徐州某雞場(chǎng)柔嫩艾美爾球蟲(chóng)耐藥性分析

王玉燕，遲 蘭，昌莉麗，黃坤朋，任士飛

(1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221006；2.徐州市三羽家禽診療服務(wù)有限公司，江蘇 徐州 221006)

雞球蟲(chóng)病是由一種或多種艾美耳屬球蟲(chóng)寄生于雞的腸道不同部位而引起的急性流行性腸道寄生蟲(chóng)病。雞球蟲(chóng)病以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的致病力最強(qiáng)，寄生于盲腸，俗稱盲腸球蟲(chóng)病。該病在養(yǎng)雞生產(chǎn)中較為常見(jiàn)，能嚴(yán)重影響雞的生長(zhǎng)發(fā)育、降低生產(chǎn)性能、抑制免疫功能甚至繼發(fā)其它疾病，雖然死亡率不高但是發(fā)病率較高，給現(xiàn)代集約化家禽養(yǎng)殖帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在養(yǎng)雞生產(chǎn)中因球蟲(chóng)疫苗使用效果的穩(wěn)定性差、存在弱毒返強(qiáng)等原因，目前藥物防控仍然是控制雞球蟲(chóng)病的主要措施[1]。

隨著抗球蟲(chóng)藥物的長(zhǎng)期使用，球蟲(chóng)耐藥性問(wèn)題日趨普遍和嚴(yán)重，已成為藥物控制球蟲(chóng)病的主要障礙。養(yǎng)殖場(chǎng)及時(shí)地掌握和評(píng)價(jià)本場(chǎng)球蟲(chóng)的耐藥情況，才能合理地使用抗球蟲(chóng)藥，正確地用藥物防控雞球蟲(chóng)病。本研究以5種徐州本地常用抗球蟲(chóng)藥物對(duì)某雞場(chǎng)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)進(jìn)行耐藥性分析，以期為雞場(chǎng)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病的防控提供依據(jù)，減少盲目用藥和過(guò)度用藥。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蟲(chóng)株

試驗(yàn)蟲(chóng)株由徐州市三羽家禽門(mén)診病例中某雞場(chǎng)球蟲(chóng)病死雞分離得到?，F(xiàn)場(chǎng)采集病死雞盲腸內(nèi)容物，采用飽和鹽水漂浮法分離得到球蟲(chóng)卵囊，經(jīng)單卵囊分離純化后，依據(jù)球蟲(chóng)寄生部位、卵囊形態(tài)[2]、孢子化時(shí)間[3]鑒定為柔嫩艾美爾球蟲(chóng)。將鑒定后的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊口服接種無(wú)球蟲(chóng)感染的健康雛雞，獲取擴(kuò)增后的新鮮卵囊置于重鉻酸鉀溶液中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至孢子化，孢子化后的卵囊液置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)藥物

百球清(托曲珠利溶液，含量2.5%)，拜耳(四川)動(dòng)物保健有限公司，批號(hào)2017100801；球痢克(地克珠利溶液，含量0.5%)，河南惠康動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)201612164；磺胺氯吡嗪鈉可溶性粉，合肥中龍神力動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)20170529；復(fù)方磺胺喹惡啉鈉可溶性粉(磺胺喹惡啉鈉、氧芐啶)，合肥中龍神力動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)20170315；青蒿球蟲(chóng)粉(荊芥、防風(fēng)、青蒿等)，河南得康(致遠(yuǎn)國(guó)際)動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)178042701。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

1日齡黃羽肉公雞飼養(yǎng)于徐州生物工程學(xué)院實(shí)習(xí)牧場(chǎng)，動(dòng)物房嚴(yán)格消毒，飼養(yǎng)籠經(jīng)火焰消毒，保障飼養(yǎng)環(huán)境無(wú)球蟲(chóng)，飼養(yǎng)過(guò)程中飼喂無(wú)抗球蟲(chóng)添加藥物的全價(jià)飼料，按正常飼養(yǎng)管理程序飼喂至14日齡。連續(xù)2 d收集試驗(yàn)雞糞便檢查無(wú)球蟲(chóng)卵囊。

1.4 分組及試驗(yàn)處理

對(duì)14日齡試驗(yàn)雞進(jìn)行空腹稱重，選取體重相近的試驗(yàn)雞隨機(jī)分為百球清組(Ⅰ組，按1 mL/L兌水給藥)；球痢克組(Ⅱ組，0.2 mL/L兌水給藥)；磺胺氯吡嗪納可溶性粉組(Ⅲ組，0.3 g/L兌水給藥)；復(fù)方磺胺喹惡啉鈉禽用可溶性粉組(Ⅳ組，1 g/L兌水給藥)；青蒿球蟲(chóng)粉組(Ⅴ組，1 g拌料500 g)；空白對(duì)照組(Ⅵ組不感染不給藥組)、感染對(duì)照組(Ⅶ組感染不給藥組)，共7組，每組15只。除空白對(duì)照組其它各組分別用注射器經(jīng)口向嗉囊內(nèi)灌服柔嫩艾美爾球蟲(chóng)孢子化卵囊5×104個(gè)。

