、高血壓、冠心病、高脂血癥等疾病的患者以及近期服用影響骨代謝藥物者。2個組年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)天津市寧河區(qū)醫(yī)院倫理委員會批準，所有對象均知情同意，簽署知情同意書。

1.2 方法

采集所有患者入院24 h內(nèi)、正常對照者體檢當(dāng)日的空腹靜脈血3～5 mL，乙二胺四乙酸二鈉抗凝，4 ℃ 1 000×g離心10 min，分離血漿，-80 ℃保存，統(tǒng)一檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血漿Nesfatin-1、DKK-1水平，Nesfatin-1試劑盒（最低檢測限0.15 ng/L，線性范圍10～110 ng/L，批間和批內(nèi)變異系數(shù)≤10%，標準曲線r值為0.993～0.999）購自上海藍基生物科技有限公司，DKK-1試劑盒（最低檢測限0.13 pg/mL，線性范圍10～120 pg/mL，批間和批內(nèi)變異系數(shù)≤10%，標準曲線r值為0.989～0.999）購自北京榮志海達生物科技有限公司。檢測儀器為BIOBASE2000全自動酶免分析儀（山東博科公司）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件和Med Calc 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用Kolmogorov-Smirnov對計量資料進行擬合優(yōu)度檢驗。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman秩相關(guān)分析評估Nesfatin-1、DKK-1與ARCO分期之間的相關(guān)性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估各項指標診斷股骨頭塌陷的效能，曲線下面積（area under curve，AUC）比較采用Z檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ONFH組與正常對照組血漿Nesfatin-1、DKK-1水平比較

ONFH組血漿Nesfatin-1、DKK-1水平高于正常對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 ONFH組與正常對照組血漿Nesfatin-1、DKK-1水平比較 ±s

表1 ONFH組與正常對照組血漿Nesfatin-1、DKK-1水平比較 ±s

注：空白表示無此項。

組別 例數(shù) Nesfatin-1/（ng/L） DKK-1/（pg/mL）ONFH組 85 61.24±13.71 72.14±15.26正常對照組 50 35.12±6.35 43.26±7.46 t值 12.681 12.517 P值 0.000 0.000

2.2 血漿Nesfatin-1、DKK-1與ONFH患者臨床特征的關(guān)系

ONFH患者血漿Nesfatin-1、DKK-1水平隨著ARCO分期的增高而升高（P＜0.05）。股骨頭塌陷的ONFH患者血漿Nesfatin-1、DKK-1水平高于股骨頭未塌陷的ONFH患者（P＜0.05）。不同年齡、性別及病因的ONFH患者之間血漿Nesfatin-1、DKK-1水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床參數(shù)的ONFH患者之間血漿Nesfatin-1、DKK-1水平比較 ±s

表2 不同臨床參數(shù)的ONFH患者之間血漿Nesfatin-1、DKK-1水平比較 ±s

注：與Ⅱ期比較，*P＜0.05；與Ⅲ期比較，#P＜0.05；空白表示無此項。

臨床參數(shù) 例數(shù) Nesfatin-1/（ng/L） DKK-1/（pg/mL）性別男性 36 61.19±13.42 72.09±15.06女性 49 61.27±14.36 72.18±15.33 t值 0.026 0.027 P值 0.979 0.979年齡≥35歲 42 61.42±13.95 72.81±15.43＜35歲 43 61.03±13.01 71.49±14.58 t值 0.133 0.405 P值 0.894 0.686病因激素性 39 61.21±13.12 72.21±15.29酒精性 21 61.12±13.23 72.29±15.44創(chuàng)傷性 15 61.14±13.11 72.30±15.23特發(fā)性 10 61.76±13.52 71.31±15.27 F值 0.682 0.351 P值 0.532 0.823 ARCO分期Ⅱ期 21 50.63±10.42 64.20±12.14Ⅲ期 36 62.35±13.02* 71.24±14.15*Ⅳ期 28 67.77±15.24*# 79.25±18.62*#F值 13.264 15.243 P值 0.000 0.000股骨頭塌陷是 50 66.24±16.32 76.15±16.35否 35 54.10±11.53 66.41±14.23 t值 3.836 2.848 P值 0.000 0.006

2.3 血漿Nesfatin-1、DKK-1水平與ARCO分期的相關(guān)性

Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，血漿Nesfatin-1、DKK-1水平與ARCO分期呈正相關(guān)（rs值分別為0.733、0.626，P=0.000）。

2.4 血漿Nesfatin-1、DKK-1單項檢測及聯(lián)合檢測診斷股骨頭塌陷的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，血漿Nesfatin-1、DKK-1單項檢測及聯(lián)合檢測（以Nesfatin-1、DKK-1任意1項陽性為陽性）診斷股骨頭塌陷的AUC分別為0.707、0.643、0.889。血漿Nesfatin-1、DKK-1聯(lián)合檢測的AUC高于單項檢測（Z值分別為2.352、2.964，P＜0.05）。見表3。

表3 血漿Nesfatin-1、DKK-1、單項及聯(lián)合檢測診斷股骨頭塌陷的ROC曲線參數(shù)

