分枝桿菌肝素結合血凝素研究進展

陳玉蘭 劉一朵 周向梅

2020年，全球新發(fā)結核病患者為987萬例，雖然發(fā)病數自2000年至今一直在緩慢下降，但仍未達到世界衛(wèi)生組織設定的目標。耐藥菌株的出現(xiàn)、獲得性免疫缺陷綜合征的流行，尤其是新型冠狀病毒肺炎疫情的暴發(fā)，更是復雜化了結核病的防治狀況[1]。在結核分枝桿菌的致病過程中，細菌能夠產生許多黏附素，這些黏附素能夠與宿主機體的中性粒細胞、纖粘蛋白、層粘蛋白、上皮細胞，以及其最主要的宿主細胞——巨噬細胞發(fā)生相互作用，是細菌致病能力的體現(xiàn)，能夠作為診斷標志物[2]。

肝素結合血凝素(heparin-binding adhesins，HBHA)是分枝桿菌屬的細菌所表達的一種黏附素，于1996年首次被Menozzi等[3]在卡介苗中發(fā)現(xiàn)。該蛋白可以使分枝桿菌黏附到宿主細胞上，這種黏附作用可以被肝素或其他類似的硫酸化多糖所阻斷。此外，由于該蛋白可以凝集兔的紅細胞，因此被命名為肝素結合血凝素[3]。

在隨后的研究中，HBHA的結構、功能及其與免疫系統(tǒng)不同模式的相互作用不斷被揭曉。HBHA在致病性分枝桿菌感染機體中發(fā)揮著重要作用，同時，它具有很強的免疫原性。這兩大特點使得HBHA成為許多研究者感興趣的研究對象。

HBHA的結構與表達

目前，尚未有研究提供關于HBHA的X射線衍射或核磁共振的結構信息。但根據已有的研究預測，HBHA是一種細長的、平行卷曲螺旋二聚體蛋白，有3個主要的結構域，分別是：(1)N端跨膜結構域，由靠近N端的15～20個氨基酸組成，是較為保守的區(qū)域；(2)位于中間的卷曲螺旋結構域，該段通過同源蛋白相互作用介導HBHA的二聚化，因此該段可能與血球凝集效應、聚集菌體的作用、“黏著體”的分布形式有關；(3)C端的肝素結合結構域，該段具有富含賴氨酸(K)和丙氨酸(A)的重復序列(KAAPAK和KAAAK)，這些重復序列的數量(尤其是其中的賴氨酸殘基的含量)與HBHA對宿主細胞的黏附能力有關[2, 4]。這些序列里的賴氨酸通常含有1～3個甲基組成的側鏈[2]。甲基化能夠降低HBHA的等電點，提高HBHA在環(huán)境中的穩(wěn)定性，促進HBHA與脂質的結合[5]。見圖1。

注 HBHA氨基酸序列來自Menozzi等[6]的研究，使用Robetta服務器進行同源建模[7-8]，模板為Protein Data Bank中一個基礎的卷曲螺旋模型3HNW[9]，再使用GalaxyRefineComplex服務器優(yōu)化[10]，最后用開源版pymol 2.5(The PyMOL Molecular Graphics System, Version2.5, Schr?dinger公司)進行可視化圖1 H37Rv株結核分枝桿菌HBHA二聚體預測模型

HBHA主要存在于細菌表面，與其黏附功能相適應；此外，HBHA也會被分泌到菌體外。但是，HBHA在細菌表面的分布并不是均質性的，HBHA分子聚集成納米尺度大小的“黏著體”散布在細菌表面。一個推測是，HBHA分子因為擁有卷曲螺旋結構域，所以具有同源蛋白相互作用，這可能是其聚集形成黏著體的原因。還有一種推測是，“黏著體”中可能還存在著除了HBHA以外的蛋白，多種分子的相互結合促使了這一結構的出現(xiàn)[11]。

Delogu等[12]在2006年發(fā)現(xiàn)，結核分枝桿菌在感染A549上皮細胞后顯著提高了HBHA的表達；而在感染巨噬細胞時，HBHA一直保持較低的表達水平；在經氣溶膠接種的小鼠身上，肺部細菌HBHA的表達量比在脾臟高，說明肺上皮細胞內的環(huán)境能夠促進細菌表達HBHA。這種上調過程可能涉及到Rv0613c假定蛋白，因為Rv0613c與HBHA在細胞膜上的定位相關[13]。在Lanfranconi等[14]的研究中，致病性分枝桿菌的HBHA基因與其上游的轉錄調節(jié)因子調節(jié)區(qū)存在較長的基因間區(qū)，可以容許一些轉錄調控因子如SigF因子及其他的Sigma因子、HBHR等的識別，而非致病性的分枝桿菌的這一區(qū)域不存在或很短。這些轉錄因子有可能將HBHA的表達水平與細菌面臨的環(huán)境壓力聯(lián)系起來。