接種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)24 h后開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥7 d。每組試驗(yàn)雞死亡后不再補(bǔ)充，觀察和記錄各組試驗(yàn)雞的發(fā)病情況及臨床表現(xiàn)至試驗(yàn)結(jié)束。

1.5 耐藥性綜合評(píng)定指標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn)

本試驗(yàn)以病變記分減少率(RLS)、相對(duì)卵囊產(chǎn)量(ROP)、最適抗球蟲(chóng)活性百分率(POAA)和抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)四項(xiàng)指標(biāo)來(lái)綜合評(píng)定分析藥物的耐藥性。RSL=[(感染對(duì)照組病變記分-試驗(yàn)組病變記分)/感染對(duì)照組病變記分]×100% ；ROP=試驗(yàn)組卵囊數(shù)或者空白對(duì)照組卵囊數(shù)/感染對(duì)照組卵囊數(shù)×100%；POAA=[(試驗(yàn)組增重與存活率-感染對(duì)照組增重與存活率)/(空白對(duì)照組增重與存活率-感染對(duì)照組增重與存活率)]×100%；ACI=(相對(duì)增重率+存活率)×100-(病變值+卵囊值)。

式中：卵囊值是根據(jù)角田清[4]方法計(jì)算，病變記分按照J(rèn)ohnson等[5]的方法進(jìn)行；增重與存活率(GSR)=試驗(yàn)籠末重/試驗(yàn)籠初重[6]；相對(duì)增重率=(用藥組平均增重÷空白對(duì)照組平均增重)×100%；存活率=存活只數(shù)/實(shí)驗(yàn)雞數(shù)×100%；病變值=每組平均病變記分×10。

1.6 耐藥性定標(biāo)準(zhǔn)

耐藥性定按照黃兵[7]方法。RSL>50%，判為陰性；RSL<50%，判為陽(yáng)性；ROP<15%，判為陰性；ROP≥15%，判為陽(yáng)性；POAA>50%，判為陰性；POAA<50%，判為陽(yáng)性；ACI≥160，判為陰性；ACI<160，判為陽(yáng)性。四項(xiàng)指標(biāo)中有三項(xiàng)及以上為陽(yáng)性時(shí)可判定為完全耐藥；有兩項(xiàng)指標(biāo)為陽(yáng)性時(shí)判定為中度耐藥；有一項(xiàng)指標(biāo)為陽(yáng)性時(shí)判定為輕度耐藥；各項(xiàng)指標(biāo)均為陰性時(shí)判定為不耐藥。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 17.0 的 ANOVA模塊對(duì)不同藥物組的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以P<0. 05 作為組間試驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗球蟲(chóng)藥物對(duì)艾美爾球蟲(chóng)卵囊排出的影響

由表1可見(jiàn)，青蒿球蟲(chóng)粉、球痢克、百球清組的ROP均小于15%，表現(xiàn)為耐藥陰性，復(fù)方磺胺喹惡啉鈉可溶性粉、磺胺氯吡嗪鈉可溶性粉的ROP均大于15%表現(xiàn)為耐藥陽(yáng)性。

表1 不同抗球蟲(chóng)藥物對(duì)雞球蟲(chóng)卵囊排出的影響Table 1 Effect of different anticoccidial drugs on oocystexcretion of coccidia in chickens

2.2 抗球蟲(chóng)藥物對(duì)盲腸病變的影響

空白對(duì)照組未出現(xiàn)盲腸病變，RLS是從減輕腸道病變方面來(lái)評(píng)定球蟲(chóng)耐藥性，青蒿球蟲(chóng)粉組和百球清組RLS均大于50%為耐藥陰性，其中百球清組RLS值為56.65%在減輕腸道病變方面最表現(xiàn)最優(yōu)，復(fù)方磺胺喹惡啉鈉可溶性粉、磺胺氯吡嗪鈉可溶性粉、球痢克組RLS值均小于50%為耐藥陽(yáng)性(見(jiàn)表2)。

表2 不同抗球蟲(chóng)藥物的盲腸病變計(jì)分及RLS結(jié)果Table 2 Lesion score and RLS of cecal lesions withdifferent anticoccidial drugs