圖2 血漿Nesfatin-1、DKK-1單項檢測及聯(lián)合檢測診斷股骨頭塌陷的ROC曲線

3 討論

ONFH是臨床常見的致殘性疾病。ONFH患者對缺血骨組織修復(fù)能力差，容易發(fā)生股骨頭塌陷變性和骨折，是引起中青年人殘疾的主要因素之一。ONFH的發(fā)病機制尚不明確，目前發(fā)現(xiàn)的病因包括血管內(nèi)血栓形成、脂肪代謝異常、髓內(nèi)脂肪細胞肥大、骨質(zhì)疏松[8]。股骨頭塌陷是ONFH疾病進展的中晚期階段，發(fā)生于股骨頭壞死修復(fù)期，屬于不可逆損傷，臨床表現(xiàn)為突發(fā)的疼痛加重，X線片可見“新月征”，MRI提示骨髓水腫和關(guān)節(jié)積液。股骨頭塌陷可造成嚴重的髖關(guān)節(jié)病變，往往需要接受人工髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)[9]。有效預(yù)測股骨頭塌陷對指導(dǎo)臨床治療十分重要，目前預(yù)測股骨頭塌陷的方法為定期X線或MRI檢查，但X線輻射性大，出現(xiàn)“新月征”時可能已發(fā)生軟骨下骨折；MRI費用高，禁忌癥多。生物學(xué)標志物檢測方便，可重復(fù)檢測，因此探討與ONFH發(fā)病和進展密切相關(guān)的分子機制具有重要意義。

Nesfatin-1是一種由82個氨基酸組成的新飽食分子，來源于核組蛋白2，表達于胃腸道系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、下丘腦神經(jīng)元、腦干等組織，具有調(diào)節(jié)攝食、血糖、精神情緒作用，并具有抗炎和抗細胞凋亡的功能[10]。既往研究結(jié)果顯示，Nesfatin-1與消化、內(nèi)分泌、神經(jīng)等多種系統(tǒng)的疾病發(fā)生有關(guān)[11]。KVLIVIDZE等[12]的研究結(jié)果顯示，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者Nesfatin-1水平明顯升高，且與病情嚴重程度呈正相關(guān)，Nesfatin-1 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制中可能發(fā)揮促炎作用。動物實驗結(jié)果顯示，Nesfatin-1可上調(diào)雌激素缺乏相關(guān)骨質(zhì)疏松大鼠骨鈣素、骨堿性磷酸酶水平，預(yù)防骨質(zhì)疏松，提示Nesfatin-1對骨代謝有一定的調(diào)節(jié)作用[13]。本研究結(jié)果顯示，ONFH患者血漿Nesfatin-1水平明顯高于正常對照組（P＜0.05），且與ARCO分期呈正相關(guān)（rs=0.733，P＜0.05），說明Nesfatin-1可能參與了ONFH的發(fā)生，并與軟骨破壞程度有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，股骨頭塌陷的ONFH患者血漿Nesfatin-1水平高于股骨頭無塌陷的ONFH患者（P＜0.05），說明Nesfatin-1水平與ONFH患者股骨頭塌陷有一定關(guān)系。ZHANG等[14]發(fā)現(xiàn)血漿、關(guān)節(jié)液Nesfatin-1水平與膝關(guān)節(jié)炎患者的軟骨退變程度顯著相關(guān)。Nesfatin-1參與ONFH患者股骨頭塌陷的機制可能與其參與ONFH關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜炎癥反應(yīng)有關(guān)，Nesfatin-1水平升高可能會刺激白細胞介素18、C反應(yīng)蛋白等炎癥因子的釋放，加劇了關(guān)節(jié)內(nèi)局部炎癥反應(yīng)[15]，從而加重ONFH患者股骨頭的損壞程度，出現(xiàn)股骨頭塌陷。另外，Nesfatin-1可能通過調(diào)節(jié)骨代謝，抑制骨細胞生成，導(dǎo)致骨細胞凋亡和壞死，進而加重股骨頭的病變[11，13]。

DKK-1是一種分泌型糖蛋白，由成熟成骨細胞和骨細胞分泌，DKK-1通過與受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6結(jié)合阻斷Wnt/β-catenin信號在細胞內(nèi)傳遞，具有調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、遷移以及胚胎發(fā)育、器官發(fā)生和體內(nèi)平衡等多種生物學(xué)功能[16]。DKK-1表達與惡性腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)[17]。DKK-1還參與了骨代謝和骨重建的過程，參與系統(tǒng)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[18]、脊椎關(guān)節(jié)病[19]等疾病的發(fā)病過程。關(guān)于DKK-1在ONFH中作用的研究較少，DKK-1是否參與了ONFH發(fā)病尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，ONFH患者血漿DKK-1水平明顯高于正常對照組（P＜0.05），且隨著ARCO分期的增高而升高，說明DKK-1可能與ONFH有一定關(guān)系。本研究結(jié)果還顯示，股骨頭塌陷的ONFH患者血漿DKK-1水平高于股骨頭無塌陷的ONFH患者（P＜0.05），提示DKK-1水平升高與股骨頭塌陷有關(guān)。KO等[20]發(fā)現(xiàn)血清DKK1水平與ONFH的嚴重程度相關(guān)，敲除DKK1可減少地塞米松誘導(dǎo)的間充質(zhì)細胞凋亡。DKK-1是Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，可通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路破壞成骨-破骨系統(tǒng)穩(wěn)定性，使成骨細胞生成減少，破骨細胞生成增多，導(dǎo)致骨吸收，加速骨細胞凋亡和壞死進程，進而導(dǎo)致股骨頭塌陷。抑制DKK-1表達可激活Wnt/β-catenin信號通路，增加成骨蛋白Runt相關(guān)基因2表達，促使骨髓間充質(zhì)干細胞分化[21]。

本研究R O C曲線分析結(jié)果顯示，Nesfatin-1、DKK-1對ONFH患者股骨頭塌陷的診斷均有一定的價值，但敏感性均較低，而二者聯(lián)合檢測的效能相對較高。

綜上所述，血漿Nesfatin-1、DKK-1水平與ONFH患者股骨頭壞死程度有一定關(guān)系，但Nesfatin-1、DKK-1參與ONFH患者股骨頭塌陷的具體機制尚不清楚，需深入研究。