人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3-L1體外增殖分化對(duì)比觀察

李肖曉，劉波，阿爾孜古麗?吐爾遜，張明琛

1新疆醫(yī)科大學(xué)健康管理學(xué)院，烏魯木齊 830000；2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床研究院；3中國(guó)科學(xué)院大學(xué)附屬寧波市華美醫(yī)院內(nèi)分泌科

人體脂肪組織具有可塑性，隨著體質(zhì)量增加、年齡增長(zhǎng)，脂肪組織擴(kuò)張，脂肪細(xì)胞的體積增大數(shù)目增多［1］。內(nèi)臟脂肪組織不僅是人體供能組織，還是重要的內(nèi)分泌器官。內(nèi)臟脂肪增加后，募集巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞、分泌多種炎癥因子、免疫調(diào)節(jié)因子［2］，激活體內(nèi)炎癥氧化反應(yīng)，促進(jìn)了糖尿病、非酒精性脂肪肝病、冠心病等多種代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展［3］。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（3T3-L1）是一種脂肪干細(xì)胞、前體脂肪細(xì)胞，3T3-L1及其亞克隆系3T3-F442A［4］，以及辛普森變異綜合征嬰兒皮下脂肪干細(xì)胞［5］、成年人皮下脂肪干細(xì)胞［6］，都被用于研究脂肪細(xì)胞的功能代謝。但由于種屬不同或脂肪來源部位差異，這些脂肪細(xì)胞模型無(wú)法替代人內(nèi)臟脂肪細(xì)胞。若在體外予以適宜處理，人網(wǎng)膜組織即可成為理想的內(nèi)臟脂肪來源。本研究通過提取人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞，并以3T3-L1作對(duì)照，將兩種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，比較其增殖和分化情況，總結(jié)人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞體外增殖分化特點(diǎn)，旨在可為后續(xù)研究人內(nèi)臟脂肪細(xì)胞代謝功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織來源 選取2021年1—3月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的因膽囊炎或膽囊結(jié)石需行外科手術(shù)治療的超重或者肥胖患者12例，男7例，女5例；年齡（49.16±14.22）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：18歲≤年齡<70歲，BMI≥24 kg/m2。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有糖尿病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、肝腎功能不全及近半年體質(zhì)量變化>10%者。手術(shù)取腹腔內(nèi)大網(wǎng)膜脂肪組織0.5～2 g。小鼠來源的3T3-L1由新疆醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究院細(xì)胞室提供。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器 磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Biological Indus‐tries公司），DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、Ⅰ型膠原酶（Gibco公司），青霉素鏈霉素混合溶液（Hyclone公司），2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽（Cell Counting Kit-8試劑盒，博奧森公司），3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、吲哚美辛、地塞米松、10 mg/mL胰島素溶液（Sigma公司），油紅O染色液（Solarbio公司）。超凈工作臺(tái)，細(xì)胞培養(yǎng)箱，上海安亭TDL-5-A離心機(jī)，OLYMPUS IX73倒置顯微鏡，BIO-RAD iMark酶標(biāo)儀。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)基、分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制 ①細(xì)胞培養(yǎng)基：取44.5 mL的DMEM高糖培養(yǎng)基、5 mL胎牛血清、500μL青霉素鏈霉素溶液，加入50 mL離心管中。②成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基：稱取IBMX 55.56 mg，加入無(wú)水乙醇5 mL，混勻溶解，配成0.05 mmol/mL的IBMX溶液。稱取吲哚美辛71.55 mg，加入無(wú)水乙醇1.43 mL，混勻溶解，配成0.14 mmol/mL吲哚美辛溶液。稱取地塞米松1 mg，加入無(wú)水乙醇1 mL，混勻溶解，配成1 mg/mL地塞米松溶液。取556μL的IBMX溶液、35μL吲哚美辛溶液、20μL地塞米松溶液、50μL胰島素溶液、500μL青霉素鏈霉素混合溶液、5 mL胎牛血清混合，再加入DMEM高糖培養(yǎng)基定容至50 mL，即配成分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其中IBMX最終濃度0.5 mmol/L，吲哚美辛最終濃度0.1 mmol/L，地塞米松最終濃度1 mmol/L，胰島素最終濃度10 mg/L。配成50 mL分化誘導(dǎo)液后，用0.22μm濾器過濾除菌。