2.3 抗球蟲(chóng)藥物對(duì)雞體增重的影響

測(cè)定不同抗球蟲(chóng)藥物對(duì)雞體增重的影響，感染對(duì)照組體重比空白組相比明顯下降(P<0.01)，各用藥組體重比感染對(duì)照組增長(zhǎng)明顯(P<0.01)，其中青蒿球蟲(chóng)粉組增重率最高為74.41%(P<0.01)。各用藥POAA均小于50%，判定為耐藥陽(yáng)性(見(jiàn)表3)。

表3 試驗(yàn)雞平均增重、相對(duì)增重及POAA結(jié)果Table 3 Average weight gain, relative weight gain and POAA of experimental chickens

2.4 抗球蟲(chóng)藥物的ACI

五種抗球蟲(chóng)藥物的ACI值均小于160，均為耐藥陽(yáng)性(見(jiàn)表4)。

表4 抗球蟲(chóng)藥物的ACI值及評(píng)價(jià)Table 4 ACI value and evaluation of anticoccidial drugs

2.5 抗球蟲(chóng)藥物的藥效綜合評(píng)價(jià)

按照POAA、RLS、ROP、ACI 四項(xiàng)指標(biāo)綜合判斷，徐州該雞場(chǎng)柔嫩艾美爾球蟲(chóng)對(duì)百球清、青蒿球蟲(chóng)粉中度抗藥，對(duì)球痢克、復(fù)方磺胺喹惡啉鈉可溶性粉、磺胺氯吡嗪鈉可溶性粉完全抗藥(見(jiàn)表5)。

表5 抗球蟲(chóng)藥物的藥效綜合評(píng)價(jià)Table 5 Comprehensive evaluation of the efficacy of anticoccidial drugs

3 討 論

本次耐藥性評(píng)定中所選取的藥物均是徐州獸藥市場(chǎng)最常見(jiàn)的藥物，結(jié)果表明該雞場(chǎng)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)對(duì)徐州地區(qū)五種常用的抗球蟲(chóng)藥物都已形成不同程度的耐藥。該雞場(chǎng)對(duì)常用抗球蟲(chóng)藥物已經(jīng)產(chǎn)生了非常普遍的耐藥性，與全國(guó)其它地區(qū)報(bào)道一致[8-10]。耐藥性的產(chǎn)生將加速禽類產(chǎn)品中藥物殘留的產(chǎn)生，加大對(duì)公共衛(wèi)生的危害。因此需要加強(qiáng)對(duì)本地區(qū)球蟲(chóng)耐藥性的監(jiān)測(cè)，選出敏感藥物進(jìn)行輪換用藥、交叉用藥、聯(lián)合用藥，減少耐藥性的產(chǎn)生。另外還可以開(kāi)發(fā)新的中草藥。中草藥毒副作用小，長(zhǎng)時(shí)間使用不易產(chǎn)生耐藥性。研究證實(shí)，青蒿素及衍生物均能提高機(jī)體免疫能力，有效減輕炎癥反應(yīng)，改善球蟲(chóng)感染雞盲腸病變，恢復(fù)機(jī)體正常的生理功能[11]。黃杰等[12]評(píng)價(jià)青蒿素(ART)和癸氧喹酯(DQ)對(duì)球蟲(chóng)病的預(yù)防作用結(jié)果發(fā)現(xiàn)ART對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染的預(yù)防效果不如 DQ，兩者聯(lián)合應(yīng)用具有明顯協(xié)同作用。青蒿素及衍生物抗球蟲(chóng)效果與其用藥量、濃度、添加方式、球蟲(chóng)種類也有密切聯(lián)系[11]。青蒿素與其它藥物聯(lián)合使用具有明顯的協(xié)同作用。陳永亮等[13]將ART和二甲氧芐啶(DVD)聯(lián)合應(yīng)用于抗雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)存活率、病變記分、平均增重等方面ART+DVD組均高于ART組。本次試驗(yàn)中選用中草藥青蒿球蟲(chóng)粉，發(fā)現(xiàn)該雞場(chǎng)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)對(duì)青蒿球蟲(chóng)粉是中度抗藥，但在增重方面青蒿球蟲(chóng)粉的相對(duì)增重率優(yōu)于其它4種常用藥物。

根據(jù)本次試驗(yàn)結(jié)果，徐州該雞場(chǎng)應(yīng)暫停使用球痢克、復(fù)方磺胺喹惡啉鈉可溶性粉、磺胺氯吡嗪鈉可溶性粉防治雞柔嫩艾美爾球蟲(chóng)病。為了降低球蟲(chóng)對(duì)抗球蟲(chóng)藥物耐藥性的產(chǎn)生，養(yǎng)殖企業(yè)進(jìn)行球蟲(chóng)病防控時(shí)可以先進(jìn)行耐藥性測(cè)定，選出敏感藥物，再制定合理的抗球蟲(chóng)防控方案。