HBHA的功能

一、HBHA可以黏附上皮細胞并擴散感染

許多分枝桿菌，包括致病性(結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、副結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌等)和非致病性(恥垢分枝桿菌)分枝桿菌都能表達自己的HBHA蛋白，各種細菌的HBHA在氨基酸序列、結構和黏附能力上有所差別[15]。致病性分枝桿菌的HBHA已被證實可黏附多種上皮細胞，包括Hep2人喉上皮細胞[16]、a-549人Ⅱ型肺泡上皮細胞[17-18]、Caco2腸上皮細胞[19]、16 HBE人支氣管上皮細胞[20]。這些證據表明HBHA是致病性分枝桿菌重要的毒力因子，在細菌侵襲、感染機體的過程中發(fā)揮了重要的黏附作用。HBHA即使不形成黏著體，也可黏附到宿主細胞上[16]。因此，HBHA形成黏著體，可能的作用是增強黏附作用；或者是促進細胞將細菌內化。

在黏附上皮之后，進一步地，HBHA還可以介導細菌穿透上皮屏障，擴散感染范圍。Pethe等[20]在2001年發(fā)現(xiàn)HBHA對結核分枝桿菌的肺外感染有重要作用：當細菌的HBHA基因被沉默之后，細菌在脾臟的定植數量明顯減少，但在肺臟的定植卻不受影響。在2016年，Ryndak等[21]制造了“細菌-A549肺泡Ⅱ型細胞層-可滲透膜-HPAE26人肺動脈內皮”的體外模型，發(fā)現(xiàn)單獨缺失早期分泌抗原靶蛋白6(early secreted antigenic target of 6 kd，EAST-6)，或者同時缺失EAST-6和HBHA都可使穿過這層屏障的細菌數量顯著下降，缺乏EAST-6和HBHA的雙突變菌株的穿透能力要小于單獨缺失EAST-6的單突變株。Menozzi等[16]在2006年的研究中，還發(fā)現(xiàn)HBHA觸發(fā)了內皮細胞的轉胞吞作用。這些證據說明HBHA是細菌突破氣血屏障的重要因素之一，可以與其他致病因子共同發(fā)揮作用。

HBHA的黏附作用可以被肝素阻斷，這一現(xiàn)象把我們的視線轉向宿主機體內的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)。HSPG是一種廣泛分布在機體內部的蛋白質，執(zhí)行作為細胞黏附受體、內吞信號受體、細胞因子的貯庫、調節(jié)形態(tài)發(fā)育等的功能[22]。有研究表明，小鼠體內有一類HSPG被稱為Syndecans(Sdcs)，敲除小鼠的Sdc-1與Sdc-4基因可以提高小鼠對肺結核的抵抗力；而過度表達Sdc4會加重結核分枝桿菌對Ⅱ型肺泡上皮細胞的黏附現(xiàn)象[23]。但目前，并沒有研究確定直接能和HBHA發(fā)生作用的具體HSPG，也不能確定HBHA穿透上皮、促使內皮細胞發(fā)生轉胞吞活動這兩個事件與HBHA的肝素結合能力之間的聯(lián)系。

二、HBHA的其他功能

Raze等[24]發(fā)現(xiàn)，結核分枝桿菌的HBHA參與了細菌內部脂質體的形成。有研究發(fā)現(xiàn)，結核分枝桿菌的HBHA能夠與分枝桿菌膜蛋白14(mycobacterial membrane protein large 14，MmpL14；與細菌的脂質和鐵的運輸有關)[13]、膽固醇代謝相關蛋白Rv3568c和Rv3515c[25]、血紅素降解蛋白Rv3592[25]發(fā)生相互作用。Armstrong等[26]也發(fā)現(xiàn)，HBHA是恥垢分枝桿菌的脂質體中含量最為豐富的蛋白質。在范琳琳[27]的研究中，HBHA蛋白能與宿主的磷酸肌醇-4-磷酸接頭蛋白2在胞外相互作用，而磷酸肌醇-4-磷酸接頭蛋白2是動物機體細胞內的一種糖脂轉運蛋白。這些結果說明，HBHA可能參與了細菌內部的物質運輸和儲存，也可能參與了細菌對宿主營養(yǎng)物質的攫取過程，在細菌的生存中發(fā)揮作用。

