高產中性蛋白酶酵母菌固態(tài)發(fā)酵棉粕的參數優(yōu)化

魏滿紅，韋 票，袁凱鑫，王 惠，陳玉林，楊雨鑫*

(1.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌712100；2.西安樂民反芻動物研究所，陜西 西安710065)

近年來，隨著棉花種植規(guī)模的擴大，中國已經成為最大的產棉國，每年棉粕產量都在1 200×104t以上[1]。棉粕中蛋白質的含量在40%左右，其氨基酸組成合理，消費量占蛋白飼料的8%，是優(yōu)質的蛋白飼料[2]。但棉粕中含有大量的抗營養(yǎng)因子，如棉酚、單寧、植酸等，使其利用率受到極大的限制。目前，通過微生物發(fā)酵來降低抗營養(yǎng)因子含量、提高其營養(yǎng)水平是棉粕資源開發(fā)研究的熱點。研究表明，使用產蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的菌株對棉粕發(fā)酵，可以有效降解復雜的碳水化合物，提高營養(yǎng)物質的消化率[3]。用枯草芽孢桿菌ST-141和酵母菌N5發(fā)酵棉粕，粗蛋白從49.8%增加到51%[4]，同時也降低了粗纖維的含量。微生物發(fā)酵棉粕除了提高營養(yǎng)物質外，還能夠降低抗營養(yǎng)因子的含量。Tang等[5]固體發(fā)酵棉粕后，游離棉酚從0.82 g/kg降低到0.21 g/kg。同樣在Xiong等[6]研究中，游離棉酚從90 mg/kg下降到30 mg/kg。據Liu等[7]報道，微生物發(fā)酵棉粕的過程中均能不同程度地分泌各種酶類，降解粗纖維，提高粗蛋白含量，而且將蛋白質降解為易于機體吸收的小分子多肽。

本試驗利用前期篩選出的高產蛋白酶的酵母菌對棉粕進行發(fā)酵，研究棉粕在不同時間、含水量、菌液接種量、葡萄糖添加量下產蛋白酶的情況，探索不同條件下棉粕發(fā)酵效果的差異，以期篩選出最佳發(fā)酵組合提高棉粕的營養(yǎng)價值，降低抗營養(yǎng)因子含量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.2 棉粕 購自陜西楊凌富仕特飼料有限公司，粗蛋白含量44.46%。

1.1.3 試劑 羥甲基纖維素鈉、3，5-二硝基水楊酸、葡萄糖、3-氨基-1-丙醇、植酸鈉、果膠、牛肉膏、檸檬酸三銨、二甲亞砜、乙酸鈉、酪蛋白、正己烷、干酪素、酪氨酸、PDA培養(yǎng)基、氯化鈀、三氯乙酸購自楊凌中楊生物服務部，酵母提取物、蛋白胨購自OXOID公司，Folin-酚購自北京東方順科生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵時間對棉粕中性蛋白酶活性的影響 棉粕發(fā)酵時設含菌量10%、含糖量1.5%、含水量50%，在室溫(28 ℃)下發(fā)酵7 d，每12 h翻堆1次，每24 h采樣，參照文獻[8]方法測定中性蛋白酶活性。菌液接種量是將6株酵母菌分別接種到PDA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)活菌數為1.5×107～2.0×107CFU/mL時，將6株菌液等量混合后，菌液接種質量占發(fā)酵體系總質量的百分比；葡萄糖添加量是葡萄糖的添加質量占發(fā)酵體系總質量的百分比；含水量是棉粕中攜帶的13%水、菌液接種量以及添加水分占發(fā)酵體系總質量的百分比。

1.2.2 含水量對發(fā)酵棉粕中性蛋白酶活性的影響 設5個試驗組，菌液接種量均為10%、葡萄糖添加量均為1.5%，含水量分別設置為40%、45% 、50%、55%、60%，在室溫下發(fā)酵，每12 h翻堆1次，第6天采樣，測定中性蛋白酶活性。