1.4 人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞、3T3-L1體外培養(yǎng)及生長(zhǎng)情況觀察 ①人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞：a.原代培養(yǎng)：取患者的網(wǎng)膜脂肪組織2 g，置于培養(yǎng)皿中，滴加2 mL的PBS、1 mL的青霉素鏈霉素溶液，清洗大網(wǎng)膜的血跡，使用眼科剪剪去大網(wǎng)膜組織上肉眼可見的血管和纖維，盡量減少血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的污染，用眼科鑷將0.5～1 cm3大小的脂肪顆粒夾入50 mL離心管，加入兩倍體積的Ⅰ型膠原酶溶液（濃度2 mg/mL），移至培養(yǎng)箱，消化30 min。消化組織后，向膠原酶溶液中加入含血清的培養(yǎng)液2 mL終止消化，獲得組織消化液，經(jīng)100μm細(xì)胞過濾器，過濾掉油脂、未消化的纖維組織和成熟脂肪細(xì)胞，獲得脂肪基質(zhì)細(xì)胞懸液，移入15 mL離心管，1 500 r/min速度離心5 min。見管底細(xì)胞沉淀，輕輕吸去上清。再加入1 mL的PBS，再次同樣轉(zhuǎn)速離心。見管底細(xì)胞沉淀，輕輕吸去上清。向細(xì)胞沉淀加入1 mL完全培養(yǎng)液，吹打混勻，移入25 cm2培養(yǎng)瓶，加完全培養(yǎng)液至6 mL，移至培養(yǎng)箱。獲得的脂肪基質(zhì)細(xì)胞中混有多種細(xì)胞，包括具有多能分化潛能的脂肪干細(xì)胞、成熟脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，因此每日觀察細(xì)胞貼壁情況，第3天有部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁，可以進(jìn)行半量換液，即吸出舊培養(yǎng)液3 mL，加入新鮮培養(yǎng)液3 mL，繼續(xù)培養(yǎng)，等待7 d左右，貼壁細(xì)胞更多，可以再次換液，換6 mL新鮮培養(yǎng)液。b.傳代：原代細(xì)胞經(jīng)過貼壁生長(zhǎng)，10 d左右，單層細(xì)胞覆蓋70%～80%瓶壁，吸除培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，加入2 mL的PBS漂洗。加入1 mL胰蛋白酶，顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，用移液槍吹打平底細(xì)胞，獲得細(xì)胞懸液，此時(shí)加入完全培養(yǎng)液2 mL終止消化。將細(xì)胞懸浮液移入15 mL離心管，1 000 r/min速度離心5 min。見管底細(xì)胞沉淀，輕輕吸去上清。再加入1 mL PBS，吹打混勻，1 000 r/min速度離心5 min。見管底細(xì)胞沉淀，輕輕吸去上清。向細(xì)胞沉淀加入1 mL完全培養(yǎng)液，吹打混勻，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加培養(yǎng)液至6 mL，移至培養(yǎng)箱，等待24 h后，細(xì)胞貼壁。②3T3-L1：復(fù)蘇凍存的3T3-L1，另將500 mL搪瓷杯中注入蒸餾水，放置在電加熱套上，加熱至水溫37℃；從液氮罐中迅速取出凍存管，放入已加熱的蒸餾水中；等待1 min，凍存管中的細(xì)胞懸液融化；凍存管放入上海安亭TDL-5-A離心機(jī)，1 000 r/min速度離心5 min；從離心機(jī)中取出凍存管，外噴75%酒精后，滅菌紗布擦拭凍存管，置于超凈臺(tái)上；用移液槍小心吸除凍存管上層液體，留下下層細(xì)胞沉淀；再向凍存管中加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打成細(xì)胞懸液；移液槍吸取細(xì)胞懸液移入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，再加入5 mL細(xì)胞培養(yǎng)基；將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入細(xì)胞培養(yǎng)箱；24 h后予以換液；72 h后3T3-L1密布于培養(yǎng)瓶底，予以傳代。

