LncRNA H19通過miR-370-3p/RAF1軸對(duì)腦膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞增殖侵襲和放療敏感性的影響及機(jī)制

徐 華， 張海萍， 楊 苗， 馬 蕾

(1.西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院， 陜西 西安 710100 2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部病房， 陜西 西安 710000)

膠質(zhì)瘤進(jìn)展迅速，早期轉(zhuǎn)移，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生最多的惡性腫瘤之一，占顱內(nèi)腫瘤的50%以上[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的病理生長(zhǎng)和擴(kuò)散速度特征，膠質(zhì)瘤可分級(jí)為I ～ IV級(jí)。腦膠質(zhì)瘤的臨床治療以手術(shù)切除加放療和化療為主，然而，患者死亡率和復(fù)發(fā)率很高，預(yù)后較差，中位生存時(shí)間小于1年[2,3]。因此，了解膠質(zhì)瘤發(fā)生的分子機(jī)制和識(shí)別早期診斷的生物標(biāo)志物是非常重要的。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (Long non-coding RNAs,lncRNAs)是超過200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，并與各種疾病，包括癌癥密切相關(guān)[4,5]。lncRNA在各種癌癥類型中均有異常表達(dá)。lncRNA作為腫瘤促進(jìn)或抑制因子，被認(rèn)為是癌癥診斷的潛在生物標(biāo)志物[6]。如lncRNA NORAD通過抑制miR-202-5p參與結(jié)直腸癌進(jìn)展[7]。LncRNA HOTTIP通過調(diào)控HOXA9調(diào)節(jié)人胰腺癌的癌癥干細(xì)胞特性[8]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)LncRNA H19參與了各種腫瘤的進(jìn)展，如lncRNA H19基因變異與中國(guó)人群膀胱癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[9]。在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，lncRNA H19介導(dǎo)17β -雌二醇誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[10]。然而，關(guān)于LncRNA H19在膠質(zhì)瘤增殖、侵襲及其放療過程中的作用仍不明了。本研究旨在闡明LncRNA H19在膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)展中的作用，進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1主要材料:本研究所使用的45例膠質(zhì)瘤組織和相應(yīng)的瘤旁正常組織均取自我院接受腦膠質(zhì)瘤切除術(shù)且未接受放療和/或化療的患者，病理檢查顯示相鄰組織為正常腦組織。所有患者術(shù)前進(jìn)行臨床分期，并簽署知情同意書，經(jīng)過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。從中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買腦膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞。DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，青霉素和鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigama公司。H19小干擾RNA質(zhì)粒及其對(duì)照、過表達(dá)H19的質(zhì)粒及其對(duì)照，RAF1小干擾RNA質(zhì)粒及其過表達(dá)質(zhì)粒均來自北京擎科生物公司。miR-370-3p抑制劑及其miR-370-3p模擬物來自美國(guó)Genepharma公司。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染:H19小干擾RNA質(zhì)粒及其對(duì)照、過表達(dá)H19的質(zhì)粒及其對(duì)照、miR-370-3p抑制劑和miR-370-3p模擬物，RAF1小干擾RNA質(zhì)粒及其過表達(dá)質(zhì)粒均由公司設(shè)計(jì)及合成。細(xì)胞分為①siRNA NC組：T98G細(xì)胞轉(zhuǎn)染2μg siRNA NC質(zhì)粒；H19 siRNA組：T98G細(xì)胞轉(zhuǎn)染2μg H19 siRNA質(zhì)粒；RAF1 siRNA組：T98G細(xì)胞轉(zhuǎn)染2μg RAF1 siRNA質(zhì)粒；②H19 wt+miR-370-3p mimics組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg H19 wt質(zhì)粒和miR-370-3p mimics；mimics NC+H19 wt組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg H19 wt質(zhì)粒和mimics NC；H19 mut+miR-370-3p mimics組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg H19 mut質(zhì)粒和miR-370-3p mimics；mimics NC+H19 mut組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg H19 mut質(zhì)粒和mimics NC；③inhibitor NC組：T98G細(xì)胞轉(zhuǎn)染2μg inhibitor NC；miR-370-3p inhibitor組：T98G細(xì)胞轉(zhuǎn)染2μg miR-370-3p inhibitor；④pcDNA-3.1(+)+mimics NC組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg pcDNA-3.1(+)質(zhì)粒和mimics NC；pcDNA-H19+mimics NC組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg pcDNA-H19質(zhì)粒和mimics NC；pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg pcDNA-3.1(+)質(zhì)粒和miR-370-3p mimics；pcDNA-H19+miR-370-3p mimics組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg pcDNA-H19質(zhì)粒和miR-370-3p mimics；⑤RAF1 wt+miR-370-3p mimics組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg RAF1 wt質(zhì)粒和miR-370-3p mimics；mimics NC+RAF1 wt組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg RAF1 wt質(zhì)粒和mimics NC；RAF1 mut+miR-370-3p mimics組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg RAF1 mut質(zhì)粒和miR-370-3p mimics；mimics NC+RAF1 mut組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg RAF1 mut質(zhì)粒和mimics NC。根據(jù)制造商的說明書將質(zhì)粒利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染至密度為70%左右的T98G細(xì)胞中，其中一部分T98G細(xì)胞轉(zhuǎn)染后參照文獻(xiàn)采用不同Gy X射線(0、2、4、6 Gy)垂直照射細(xì)胞[11]，采集細(xì)胞樣品。

