干擾lncRNA SNHG22抑制EPHA3基因?qū)Y(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞周期與凋亡的影響

姜進(jìn)平 朱鐘鐘 黃耿 程凱 羅海平

1鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）胃腸肛腸外科 435000；2鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）泌尿外科 435000

結(jié)直腸癌在大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)的病例數(shù)呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)，是腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一［1］。對(duì)于中晚期結(jié)直腸癌患者，其預(yù)后較差，5 年生存率非常低［2］。探究結(jié)直腸癌發(fā)生的調(diào)控機(jī)制，有助于開發(fā)新的診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類新型小分子非編碼RNA，因?yàn)椴痪哂芯幋a蛋白潛力，曾被認(rèn)定為轉(zhuǎn)錄的“噪音”［3］。最近研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在染色質(zhì)重塑、染色體失活、轉(zhuǎn)錄激活等生物過程中發(fā)揮重要功能［4］。lncRNA 已被證實(shí)作為抑癌基因或癌基因影響包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［5］。據(jù)報(bào)道，SNHG22 在甲狀腺癌、卵巢癌、胃癌等腫瘤中高表達(dá)，是惡性腫瘤進(jìn)展的重要因素［6-8］。SNHG22 在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能和潛在分子機(jī)制尚不清楚。本研究探討了干擾SNHG22表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞周期和凋亡的影響，探討其在結(jié)直腸癌細(xì)胞中可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 結(jié)直腸癌LoVo 細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；針對(duì)SNHG22 的小干擾RNA（si-SNHG22）、小干擾RNA 陰性對(duì)照（si-NC）購(gòu)于上海GenePharma 公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司；抗體GAPDH、Cyclin H、Caspase6、CDK3、促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞A 型受體3（erythropoietin-producing hepatocellular receptor A3，EPHA3）購(gòu)于美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和感染 將LoVo 細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，保持在37 ℃、5%CO2環(huán)境下生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，接種LoVo 細(xì)胞在12 孔板，使用Lipofectamine 3000 將si-SNHG22 或si-NC 轉(zhuǎn)染到LoVo 細(xì)胞，即si-SNHG22 組和si-NC 組。轉(zhuǎn)染5 h 后，替換為完全DMEM培養(yǎng)基。

1.3 qRT-PCR 檢測(cè)SNHG22 和EPHA3 信 使RNA（mRNA）的表達(dá) 采用TRIzol試劑從轉(zhuǎn)染后的LoVo 細(xì)胞中提取總RNA，采用PrimeScript RT 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR 擴(kuò)增以GAPDH 為內(nèi)源性對(duì)照。引物序列如下：SNHG22 正向引物5’-AGGAGAGCTGCTCTTCACAGG-3’，反向引物5’-TCCTAGGCTGAGTGTGTCTCC-3’；EPHA3 正向引物5’-ACTCTACGAGACTGCAATAGCA-3’，反向引物5’-TCCCCAAGATCCATTTGAGTGA-3’。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行SNHG22和EPHA3 mRNA表達(dá)的計(jì)算。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估LoVo 細(xì)胞周期 收集轉(zhuǎn)染后的LoVo細(xì)胞，70%體積分?jǐn)?shù)的乙醇重懸固定5 h。采用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，加入PI試劑和RNA酶試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)避光染色35 min。通過流式細(xì)胞儀分析LoVo細(xì)胞周期分布。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估LoVo 細(xì)胞的凋亡 收集轉(zhuǎn)染后的LoVo 細(xì)胞，采用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，Annexin V-FITC試劑重懸細(xì)胞，加入PI 染液，4 ℃下避光染色35 min，補(bǔ)充Annexin V-FITC 試劑，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)LoVo 細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡，兩者之和即為細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 通過RIPA 緩沖液提取轉(zhuǎn)染后的LoVo 細(xì)胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離40 μg 蛋白裂解物，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。10%脫脂牛奶將膜進(jìn)行封閉。與一抗在4 ℃下孵育過夜（GAPDH、EPHA3、Cyclin H、Caspase6、CDK3 抗體均按1∶1 000 稀釋），然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育4 h。采用ECL試劑顯影目標(biāo)蛋白條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，組間數(shù)據(jù)之間統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SNHG22 在LoVo 細(xì)胞中的干擾情況 si-NC組 和si-SNHG22 組SNHG22 的表達(dá)分別為（1.07±0.15）和（0.22±0.04），si-NC 組SNHG22 表達(dá)是si-SNHG22 組的4.86 倍（P＜0.01），提示干擾SNHG22 明顯降低LoVo 細(xì)胞中SNHG22的表達(dá)水平。

2.2 干擾SNHG22 阻滯LoVo 細(xì)胞周期 細(xì)胞周期結(jié)果（圖1）顯示，與si-NC 組相比，干擾SNHG22 明顯增加LoVo 細(xì)胞的G0～G1 期細(xì)胞比例（P＜0.01），明顯減少S 期細(xì)胞比例（P＜0.05）。