此外，根據最初發(fā)現(xiàn)者Menozzi等[3]的研究，HBHA可以介導細菌彼此聚集、黏附形成生物膜，有學者推測這是因為其卷曲螺旋結構域所介導的作用[2]。而生物膜的形成可以增強結核分枝桿菌對體外環(huán)境、抗生素、體內免疫防御的抵抗力[28]。

HBHA與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用

一、HBHA與先天性免疫

Mueller-Ortiz等[29]證明了結核分枝桿菌、鳥分枝桿菌和恥垢分枝桿菌表面的HBHA可與人類C3補體結合，并且結核分枝桿菌HBHA的這種作用能夠提高細菌進入巨噬細胞的效率。結核分枝桿菌HBHA與C3補體的結合作用也依賴于C端富含賴氨酸的重復序列。

在Menozzi等[16]2006年的研究中，還發(fā)現(xiàn)HBHA膠體金顆粒被Hep2上皮細胞內吞后，有部分顆粒脫離了內吞泡，進入到了細胞質中，這說明HBHA可能具有介導細菌從吞噬體中逃離，進入細胞質的作用。在2017年Zheng等[30]的研究中，與對照組相比，表達結核分枝桿菌HBHA蛋白的恥垢分枝桿菌能夠使A549上皮細胞中的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著下降，且荷菌量顯著提高，說明HBHA蛋白能夠抑制肺泡Ⅱ型上皮細胞的自噬活動。

HBHA可以使巨噬細胞發(fā)生線粒體損傷及內質網應激進而凋亡的進程，但HBHA如何導致線粒體損傷的具體分子活動過程尚不完全明確[31]。范琳琳[27]通過GST pull down技術發(fā)現(xiàn)，進化保守的Toll信號通路接頭分子(evolutionarily conserved signaling intermediate in Toll pathway，ESCIT；是線粒體呼吸鏈蛋白Ⅰ的組成成分之一)可以在胞外與HBHA相互作用。但暫無更直接的證據表明ESCIT就是HBHA損傷線粒體的位點。

HBHA除了導致巨噬細胞的凋亡，還刺激巨噬細胞促炎因子的分泌。2011年，Kim等[32]發(fā)現(xiàn)HBHA可以使巨噬細胞NF-κB和p38激活，導致巨噬細胞白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達量增加；范琳琳[27]也發(fā)現(xiàn)HBHA 可以誘導巨噬細胞向M1狀態(tài)極化，使其分泌IL-6、IL-12和TNF-α。圖2總結了HBHA與巨噬細胞的相互作用。

注 肝素結合血凝素通過補體受體進入巨噬細胞后，可以阻礙自噬，造成線粒體損傷和內質網應激，還可以激活NF-κB轉錄因子及MAPK信號轉導通路，后者可以使巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子α和白細胞介素6；HBHA：肝素結合血凝素圖2 HBHA與巨噬細胞的相互作用

二、HBHA與特異性免疫

(一)HBHA特異的細胞免疫

HBHA是一種優(yōu)良的細胞免疫激活物。經HBHA刺激后，結核分枝桿菌潛伏感染者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell)分泌的γ-干擾素(IFN-γ)水平遠高于無感染者和活動性肺結核患者，類似的結論已經被隨后的許多研究所證實[33-37]，這提示全身循環(huán)中的HBHA 特異性IFN-γ的作用是保護性的，且有可能成為診斷潛伏感染的依據。這些IFN-γ主要來源于外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞[38]。Hougardy等[39]發(fā)現(xiàn)，結核病患者外周血中HBHA特異的調節(jié)性T細胞(CD4+CD25highFOXP3+亞群)顯著多于潛伏感染者，這個亞群的T細胞雖然不能抑制感染灶內CD4+和CD8+T淋巴細胞分泌IFN-γ，但是有可能與外周血中IFN-γ水平下降有關[40]。這也提示了全身性的免疫反應在阻止結核病發(fā)展的過程中也存在重要作用。

Temmerman等[41]研究證明，分泌HBHA特異性IFN-γ的CD8+T淋巴細胞能夠有效促進針對巨噬細胞內的結核分枝桿菌的殺滅作用；這些CD8+T淋巴細胞大多數為記憶性CD8+T淋巴細胞，能發(fā)揮顆粒酶依賴的細胞毒作用，殺死負載有HBHA的靶細胞。