1.4T98G細(xì)胞增殖能力測(cè)定:CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞重懸，以4000個(gè)/孔接種到96孔板中，另外一組細(xì)胞用6 Gy X射線照射，48h后加入10μL CCK-8溶液，在37℃下孵育4h。用分光光度計(jì)讀取細(xì)胞吸光度值。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.5雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè):H19序列包含一個(gè)假定的miR-370-3p結(jié)合位點(diǎn)，被克隆并插入pmirGlO雙熒光素酶miRNA靶表達(dá)載體以制備H19 wt，結(jié)合位點(diǎn)突變的H19序列同樣用于制備H19 mut。此外構(gòu)建RAF1 wt和RAF1 mut載體。T98G細(xì)胞使用Lipofectamine 2000將LncRNA H19 wt、LncRNA H19 mut分別與miR-370-3p mimics、mimics NC，RAF1 wt、RAF1 mut分別與miR-370-3p mimics、mimics NC共轉(zhuǎn)染至T98G細(xì)胞，熒光素酶活性用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量。

1.6細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):為了評(píng)估細(xì)胞的侵襲情況，轉(zhuǎn)染24h后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無血清培養(yǎng)基中12h。上Transwell室涂上50 μL的Matrigel，在37℃下孵育30min以形成凝膠。下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，上室加入細(xì)胞懸液。在37℃孵育24 h后，用4%對(duì)甲醛固定細(xì)胞，并用0.1%結(jié)晶紫染色，隨機(jī)8個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7實(shí)時(shí)定量PCR (real-time PCR):使用TRIzol試劑從培養(yǎng)細(xì)胞或冷凍組織中提取總RNA，根據(jù)制造商的說明，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后，按照標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR程序，使用SYBR Green PCR Master Mix 在實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中對(duì)LncRNA H19、miR-370-3p和RAF1進(jìn)行定量PCR。所用引物序列見表1。通過GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量，2-△△Ct法分析結(jié)果。

1.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:將T98G細(xì)胞用0.25%胰酶消化后進(jìn)行離心，按照說明書在細(xì)胞中加入流式緩沖液，重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin V-APC后孵育30 min，再加5μL PI染液,5 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測(cè)。

表1 引物序列

1.9Western blot:提取總蛋白，通過BCA蛋白分析試劑盒分析蛋白濃度。每個(gè)蛋白質(zhì)樣品在SDS-PAGE凝膠上分離15μg，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。接下來，PVDF膜與10% BSA孵育，然后與一次和二次抗體孵育，最后進(jìn)行蛋白曝光。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1下調(diào)LncRNA H19抑制T98G細(xì)胞增殖及侵襲，增強(qiáng)其放療敏感性:與瘤旁組織比較，腦膠質(zhì)瘤組織LncRNA H19 mRNA表達(dá)顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.23±0.42 vs 3.15±0.29，t=20.58，P=0.0018<0.01)，與0 Gy劑量X射線照射相比，不同劑量(2 Gy、4 Gy、6 Gy)X射線照射T98G細(xì)胞后中H19 mRNA表達(dá)顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(2Gy：1.72±0.87 vs 0.97±0.13，t=18.94，P=0.0028<0.01；4Gy：1.72±0.87 vs 0.74±0.84，t=23.52，P=0.0018<0.01；6Gy：1.72±0.87 vs 0.35±0.05，t=14.27，P=0.0049<0.01)。與siRNA NC組相比，H19 siRNA組T98G細(xì)胞活力顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(62.83±7.54 vs 30.15±4.82，t=22.06，P=0.0020<0.01)，見圖1A。與siRNA NC組相比，H19 siRNA組T98G細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(80.56±6.35 vs 42.18±3.27，t=19.76，P=0.0026<0.01)，見圖1B-1C。與siRNA NC組相比，siRNA NC+6Gy組細(xì)胞活力顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(82.83±7.54 vs 45.23±5.26，t=17.44，P=0.0033<0.01)，與siRNA NC+6Gy組相比，H19 siRNA+6Gy組細(xì)胞活力顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(45.23±5.26 vs 30.87±6.24，t=9.091，P=0.0119<0.05)，見圖1D。與siRNA NC組相比，siRNA NC+6Gy組細(xì)胞凋亡率顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(5.25±1.23 vs 8.92±2.17，t=17.86，P=0.0032<0.01)，與siRNA NC+6Gy組相比，H19 siRNA+6Gy組細(xì)胞凋亡率顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(8.92±2.17 vs 14.87±5.26，t=13.12，P=0.0058<0.01)，見圖1E-1F。

