重度子癇前期患者血清和胎盤(pán)組織中ADMA與DDAH2的表達(dá)水平及其相關(guān)性

王 宇, 周杜娟, 黃 艷, 徐 雁, 夏宏林

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬宿州醫(yī)院， 安徽 宿州 234000)

子癇前期是指孕婦在妊娠20周后發(fā)生的血清蛋白、血壓以及血脂的異常情況，其發(fā)病率高達(dá)6%～8%，隨著病情進(jìn)展會(huì)累及到腦、心、肝和腎等多個(gè)重要臟器官，形成重度子癇前期[1]，不僅會(huì)使得母嬰面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)與威脅，而且影響妊娠結(jié)局。既往研究發(fā)現(xiàn)，重度子癇前期是炎癥免疫過(guò)度激活、氧化應(yīng)激以及遺傳等多種因素共同作用的結(jié)果[2]，早發(fā)型重度子癇前期發(fā)病早、病情危重，直接威脅母嬰健康，其會(huì)通過(guò)重塑胎盤(pán)血管誘發(fā)胎源性疾病，表現(xiàn)為一氧化氮(nitric oxide，NO)表達(dá)異常及活性降低，從而引起母胎血管內(nèi)皮受損[3]；晚發(fā)型則程度輕，多由機(jī)體與疾病耐受失衡有關(guān)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)非對(duì)稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)以及甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginie dimethylaminohydrolase，DDAH)能夠調(diào)節(jié)機(jī)體NO，該機(jī)制主要是通過(guò)影響酶活性實(shí)現(xiàn)的，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮激活，在損傷形成中有一定的參與作用[4]。本研究以2017年1月至2020年10月62例重度子癇前期患者作為研究對(duì)象，分析血清和胎盤(pán)組織ADMA與DDAH2在重度子癇前期中的表達(dá)及其相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:前瞻性收集安徽醫(yī)科大學(xué)附屬宿州醫(yī)院收治的重度子癇前期患者病例，來(lái)源時(shí)間范圍為2017年1月至2020年10月，病例總數(shù)為62例，其中早發(fā)型重度子癇前期患者(早發(fā)型重度子癇前期組)32例，晚發(fā)型重度子癇前期患者(晚發(fā)型重度子癇前期組)30例。早發(fā)型重度子癇前期患者年齡(22～37)歲，平均年齡(29.63±4.02)歲；孕周(25～35)周，平均孕(32.39±1.14)周。晚發(fā)型重度子癇前期患者年齡21～38歲，平均年齡(29.53±4.09)歲；孕(26～36)周，平均孕(34.95±1.21)周。選擇同期健康孕婦(n=30)作為對(duì)照組，年齡36～23歲，平均年齡(29.18±4.21)歲，孕(25～36)周，平均孕(33.84±1.64)周。三組孕婦年齡及孕周對(duì)比，無(wú)顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn):入組標(biāo)準(zhǔn)：①收集對(duì)象均為初產(chǎn)婦，且B超顯示為單胎;②重度子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《妊娠期高血壓和子癇前期指南2019版》[5]；③患者及家屬已明確研究目標(biāo)及流程，自愿參與研究并在知情同意書(shū)簽字，醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)掌握研究相關(guān)事項(xiàng)，并批準(zhǔn);④產(chǎn)婦年齡≥18歲，可正常交流。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并精神異常、心理障礙或意識(shí)喪失患者；②合并原發(fā)性高血壓、糖尿病及心腦血管疾病患者；③聽(tīng)力喪失、語(yǔ)言溝通不順暢，對(duì)研究無(wú)法做到順利配合患者。

1.3方 法

1.3.1血清胎盤(pán)樣本采集:血液樣本采集均應(yīng)在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行，抽血部位為肘部，抽血量以6mL為宜，放置于室溫環(huán)境下靜置30min，然后置于4℃環(huán)境下，按照2500r/min的離心速率實(shí)施離心處理，離心半徑設(shè)置為22.5cm，離心處理時(shí)間為15min，將血清分離，保存于-70℃冰箱中。產(chǎn)婦娩出胎盤(pán)后立即將臍帶位置血管密集部位胎盤(pán)組織，以1.5cm×1.0cm×0.5cm為宜，需要注意避開(kāi)鈣化點(diǎn)位置。采用生理鹽水進(jìn)行反復(fù)沖洗，并采用濾紙做吸干處理，在液氮下進(jìn)行短暫冷凍，然后保存于-70℃冰箱環(huán)境中待測(cè)。