在Jung等[42]的研究中，HBHA通過激活Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)來促進樹突狀細胞的成熟，提高了其表面CD40、CD80和CD86、MHC Ⅰ和Ⅱ類分子，以及促炎因子IL-6、IL-12、IL-1β、TNF-α和趨化因子受體7(chemokine receptor 7，CCR7)的表達，增強了樹突狀細胞在體外和體內的遷移能力，并誘導T細胞向Th1細胞分化和增殖。在Jung等[42]的研究中，還證明了HBHA這種效應在小鼠胸腺瘤治療中的潛能。

值得注意的是，HBHA介導Th1細胞產生保護作用的部位可能是其具有黏附作用的富含甲基化賴氨酸的C端結構。Temmerman等[43]在2004年證明，原型HBHA(直接從結核分枝桿菌中分離得到的HBHA)與重組HBHA(利用大腸埃希菌表達系統(tǒng)得到的HBHA，沒有甲基化修飾)相比，前者使淋巴細胞產生的特異性免疫效果更好，它能使淋巴細胞在面對相應的HBHA刺激時產生更多的IFN-γ和TNF-α，發(fā)揮更大的細胞毒效應或殺菌作用。Corbière等[44]在2020年使用肽掃描技術證明，在結核分枝桿菌潛伏感染者中，HBHA的甲基化C端能夠刺激其Th1細胞分泌IFN-γ，如果HBHA的C端不是甲基化的，就沒有這種刺激效果。

但在Kohama等[45]的試驗中，對于Th17細胞來說，非甲基化狀態(tài)的HBHA配合霍亂毒素佐劑和鼻腔接種，就可以導致IL17的分泌，說明HBHA的刺激活性主要體現(xiàn)在Th1細胞上。

(二)HBHA特異的黏膜免疫

除了細胞免疫，HBHA引起的黏膜免疫也有一定的保護效果。在Pethe等[20]的研究中，使用HBHA特異的抗體孵育后的卡介苗株通過鼻腔接種感染小鼠，可以降低其向肺外傳播的能力。Kohama等[45]使用酵母表達的重組HBHA和霍亂毒素(黏膜免疫刺激佐劑)對小鼠進行滴鼻接種，接種后，在免疫組小鼠的血清和鼻腔灌洗液中檢測到了顯著增多的HBHA特異性IgA抗體；在感染卡介菌后，肺臟荷菌量不受影響，而脾臟荷菌量降低，即黏膜接種HBHA的方法雖然不能抑制結核分枝桿菌在肺內的感染，但是可以抑制其向肺外傳播。隨后，在該實驗室進一步的研究中，將卡介苗與他們制作的這種疫苗使用加強免疫策略接種小鼠，能在小鼠感染結核分枝桿菌的早期降低肺部的荷菌量，但在感染后期卻無法提供在肺部的保護效果。他們推測，皮下接種卡介苗可以在全身引發(fā)特異性Th1細胞的生成，而鼻腔接種HBHA和霍亂毒素制成的疫苗導致呼吸道產生了Th17反應，表達了趨化因子，進而使全身特異性Th1細胞向肺部趨化，從而提供了抵抗結核分枝桿菌的力量；在感染后期，這種保護效果消失了，他們推測是由于霍亂毒素引起的Th2反應抑制了Th1反應所致[46]。這些研究也說明，免疫策略和佐劑選擇對HBHA所引起的免疫反應也有很大的影響。在佐劑方面，Rouanet等[47]使用雙十八烷基二甲基溴化銨/單磷酰脂質體A佐劑制作的HBHA疫苗，對BCG初免后的小鼠進行皮下免疫，發(fā)現(xiàn)可以有效降低Th2反應。

(三)HBHA特異的體液免疫

但體液免疫對HBHA的反應與細胞免疫和黏膜免疫并不相同，HBHA特異的IgG似乎并不能提供保護力。在Masungi等[38]的研究中，活動性結核病患者的血清抗HBHA抗體水平遠高于潛伏感染者，而未感染者和卡介苗接種者血清中都檢測不到抗HBHA抗體。Rouanet等[47]使用HBHA疫苗與卡介苗加強免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)HBHA特異的抗體與這種免疫策略所提供的保護力無統(tǒng)計學關聯(lián)。在Parra等[48]的研究中，向小鼠體內注射抗結核分枝桿菌HBHA的單克隆抗體以進行被動免疫，再攻菌，發(fā)現(xiàn)無論是肺臟、肝臟還是脾臟的荷菌量，被動免疫組都與空白組和對照組沒有區(qū)別。這說明HBHA的血清IgG抗體并不能給機體帶來有效的保護性免疫，但可以作為一個區(qū)分潛伏感染者和活動性結核病患者的診斷標志。