由上式可知，在一定波長(zhǎng)λ時(shí)，若氣體的吸收系數(shù)α和吸收長(zhǎng)度l可以測(cè)得，則通過測(cè)量光強(qiáng)I和I0的比值得到氣體濃度C。

圖1 LncRNA H19表達(dá)下調(diào)對(duì)T98G細(xì)胞增殖及侵襲，增強(qiáng)其放療敏感性的影響

2.2LncRNA H19與miR-370-3p之間的關(guān)系:LncRNA H19 3’UTR和miR-370-3p之間存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖2A。與mimics NC+H19 wt組相比，H19 wt+miR-370-3p mimics組熒光素酶活性顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.17±0.52 vs 3.15±0.29，t=21.34，P=0.0016<0.01)；與mimics NC+H19 mut組相比，H19 mut+miR-370-3p mimics組熒光素酶活性無明顯變化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.34±0.09 vs 1.27±0.42，t=2.020，P=0.1808>0.05)，見圖2B。

圖2 LncRNA H19與miR-370-3p靶向結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

2.3下調(diào)miR-370-3p促進(jìn)T98G細(xì)胞的增殖及侵襲，降低其放療敏感性:與瘤旁組織比較，腦膠質(zhì)瘤組織miR-370-3p表達(dá)顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.37±0.51 vs 0.52±0.08，t=30.45，P=0.0011<0.01)，與0 Gy劑量X射線照射相比，不同劑量(2 Gy、4 Gy、6 Gy)X射線照射T98G細(xì)胞后中miR-370-3p表達(dá)顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(2Gy：1.45±0.82 vs 2.34±0.02，t=13.60，P=0.0054<0.01；4Gy：1.45±0.82 vs2.89±0.93，t=18.01，P=0.0031<0.01；6Gy：1.45±0.82 vs 3.05±1.02，t=18.37，P=0.0030<0.01)。與inhibitor NC組相比，miR-370-3p inhibitor組T98G細(xì)胞活力顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(60.35±8.26 vs 81.23±7.28，t=5.347，P=0.0332<0.05)，見圖3A。與inhibitor NC組相比，miR-370-3p inhibitor組T98G細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(85.93±8.76 vs 153.48±9.78，t=10.77，P=0.0085<0.01)，見圖3B-3C。與inhibitor NC組相比，inhibitor NC+6Gy組細(xì)胞活力顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(60.35±8.26 vs 30.65±9.23，t=20.36，P=0.0024<0.01)，與inhibitor NC+6Gy組相比，miR-370-3p inhibitor+6Gy組細(xì)胞活力顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(30.65±9.23 vs 58.27±6.27，t=15.94，P=0.0039<0.01)，見圖3D。與inhibitor NC組相比，inhibitor NC+6Gy組細(xì)胞凋亡率顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(7.37±0.97 vs 16.85±5.68，t=15.07，P=0.0044<0.01)，與inhibitor NC+6Gy組相比，miR-370-3p inhibitor+6Gy組細(xì)胞凋亡率顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(16.85±5.68 vs 8.26±4.26，t=12.69，P=0.0062<0.01)，見圖3E-3F。