1.2.3 葡萄糖添加量對發(fā)酵棉粕中性蛋白酶活性的影響 設5個試驗組，葡萄糖添加量分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，菌液接種量均為10%、含水量均為50%，在室溫下發(fā)酵，每12 h翻堆1次，第6天采樣測定中性蛋白酶活性。

1.2.4 菌液接種量對發(fā)酵棉粕中性蛋白酶活性的影響 設5個試驗組，菌液接種量分別為6%、8%、10%、12%、14%，葡萄糖添加量均為1.5%，含水量均為50%，在室溫下發(fā)酵，每12 h翻堆1次，第6天采樣測定中性蛋白酶活性。

1.2.5 正交試驗 在單因素試驗結果基礎上，設計3因素3水平正交試驗，共9個試驗組合，不同試驗組中的含水量、葡萄糖添加量、菌液接種量詳情見表1；C0為對照組，無任何添加。所有組均在室溫下放置，每12 h翻堆，第6天采樣。測定中性蛋白酶[8]、纖維素酶[9]、植酸酶[10]、果膠酶[11]這4種關鍵酶的活性和粗蛋白[12]、小分子多肽[13]、游離棉酚[14]含量。

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表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors level of orthogonal test %

1.3 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵因素對棉粕中性蛋白酶活性的影響

不同發(fā)酵時間、含水量、葡萄糖添加量和混合菌液接種量條件下棉粕中性蛋白酶活性測定結果見圖1。

2.1.1 不同發(fā)酵時間棉粕中性蛋白酶活性 發(fā)酵棉粕時接種10%的混合菌液、添加1.5%的葡萄糖、含水量為50%，在室溫下發(fā)酵7 d，12 h翻堆1次，每24 h采樣并測定中性蛋白酶活性。由圖1A可知，發(fā)酵0～4 d，棉粕中性蛋白酶含量迅速上升，第4天后含量上升緩慢，第6天中性蛋白酶活性(2 190.91 U/g)顯著高于其他時間(P<0.05)。

2.1.2 不同含水量發(fā)酵棉粕中性蛋白酶活性 發(fā)酵時棉粕的含水量對棉粕中性蛋白酶活性有很大影響。由圖1B可知，接種10%的混合菌液，添加1.5%的葡萄糖，蛋白酶活性隨著水分增加而上升，當含水量為50%時棉粕含中性蛋白酶活為2 386.53 U/g，顯著高于其他含水量組(P<0.05)。當水分含量超過50%時，棉粕中性蛋白酶活性迅速降低。

2.1.3 不同葡萄糖添加量的發(fā)酵棉粕中性蛋白酶活性 適當添加葡萄糖有助于微生物發(fā)酵，由圖3可知，在棉粕中接種10%的混合菌液、含水量為50%，當葡萄糖添加量為0.5%～1.5%時，中性蛋白酶活性逐漸上升，添加量為1.5%時有中性蛋白酶活性3 125.98 U/g，顯著高于其他葡萄糖添加量組(P<0.05)。當葡萄糖添加量超過1.5%時，中性蛋白酶活性迅速降低。

2.1.4 不同混合菌液接種量的發(fā)酵棉粕中性蛋白酶活性 由圖1可知，當混合菌液接種量為6%～8%時，棉粕中性蛋白酶活性隨菌液接種量而上升；接種量為8%時中性蛋白酶活性為2 883.26 U/g，顯著高于其他含水量組(P<0.05)；混合菌液接種量超過8%，隨著混合菌液接種量的增加，棉粕中性蛋白酶活性逐漸降低。

圖1 不同發(fā)酵因素對棉粕中性蛋白酶含量的影響A.發(fā)酵時間；B.含水量；C.葡萄糖添加量；D.混合菌液接種量柱上標相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Fig. 1 Effect of fermentation factors on neutral protease content in cottonseed mealA. fermentation time; B. moisture content; C. glucose amount; D. inoculation of mixed bacterial liquidThe same or the absence of letters above columns indicate insignificant difference (P>0.05),different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The same below