1.3.2血清ADMA與DDAH2檢測(cè):嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)ADMA及DDAH2指標(biāo)，試劑盒由泉州市睿信生物科技有限公司提供。完成標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、加樣以及溫育等操作，并進(jìn)行洗滌、加酶以及顯色處理，然后完成測(cè)定。

1.3.3胎盤(pán)組織ADMA及DDAH2表達(dá)檢測(cè):分別提取三組研究對(duì)象胎盤(pán)標(biāo)本，處理步驟包埋-切片-脫蠟，然后實(shí)施抗原修復(fù)，將山羊血清封閉液及第一抗體適量加入，漂洗后將生物素化二抗及鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex,SABC)試劑依次加入其中。實(shí)施DAB顯色及蘇木精復(fù)染處理。陽(yáng)性：染色后細(xì)胞核呈現(xiàn)顏色為棕黃色。陰性：未著色或僅呈現(xiàn)背景顏色。Fromowitz綜合計(jì)分法：0分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量低于1%；1分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在1%～25%之間；2分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量介于25%～50%；3分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)超過(guò)50%；染色強(qiáng)弱評(píng)分依據(jù)：0分表示未染色；1分為淡黃色；2分為黃色；3分棕黃色；兩項(xiàng)評(píng)分進(jìn)行綜合處理相乘，共分為陰性(-)、弱陽(yáng)(+)、陽(yáng)性(++)以及強(qiáng)陽(yáng)(+++)4個(gè)級(jí)別，對(duì)應(yīng)分值分別為0分、1～3分、4～6分、9分。

1.4觀察內(nèi)容:①比較三組研究對(duì)象的外周血清ADMA及DDAH2水平；②比較三組研究對(duì)象的外周血清ADMA及DDAH2的陽(yáng)性表達(dá)率；③分析血清中ADMA與DDAH2表達(dá)的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1三組研究對(duì)象外周血清ADMA及DDAH2水平比較:與對(duì)照組相比，晚發(fā)型及早發(fā)型重度子癇前期組ADMA均較高，DDAH2均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，晚發(fā)型與早發(fā)型重度子癇前期組患者相比，后者ADMA較前者高，DDAH2水平后者較前者低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2三組研究對(duì)象胎盤(pán)組織ADMA和DDAH2表達(dá)率比較:三組ADMA陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.389，P=0.000)；三組DDAH2陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.370，P=0.000)；早發(fā)型重度子癇前期組胎盤(pán)組織ADMA陽(yáng)性表達(dá)率(93.75%)高于晚發(fā)型重度子癇前期組(66.67%)及對(duì)照組(46.67%)，其陽(yáng)性表達(dá)率經(jīng)Fisher的精確檢驗(yàn)后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010，0.000)。早發(fā)型重度子癇前期胎盤(pán)組織DDAH2陽(yáng)性表達(dá)率(37.50%)低于晚發(fā)型重度子癇前期(66.67%)及對(duì)照組(80.00%)，其陽(yáng)性表達(dá)率經(jīng)Fisher的精確檢驗(yàn)后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025，0.001)。見(jiàn)表2。

表1 三組研究對(duì)象外周血清ADMA及DDAH2水平比較

表2 三組研究對(duì)象胎盤(pán)組織ADMA和DDAH2表達(dá)率比較

2.3血清中ADMA及DDAH2表達(dá)相關(guān)性分析:血清ADMA水平與DDAH2在早發(fā)型及晚發(fā)型重度子癇前期均呈現(xiàn)為負(fù)相關(guān)(r=-0.71，-0.77，P<0.05)。

3 討 論

作為產(chǎn)科常見(jiàn)并發(fā)癥，子癇主要指的是不明病因的抽搐，表現(xiàn)為全身小動(dòng)脈痙攣以及全身器官及臟器血液灌流的減少[6]。既往研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期與多基因有著密不可分的聯(lián)系，多基因遺傳會(huì)加重對(duì)子癇前期的易感性，引起胎母免疫平衡及耐受失調(diào)，降低免疫抑制反應(yīng)，引起胎盤(pán)缺氧、缺血，損傷血管內(nèi)皮，進(jìn)而形成子癇前期[7]。早發(fā)型重度子癇前期伴隨明顯胎盤(pán)組織凋亡，阻斷滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入，各類因子進(jìn)入母體循環(huán)系統(tǒng)后會(huì)使得NO減少，難以發(fā)揮對(duì)血壓的調(diào)節(jié)作用，考慮有明顯內(nèi)皮損傷。