1.5 人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞、3T3-L1增殖曲線繪制 ①人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞：取培養(yǎng)成功的第2代人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，按4×104/孔接種于96孔板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔為一組，共10組，每天測(cè)一組細(xì)胞的吸光值。24 h后細(xì)胞貼壁，選擇第一組細(xì)胞，每孔換新鮮培養(yǎng)基100μL、加10μL的CCK-8溶液（四唑鹽溶液），另設(shè)3個(gè)無(wú)細(xì)胞對(duì)照孔，加等體積的培養(yǎng)液和CCK-8溶液；其余暫未測(cè)定的細(xì)胞，也需每日換液，每孔100μL培養(yǎng)基。37℃孵育2 h，其中四唑鹽被細(xì)胞線粒體的脫氫酶還原生成橙黃色的水溶性的甲臜，可以直接測(cè)定吸光值。②3T3-L1：復(fù)蘇凍存的3T3-L1，制成細(xì)胞懸液，按4×104/孔接種于96孔板，復(fù)孔和組數(shù)的設(shè)置、每孔加入的新鮮培養(yǎng)基、CCK-8溶液均與人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞的處理方法相同。每日測(cè)定兩種細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞對(duì)照孔的吸光度值。選擇波長(zhǎng)450 nm，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值。以時(shí)間（天）為橫軸，吸光值為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞、3T3-L1油紅O染色 ①人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞：取生長(zhǎng)良好的第2代人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，細(xì)胞計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)，按1×105個(gè)/孔接種接種入6孔板，24 h后細(xì)胞貼壁，更換為分化培養(yǎng)液（2 mL/孔），每2 d換液1次，每天觀察轉(zhuǎn)化情況，至第10天，誘導(dǎo)成熟，進(jìn)行油紅O染色。移除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗兩次，加油紅O固定液固定20～30 min。棄去固定液，用蒸餾水洗2次。加入60%異丙醇浸洗5 min，棄去60%異丙醇后加入新配制好的油紅O染液，浸染10～20 min。棄去染色液，水洗2～5次，直到無(wú)多余染液。加入蘇木素染色液，復(fù)染核1 min。棄去染液后水洗2～5次。加入油紅O緩沖液1 min，棄去。加入蒸餾水1 mL覆蓋細(xì)胞并在顯微鏡下觀察。②3T3-L1：復(fù)蘇凍存的3T3-L1，制成細(xì)胞懸液，按1×105/孔接種于6孔板，24 h后細(xì)胞貼壁，更換為分化培養(yǎng)液（2 mL/孔），每2 d換液1次，每天觀察轉(zhuǎn)化情況，至第10 d，誘導(dǎo)成熟，進(jìn)行油紅O染色。油紅O染色步驟與人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞的處理方法相同。

2 結(jié)果

2.1 人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞、3T3-L1生長(zhǎng)情況比較 ①人網(wǎng)膜脂肪組織消化液經(jīng)離心后，獲得1×105～2×105個(gè)細(xì)胞，接種入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，貼壁時(shí)間為48～72 h，經(jīng)過貼壁篩選和換液，貼壁細(xì)胞以脂肪干細(xì)胞為主，呈片增殖（圖1A），再經(jīng)過48 h，顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞為圓形、類圓形、梭形、多角形（圖1B），生長(zhǎng)良好的細(xì)胞可以覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)瓶面積的80%，此時(shí)傳代。第1代細(xì)胞24 h之內(nèi)貼壁，細(xì)胞形態(tài)多為梭形、多角形（圖1C），培養(yǎng)4 d后細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶70%～80%，再次傳代比例為1︰1或者1︰2，即1瓶細(xì)胞消化脫壁后，制成細(xì)胞懸液，分裝入1瓶或者2瓶。第2代、第3代和1代倍增時(shí)間相似。細(xì)胞傳至第4代時(shí)，細(xì)胞增殖緩慢，貼壁生長(zhǎng)4天細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)老化，細(xì)胞形態(tài)扁平，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多（圖1D）。②凍存的3T3-L1復(fù)蘇24 h貼壁，細(xì)胞形態(tài)為多角形（圖1E），48 h增殖的細(xì)胞排列更為緊密，覆蓋培養(yǎng)瓶底90%以上（圖1F），72 h可以傳代。

2.2 人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞、3T3-L1增殖曲線比較 ①人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞第3代接種第1天，吸光值略升高，說明細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)；第2～5天吸光值逐漸升高，為指數(shù)增長(zhǎng)期；第6～8天吸光值在3.2左右，為平臺(tái)期；第9天吸光值迅速下降，細(xì)胞開始衰亡。②3T3-L1接種后48 h，吸光值升高曲線如指數(shù)函數(shù)，細(xì)胞倍增時(shí)間為48 h，第3天進(jìn)入平臺(tái)期，吸光值在3.2～3.6，詳見圖2。

2.3 人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞、3T3-L1分化后油紅染色比較 經(jīng)過10天誘導(dǎo)分化，人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞與3T3-L1脂肪細(xì)胞中均出現(xiàn)串珠狀小脂滴、有的細(xì)胞中為大脂滴，用油紅O染色，脂滴被染成紅色，約80%的細(xì)胞可見比較密集的紅染的脂滴（圖3A、B）。在10天誘導(dǎo)過程中，兩種貼壁的脂肪干細(xì)胞出現(xiàn)漂浮、凋亡，人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞凋亡較明顯。