然而，在Belay等[49]的一項隊列研究中，還發(fā)現(xiàn)未經治療的結核病患者血清中HBHA特異性的IgA比未感染組和潛伏感染組要低，也可作為診斷或治療監(jiān)測指標。這可能提示HBHA特異的血清IgA是有保護性的。關于血清IgA在感染免疫中的作用少有研究，在目前的一些研究中，血清IgA可以通過調理作用促進血液中的病原被清除，還可以誘導中性粒細胞發(fā)生呼吸爆發(fā)[50]。雖然機制不明，但HBHA特異的IgG和IgA具有診斷的應用意義。

(四)小結

HBHA特異的細胞免疫能引發(fā)機體對結核病的保護作用，但HBHA特異的體液免疫卻沒有保護效果。盡管提供的保護效果不盡相同，但和結核分枝桿菌其他免疫原一樣，這二者在活動性肺結核患者和結核分枝桿菌潛伏感染者中是不同的，可以開發(fā)和研究其作為診斷結核分枝桿菌潛伏感染依據的方法。

HBHA特異的黏膜免疫能夠抑制肺外結核的產生，這無疑是非常具有治療或免疫保護意義的。

總 結

首先，HBHA對上皮的黏附與穿透能力是分枝桿菌對呼吸道造成疾病的重要因素。該過程中的具體HSPG受體有待揭露。Pethe等[20]和Fukui等[46]的研究提示，HBHA特異的黏膜免疫雖然可以較為有效地阻止其向肺外傳播，但卻并不能阻止細菌在肺內定植，也無法在感染后期提供保護，這可能是因為介導分枝桿菌進入上皮細胞的還有其他毒力因子(如EAST-6)。因此，僅僅針對HBHA的抗黏附療法(如阻斷HBHA與HSPG的結合，或者影響HSPG的下游信號)可能并不足以完全抵抗結核病。同理，如果將HBHA 作為一種對抗結核病的疫苗，仍需要與其他免疫原和佐劑進行搭配，因為僅僅HBHA特異的免疫反應是不足以抵抗結核病的。

由于潛伏感染者與活動性結核病患者的HBHA特異的細胞免疫也存在差異，具體表現(xiàn)為外周血單個核細胞分泌的IFN-γ量不同，Tang等[51]證明了這種不同可以區(qū)分潛伏感染和活動性結核??；Chedid等[52]證明了這種特異的IFN-γ的量可以用于區(qū)分不同程度的結核病。Dreesman等[53]利用這一點來檢測結核病低發(fā)病率地區(qū)的兒童結核病患者；Benhadou等[54]將其用于對銀屑病患者的結核病風險分級。

HBHA的保護作用主要體現(xiàn)在它能夠引起機體的細胞免疫。這使得其具有作為免疫佐劑和刺激細胞免疫的潛能，可以在缺乏細胞免疫的生物制品中發(fā)揮作用。已經有學者將HBHA作為免疫增強劑應用于口蹄疫疫苗[55]和腫瘤治療[42]中。通過計算機模擬設計疫苗的方法，Vivekanandam等[56]將HBHA應用到新型冠狀病毒肺炎疫苗的設計中；Muhammad等[57]將HBHA應用到2型糖尿病疫苗的設計中。

另外，HBHA具有親嗜上皮的性質。利用這一點，HBHA 偶聯(lián)的免疫原或者藥物可以被引導到上皮組織。目前，已有一些學者將HBHA與結核分枝桿菌的其他抗原一起制成接種在呼吸道黏膜上的新型疫苗，將其親嗜肺上皮、促進擴散的能力轉為靶向作用，使疫苗靶向肺部，擴散免疫反應的范圍，并且產生了一定的保護效果[58-59]。

因此，HBHA對細胞免疫的刺激能力，以及親噬呼吸道上皮的能力是可以加以利用的；但需要考慮的是，這些應用了HBHA輔助防治非結核病的疫苗，是否會增加那些通過HBHA診斷結核病的試劑或方法的假陽性率。

同結核分枝桿菌許多抗原一樣，結核分枝桿菌潛伏感染者、活動性結核病患者、未感染者對HBHA的特異性免疫存在異質性，因此HBHA可以作為診斷抗原幫助控制結核病，也可以借助這種異質性，進一步去探索潛伏感染者與活動性結核病患者之間免疫反應的差異，從而了解更多結核病的發(fā)病機制。