2.2 正交試驗結果

2.2.1 發(fā)酵棉粕中幾種關鍵酶活性 棉粕進行3因素3水平發(fā)酵試驗，中性蛋白酶、纖維素酶、植酸酶和果膠酶活性測定結果見圖2。

2.2.1.1 發(fā)酵棉粕中性蛋白酶活性 由圖2A可知，與C0組(對照組)相比，9個試驗組中性蛋白酶活性均顯著升高(P<0.05)，增長率95.17%～375.83%。C8組中性蛋白酶活性為5 836.09 U/g，C9組中性蛋白酶活性為5 816.80 U/g，顯著高于其他試驗組(P<0.05)。

2.2.1.2 發(fā)酵棉粕纖維素酶活性 由圖2可知，棉粕經微生物發(fā)酵后，除C2、C3組外，其余7個試驗組纖維素酶活性均顯著升高(P<0.05)。C7組纖維素酶活性為3 549.41 U/g，增長率81.51%，顯著高于其他試驗組(P<0.05)；C1、C8組纖維素酶活性次之。

2.2.1.3 發(fā)酵棉粕植酸酶活性 由圖2可知，棉粕經發(fā)酵后，9個試驗組中植酸酶活性均顯著高于C0組(P<0.05)，增長率70.59%～302.51%。C4、C7、C8、C9組植酸酶活性均高于4.74 U/g，顯著高于其他試驗組(P<0.05)。

2.2.1.4 發(fā)酵棉粕果膠酶活性 由圖2可知，棉粕發(fā)酵后果膠酶活性均顯著升高(P<0.05)，增長率41.06%～117.20%。C1組果膠酶活性為118.38 U/g，顯著高于其他試驗組(P<0.05)。C2、C4、C9組次之，果膠酶活性均超過91.42 U/g，增長率均超過65.98%。

圖2 發(fā)酵棉粕關鍵酶活性A.中性蛋白酶；B.纖維素酶；C.植酸酶；D.果膠酶Fig. 2 Activity of key enzymes in fermented cottonseed mealA. neutral protease; B. cellulase; C. phytase; D. pectinase

2.2.2 發(fā)酵棉粕粗蛋白和多肽含量 由表2可知，棉粕經微生物發(fā)酵后，9個試驗組中粗蛋白、多肽含量均顯著升高(P<0.05)，粗蛋白增長率17.72%～34.40%，多肽增長率48.72%～485.89%。試驗組C2、C3、C5、C6、C7、C8、C9中粗蛋白含量均超過56.69%，增長率均超過27.51%。試驗組C7中多肽為60.93 mg/g，增長率為485.01%；C9組次之，多肽含量為49.51 mg/g，增長率375.14%。

表2 發(fā)酵棉粕粗蛋白和多肽含量Table 2 Crude protein and polypeptide contentsin fermented cottonseed meal

2.2.3 發(fā)酵棉粕游離棉酚含量 由圖3可知，棉粕經發(fā)酵后9個試驗組中游離棉酚含量均顯著降低(P<0.05)，降低率16.32%～71.00%。C5、C9組中游離棉酚含量顯著低于其它試驗組(P<0.05)，C5組含量為114.65 mg/kg，降低率為68.92%；C9組含量為106.98 mg/kg，降低率為71.00%。