圖1 干擾SNHG22對(duì)LoVo細(xì)胞周期的影響

2.3 干擾SNHG22 促進(jìn)LoVo 細(xì)胞的凋亡 細(xì)胞凋亡結(jié)果（圖2）顯示，si-NC組和si-SNHG22組LoVo細(xì)胞凋亡率分別為（10.84±3.22）%和（40.61±5.96）%。與si-NC 組相比，干擾SNHG22后，LoVo細(xì)胞的凋亡率明顯增加（P＜0.01）。

圖2 干擾SNHG22對(duì)LoVo細(xì)胞凋亡的影響

2.4 干擾SNHG22 抑制LoVo 細(xì)胞中EPHA3 mRNA 表達(dá) si-NC 組和si-SNHG22 組LoVo 細(xì)胞中EPHA3 mRNA的表達(dá)分別為（1.31±0.12）和（0.31±0.06），與si-NC 組相比，干擾SNHG22 顯著降低LoVo 細(xì)胞EPHA3 mRNA 表達(dá)（P＜0.01）。

2.5 EPHA3 蛋白和凋亡及周期相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot 結(jié)果（圖3）表明，與si-NC 組相比，干擾SNHG22 明顯降低LoVo 細(xì)胞EPHA3 蛋白水平，顯著提高細(xì)胞凋亡蛋白Caspase6 表達(dá)水平，顯著降低細(xì)胞周期蛋白Cyclin H、CDK3表達(dá)水平。

圖3 干擾SNHG22對(duì)LoVo細(xì)胞EPHA3蛋白和凋亡、周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

迄今為止，lncRNA 如SNHG6［9］、miR4435-2HG［10］、NEAT1［11］、CCAL［12］等被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織或細(xì)胞株重表達(dá)失調(diào)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)移等各種生物過程。作為一種新型腫瘤促進(jìn)因子，SNHG22在卵巢癌組織中表達(dá)顯著增加，并且與卵巢癌的低分化水平顯著相關(guān)，SNHG22 可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的化療耐藥性，而敲低SNHG22 表達(dá)可以增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑和紫杉醇的敏感性［6］。在甲狀腺乳頭狀癌組織和細(xì)胞株中觀察到高表達(dá)的SNHG22，其高表達(dá)水平與甲狀腺乳頭狀癌患者不利的臨床病理特征和較差的總生存率密切相關(guān)，敲低SNHG22 通過調(diào)節(jié)miR-429表達(dá)在體外有效抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，加速細(xì)胞凋亡［8］。SNHG22 在胃癌組織中高表達(dá)，SNHG22通過結(jié)合miR-361-3p促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞周期，抑制胃癌細(xì)胞凋亡［7］。以上的研究表明，SNHG22 是一個(gè)致癌lncRNA。SNHG22 對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)展的影響尚需進(jìn)一步研究。

為了確定SNHG22 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的詳細(xì)功能，本研究利用RNA 干擾技術(shù)下調(diào)LoVo 細(xì)胞中SNHG22 的表達(dá)水平，隨后在對(duì)LoVo 細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，干擾SNHG22表達(dá)顯著提高了LoVo細(xì)胞G0～G1期的細(xì)胞比例，減少了S 期的細(xì)胞比例，并且增加了LoVo 細(xì)胞的凋亡率。同時(shí)，Western blot 結(jié)果表明干擾SNHG22 可提高LoVo 細(xì)胞凋亡蛋白Caspase6 表達(dá)水平，降低細(xì)胞周期蛋白Cyclin H、CDK3 表達(dá)水平。這意味著干擾SNHG22 表達(dá)能夠顯著抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。EPHA3基因定位于人類染色體3p11.2，EPHA3 蛋白首次被發(fā)現(xiàn)在B 淋巴白血病細(xì)胞表面，其結(jié)構(gòu)高度保守。正常組織中EPHA3 蛋白呈微量表達(dá)，但其在多種實(shí)體瘤如胃癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等過度表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤的血管形成、大小、分級(jí)、侵襲以及患者的生存率顯著相關(guān)［13-14］。EPHA3高表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，過表達(dá)EPHA3 可促進(jìn)結(jié)直腸上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，在結(jié)直腸上皮細(xì)胞中發(fā)揮促癌功能［15］。本研究在qRT-PCR和Western blot測(cè)定中，檢測(cè)到干擾SNHG22 表達(dá)后，LoVo 細(xì)胞中EPHA3 基因表達(dá)水平顯著降低，提示干擾SNHG22 抗結(jié)直腸癌的功能可能是通過下調(diào)EPHA3基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，干擾SNHG22 表達(dá)通過下調(diào)EPHA3 基因表達(dá)，抑制結(jié)直腸癌LoVo 細(xì)胞周期進(jìn)展，誘導(dǎo)LoVo 細(xì)胞的凋亡，SNHG22 可能成為結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)志物和分子治療靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。