3 討論

隨著肥胖的發(fā)生發(fā)展，內(nèi)臟脂肪體積增加同時(shí)伴隨分泌功能異常，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激增加、發(fā)生胰島素抵抗。內(nèi)臟脂肪細(xì)胞功能的研究是目前很多代謝性疾病研究熱點(diǎn)。3T3-L1及其亞克隆系源自瑞士Swiss鼠的胚胎干細(xì)胞，具有多向分化功能，是目前最常使用的脂肪細(xì)胞模型，但3T3-L1分化為成熟脂肪細(xì)胞后，代謝特點(diǎn)不能完全模擬人內(nèi)臟脂肪細(xì)胞。人的脂肪干細(xì)胞來源不同，功能也不同。內(nèi)臟與皮下的脂肪干細(xì)胞比較，內(nèi)臟脂肪干細(xì)胞分泌更多的腫瘤壞死因子α、白介素6、單核細(xì)胞趨化蛋白等炎癥因子［7］，可誘導(dǎo)胰島素抵抗發(fā)生。從內(nèi)臟脂肪組織提取前脂肪細(xì)胞，將前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞［8］，是研究代謝性疾病的最佳細(xì)胞模型。

圖3 誘導(dǎo)成功的人網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞和3T3-L1脂肪細(xì)胞油紅O染色

本實(shí)驗(yàn)成功從人網(wǎng)膜脂肪組織提取脂肪干細(xì)胞、并誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞，原代細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)時(shí)間、傳代次數(shù)與盛志峰等［8］的研究基本一致。但提取的脂肪干細(xì)胞數(shù)目、脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)分化液成分、成脂誘導(dǎo)時(shí)間各個(gè)文獻(xiàn)中差別較大。脂肪組織消化液中的細(xì)胞數(shù)目越多，原代培養(yǎng)成功率越高，有文獻(xiàn)報(bào)道需要大網(wǎng)膜脂肪組織質(zhì)量為10～40 g［9-10］，但獲取人體網(wǎng)膜脂肪組織存在一定風(fēng)險(xiǎn)。本研究顯示，0.5 g網(wǎng)膜組織可提取原代細(xì)胞數(shù)目可達(dá)1×105以上。Ⅰ型膠原酶消化脂肪組織中的膠原纖維，加速脂肪細(xì)胞的解離。既往研究顯示，膠原酶消化時(shí)間1～1.5 h［11］，為了減少膠原酶對(duì)細(xì)胞的傷害，本研究控制消化時(shí)間為30 min為宜。

李彩霞等［12］使用超高相質(zhì)譜—色譜技術(shù)分析胎牛血清的成分，發(fā)現(xiàn)其中含有促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖、分化的細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞培養(yǎng)基含有體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清，原代細(xì)胞和4代之內(nèi)的細(xì)胞貼壁和增殖良好，因此脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入胎牛血清，可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。但傳至4代的細(xì)胞較早出現(xiàn)老化形態(tài)，增殖緩慢。而KOCAOEMER等［13］使用胎牛血清替代物培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞，傳至3～4代，細(xì)胞增殖速度明顯高于胎牛血清培養(yǎng)組，并且細(xì)胞形態(tài)正常，未見老化細(xì)胞。盡管胎牛血清是脂肪干細(xì)胞最常用的培養(yǎng)基補(bǔ)充劑，但是由于異種血清中病原微生物和抗原對(duì)人類脂肪干細(xì)胞的免疫刺激，加速干細(xì)胞凋亡，更多的研究者使用胎牛血清替代品培養(yǎng)增殖力旺盛的脂肪干細(xì)胞［14］。本實(shí)驗(yàn)在誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞過程中，加入分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，每天拍照觀察，第3～4天脂肪干細(xì)胞由梭形變?yōu)轭悎A形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)串珠樣小脂滴，但此時(shí)每天使用基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的脂滴逐漸消失，所以為了使得干細(xì)胞持續(xù)分化，積累脂滴，本實(shí)驗(yàn)每2天更換新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，維持10 d，取得良好效果。在10天誘導(dǎo)過程中，部分細(xì)胞脫壁漂浮，降低了成熟脂肪細(xì)胞產(chǎn)量，分析其原因可能為異種血清中細(xì)胞因子干擾脂肪干細(xì)胞分化的信號(hào)通路、有機(jī)溶劑乙醇的細(xì)胞毒性。有研究［15］使用無(wú)血清成脂誘導(dǎo)方法，減少肽牛血清中異種抗原對(duì)干細(xì)胞的免疫刺激。無(wú)血清誘導(dǎo)分化液中除了細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)素和細(xì)胞成脂分化必須的胰島素、地塞米松和IBMX，還有抗氧化物質(zhì)；有研究發(fā)現(xiàn)明膠和脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)可以更好的保持細(xì)胞活性［16］，VOLZ等［17］使用Ⅰ型膠原覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)板，然后接種脂肪干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，可以顯著增加細(xì)胞黏附和活性。

總之，人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞具有分化為成熟脂肪細(xì)胞的能力，但增殖能力有限。隨著體外培養(yǎng)技術(shù)的改良，人網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞將有更廣闊的應(yīng)用前景。