圖3 發(fā)酵棉粕中游離棉酚含量Fig. 3 Free gossypol in fermented cottonseed meal

3 討 論

本試驗使用高產中性蛋白酶酵母對棉粕進行發(fā)酵，探究了不同時間、含水量、含糖量、含菌量對中性蛋白酶活性的影響。研究發(fā)現發(fā)酵0～4 d，棉粕中性蛋白酶含量迅速上升，第4天后含量上升緩慢，第6天具有最高的中性蛋白酶活2 190.91 U/g。這同Mamo等[15]研究結果一致，可能同微生物的生長活性有關，生物質的生產是由碳水化合物的消耗來支持的，當酶的生產達到最大值時，碳水化合物幾乎被消耗枯竭。發(fā)酵培養(yǎng)基中含水量是決定微生物是否發(fā)酵成功的重要因素之一。當含水量為50%時棉粕中含有最高中性蛋白酶活2 386.53 U/g。當含水量超過50%時，中性蛋白酶活性迅速降低。這可能是水分對固體顆粒物理性質的干擾，普遍認為含水量增加會導致基質的孔隙率降低，進而限制了氧氣的轉移；含水量低會導致基質養(yǎng)分的溶解度降低[16]。研究表明，糖滲透壓可以影響微生物的生長和代謝產物的產生[17]，故對葡萄糖添加量進行了優(yōu)化，發(fā)現當葡萄糖添加量為0.5%～1.5%時，棉粕中性蛋白酶活性逐漸上升，葡萄糖添加量為1.5%時有最高的中性蛋白酶活性3 125.98 U/g。當葡萄糖添加量超過1.5%時，中性蛋白酶活性迅速降低。菌液接種量是影響發(fā)酵進度和代謝物生成量的關鍵因素。菌液接種太多會延長發(fā)酵時間、增加雜菌污染的可能性；菌液接種太多可能導致發(fā)酵前期營養(yǎng)物質的消耗過快[18]。試驗結果表明，當菌液接種為8%時中性蛋白酶活性最高達2 883.26 U/g。

外源酶可以提高家畜對棉粕的利用。非淀粉多糖是阻礙營養(yǎng)物質消化和降低蛋白質利用率的重要因素之一，在飼料中補充非淀粉多糖降解酶(β-葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶)可以顯著降低腸內黏度并改善消化率[19]。植酸酶主要用于增加肌醇六磷酸的降解和磷的利用，并具有提高盲腸氨基酸消化率的潛力[20]。纖維素酶、葡聚糖酶、植酸酶和蛋白酶活性的增加會提高飼料中能量和氮的利用[21]。微生物發(fā)酵棉粕的過程中均能不同程度地分泌各種酶類，且因為條件不同分泌不同的酶[7]。本試驗發(fā)酵使用的酵母菌在前期篩菌時以中性蛋白酶活性為主要指標進行了初篩，以植酸酶、纖維素酶、果膠酶活性及產酸等發(fā)酵性能進行復篩，篩選出的6株高產中性蛋白酶酵母菌同時也可以產植酸酶、纖維素酶和果膠酶。本試驗中檢測了發(fā)酵棉粕中性蛋白酶、植酸酶、纖維素酶、果膠酶活性。結果表明，中性蛋白酶增長率95.17%～375.83%、纖維素酶增長率5.79%～81.51%、植酸酶增長率70.59%～302.51%、果膠酶增長率41.06%～117.20%。C9 組中4種水解酶活性均比較高，這可能是微生物在發(fā)酵棉粕時分泌中性蛋白酶、植酸酶、果膠酶、纖維素酶所需的條件基本一致。