作為一種天然氨基酸，ADMA主要來(lái)源于人體組織、體液及細(xì)胞，能夠?qū)σ谎趸厦富钚援a(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，使得NO合成受到一定的抑制，這也是血管內(nèi)皮損傷的主要因素，進(jìn)而影響到血流動(dòng)力學(xué),以往有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)少部分ADMA會(huì)經(jīng)過(guò)腎臟被排出，90%會(huì)受到DDAH的水解作用以瓜氨酸及二甲胺形式被排出[8]。DDAH1主要來(lái)源于胰腺、主動(dòng)脈及中性粒細(xì)胞，其中肝、腎部位置表達(dá)最高。處于妊娠期女性DDAH2主要存在心臟及胎盤(pán)組織中。當(dāng)孕婦處于病理狀態(tài)，DDAH會(huì)減少，導(dǎo)致ADMA在機(jī)體大量聚集，降低eNOS活性[9]。以往有學(xué)者在動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ADMA處于異常狀態(tài)下，會(huì)影響到子癇前期患者胎盤(pán)功能，主要表現(xiàn)為血管異常收縮[10];ADMA持續(xù)升高，長(zhǎng)此以往會(huì)使得血管內(nèi)皮功能受到不同程度損傷，增加高血壓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究就不同組別孕婦進(jìn)行了血清ADMA水平檢測(cè)，從研究得出的數(shù)據(jù)可以看出早發(fā)型重度子癇有著更高的水平，且陽(yáng)性表達(dá)率在三組中居于首位，三組差異顯著，考慮與以下幾個(gè)因素有關(guān)：①過(guò)度ADMA表達(dá)減少內(nèi)源性NO的生成，降低了eNOS對(duì)血管內(nèi)皮及血管舒張功能的保護(hù)作用;②ADMA能夠?qū)OD、CAT等抗氧化物質(zhì)分泌產(chǎn)生抑制作用，使得胎盤(pán)組織中滋養(yǎng)細(xì)胞被炎癥介質(zhì)破壞，對(duì)凋亡程度產(chǎn)生激活作用，滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡速度明顯增加，這也是子癇前期形成的重要機(jī)制；可以將該指標(biāo)作為評(píng)估胎盤(pán)功能的可靠指標(biāo)。作為一種胞質(zhì)蛋白酶，DDAH2能夠?qū)?0%以上ADMA降解，妊娠期孕婦心血管及胎盤(pán)組織是DDAH2的主要分布部位，既往有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)DDAH2在高血壓及高血脂中呈現(xiàn)出低轉(zhuǎn)錄及低表達(dá)[11]。本研究早發(fā)型重度子癇前期組血清DDAH2水平及胎盤(pán)組織DDAH2陽(yáng)性表達(dá)率均較晚發(fā)型及對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明DDAH2在早發(fā)型重度子癇前期呈現(xiàn)出明顯下調(diào)。早發(fā)型重度子癇前期DDAH2與ADMA能夠?qū)RKl/2-CREB信號(hào)通路產(chǎn)生影響，競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)皮細(xì)胞氧化氮合酶，使其表達(dá)下調(diào)及降低一氧化氮生成，加重胎盤(pán)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及提高全身微小血管的緊張性，可見(jiàn)胎盤(pán)組織中DDAH2與ADMA相關(guān)性與血清中兩者表達(dá)是相通的，因此僅對(duì)血清中DDAH2與ADMA表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析，Pearson相關(guān)系數(shù)分析顯示，血清ADMA水平與DDAH2在早發(fā)型及晚發(fā)型重度子癇前期均呈現(xiàn)為負(fù)相關(guān)(r=-0.71，-0.77，P<0.05)；提示早發(fā)型重度子癇前期的形成與上述兩項(xiàng)指標(biāo)有著一定的關(guān)聯(lián)性，但由于樣本少、精力有限，結(jié)果可能存在一定的偏倚，有待進(jìn)一步大樣本、大規(guī)模研究，為臨床提供更多可靠的依據(jù)。

綜上所述，與正常孕婦及晚發(fā)型子癇前期孕婦相比，早發(fā)型重度子癇前期患者ADMA有明顯升高趨勢(shì)，DDAH2表現(xiàn)為明顯降低，血清ADMA和DDAH2表達(dá)水平可作為診斷、評(píng)估早發(fā)型重度子癇前期的可靠指標(biāo)，為治療方案提供可靠的依據(jù)。