棉粕經微生物發(fā)酵后粗蛋白含量會顯著升高。Jazi等[22]研究表明，棉粕經枯草芽孢桿菌和黑曲霉發(fā)酵后，粗蛋白含量從36.34%升高到39.22%，增長率為7.92%；陳生琴[23]用紅平紅球菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌發(fā)酵棉粕后，粗蛋白含量增長23.56%；周慧林等[24]使用酵母菌發(fā)酵棉粕后，粗蛋白的增長率為37.4%。本試驗中粗蛋白增長率17.72%～34.40%，粗蛋白含量的變化可能與發(fā)酵使用的菌株有關，由于不用微生物在發(fā)酵過程中的作用不同，發(fā)酵時間等因素均會對粗蛋白的含量有影響。棉粕固態(tài)發(fā)酵后粗蛋白質含量都有不同程度提高，這主要是因為在發(fā)酵過程中微生物(主要是有益菌)的呼吸作用消耗了部分有機物料，從而釋放出二氧化碳和水，使產物總量減少，出現了蛋白質的“濃縮效應”，還有部分增加的蛋白質是酵母菌體含有的菌體蛋白質和發(fā)酵過程中無機銨鹽經由酵母菌轉化而成的，這是發(fā)酵產物中粗蛋白質含量提高最有意義的部分。在發(fā)酵過程中，由于微生物大量繁殖，不僅提高了發(fā)酵棉粕蛋白質基料的蛋白質水平，而且在發(fā)酵過程中，棉粕中的植物性蛋白質被微生物代謝利用轉化為菌體蛋白質，這樣也改變了棉粕中蛋白質的品質。棉粕發(fā)酵是一個過程，其中大豆蛋白被分解成小分子多肽，以發(fā)揮超出其營養(yǎng)價值的各種生理功能，并改善對健康有益的食物源生物活性成分。酶促水解可以加快大豆發(fā)酵過程中蛋白質的降解，從而提高肽的產量[25]。本試驗中，9個試驗組多肽含量均顯著升高，增長率48.72%～485.89%。大分子蛋白質經過微生物發(fā)酵后被降解為小分子蛋白質、小肽、氨基酸等小分子物質，使得其更有利于動物的消化利用，同時棉粕中的抗原蛋白也得到了很好地降解，使得蛋白質品質得到提升，這也是發(fā)酵棉粕利用率較高的原因之一。

棉粕中的游離棉酚會通過形成蛋白質-棉酚化合物，抑制機體中蛋白水解活性和消化酶的活性，從而降低單胃動物中蛋白質的利用率和消化率[26]。微生物發(fā)酵不僅可以有效降低游離棉酚含量，改善蛋白質質量[27]，還可以減少飼料中毒素(黃曲霉毒素B1)的含量，具有生物解毒作用[28]。Grewal等[28]利用乳酸菌發(fā)酵棉粕，發(fā)酵6 d時棉酚降低率可以達到70%。Zhang等[29]篩選出一株可以使用棉酚做為碳源的枯草芽孢桿菌，經過發(fā)酵條件優(yōu)化后，游離棉酚含量從289.8 mg/kg降低到61.25 mg/kg，脫毒率為78.86%。在棉粕的發(fā)酵過程中，除微生物降解游離棉酚外，還有可能是游離棉酚同活性蛋白中的游離氨基酸或氨基酸結合形成了棉酚。棉酚可能會以碳源的形式被微生物利用，并被降解成一些沒有毒性或者微生物生產所需的物質。本試驗C9組中游離棉酚從368.82 mg/kg降低到106.98 mg/kg，降低率為71.00%，結果與前人研究報導基本一致。結果表明，微生物發(fā)酵可以顯著降低棉粕抗營養(yǎng)因子，提高營養(yǎng)水平。

4 結 論

本試驗中，棉粕經微生物發(fā)酵后蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、植酸酶4種水解酶活性及粗蛋白、小分子多肽含量顯著提升，游離棉酚含量顯著降低。通過比較，C9組各項指標均較好，蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、植酸酶活性增長率分別為374.25%、30.13%、302.51%和70.48%，粗蛋白和多肽增長率為28.97%和375.14，游離棉酚的降低率為71.00%。優(yōu)化后棉粕發(fā)酵最佳條件為2%的含糖量、8%的含菌量、55%的含水量、在室溫(28 ℃)下發(fā)酵6 d。高產蛋白酶酵母菌對棉粕進行固態(tài)發(fā)酵可顯著提高棉粕品質，為棉粕資源的開發(fā)利用提供理論依據。