圖3 miR-370-3p表達(dá)下調(diào)對(duì)T98G細(xì)胞增殖及侵襲，降低其放療敏感性的影響

2.4上調(diào)LncRNA H19通過miR-370-3p促進(jìn)T98G細(xì)胞增殖、侵襲，降低其放療敏感性:與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-H19+mimics NC組T98G細(xì)胞活力顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(59.87±7.23 vs 82.56±5.48，t=5.073，P=0.0367<0.05)，細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(78.65±10.23 vs 169.45±12.56，t=18.37，P=0.0030<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics組細(xì)胞活力顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(59.87±7.23±8.76 vs 28.74±6.54，t=18.87，P=0.0028<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(78.65±10.23 vs 32.47±8.45，t=18.43，P=0.0029<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics組相比，pcDNA-H19+miR-370-3p mimics組細(xì)胞活力顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(28.74±6.54 vs 60.13±5.68，t=19.70，P=0.0026<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(32.47±8.45 vs 82.37±10.21，t=25.61，P=0.0015<0.01)，見圖4A-4C。與pcDNA-3.1(+)+mimics NC+6Gy組相比，pcDNA-H19+mimics NC+6Gy組細(xì)胞活力明顯上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(43.27±7.82 vs 68.94±5.47，t=21.39，P=0.0022<0.01)，細(xì)胞凋亡率明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(10.26±6.23 vs 5.13±2.04，t=11.08，P=0.0080<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+mimics NC+6Gy組相比，pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics +6Gy組細(xì)胞活力明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(43.27±7.82 vs 22.15±3.27，t=14.27，P=0.0049<0.01)，細(xì)胞凋亡率明顯上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(10.26±6.23 vs 18.79±4.35，t=14.92，P=0.0045<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics +6Gy組相比，pcDNA-H19+miR-370-3p mimics +6Gy組細(xì)胞活力明顯上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(22.15±3.27 vs 60.93±8.72，t=10.17，P=0.0095<0.01)，細(xì)胞凋亡率明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(18.79±4.35 vs 12.36±2.87，t=12.27，P=0.0066<0.01)。

2.5miR-370-3p與RAF1之間的關(guān)系:LncRNA H19 3’UTR和miR-370-3p之間存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖5A。與mimics NC+RAF1 wt組相比，RAF1 wt+miR-370-3p mimics組熒光素酶活性顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.17±0.52 vs 3.15±0.29，t=21.34，P=0.0016<0.01)；與mimics NC+RAF1 mut組相比，RAF1 mut+miR-370-3p mimics組熒光素酶活性無明顯變化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.34±0.09 vs 1.27±0.42，t=2.020，P=0.1808>0.05)，見圖5B。

2.6下調(diào)RAF1抑制T98G細(xì)胞增殖及侵襲，增強(qiáng)其放療敏感性:與癌旁組織比較，腦膠質(zhì)瘤組織RAF1 mRNA表達(dá)顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.34±0.51 vs 2.37±0.81，t=22.47，P=0.0020<0.01)，與0 Gy劑量X射線照射相比，不同劑量(2 Gy、4 Gy、6 Gy)X射線照射T98G細(xì)胞后中RAF1 mRNA表達(dá)顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(2Gy：1.63±0.25 vs 1.04±0.24，t=7.653，P=0.0167<0.05；4Gy：1.63±0.25 vs 0.86±0.24，t=14.52，P=0.0047<0.01；6Gy：1.63±0.25 vs 0.42±0.08，t=31.47，P=0.0010<0.01)。與siRNA NC組相比，RAF1 siRNA組T98G細(xì)胞活力顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(58.27±8.92 vs 33.46±5.27，t=25.92，P=0.0015<0.01)，見圖6A。與siRNA NC組相比，RAF1 siRNA組T98G細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(79.26±7.54 vs 28.93±6.83，t=22.85，P=0.0019<0.01)，見圖6B-6C。與siRNA NC組相比，siRNA NC+6Gy組細(xì)胞活力顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(58.56±8.45 vs 40.18±4.76，t=9.214，P=0.0116<0.05)，與siRNA NC+6Gy組相比，RAF1 siRNA+6Gy組細(xì)胞活力顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(40.18±4.76 vs 22.36±5.27，t=7.799，P=0.0160<0.05)，見圖6D。與siRNA NC組相比，siRNA NC+6Gy組細(xì)胞凋亡率顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(5.25±1.23 vs 8.92±2.17，t=17.86，P=0.0032<0.01)，與siRNA NC+6Gy組相比，RAF1 siRNA+6Gy組細(xì)胞凋亡率顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(8.92±2.17 vs 18.27±5.59，t=21.22，P=0.0022<0.01)，見圖6E-6F。

圖4 LncRNA H19通過miR-370-3p對(duì)T98G細(xì)胞增殖及侵襲，降低其放療敏感性的影響

圖5 miR-370-3p與RAF1靶向關(guān)系的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

圖6 RAF1表達(dá)下調(diào)對(duì)T98G細(xì)胞增殖及侵襲，增強(qiáng)其放療敏感性的影響

2.7上調(diào)LncRNA H19靶向miR-370-3p調(diào)控RAF1表達(dá):與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-H19+mimics NC組RAF1 mRNA表達(dá)顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.32±0.71 vs 2.39±0.42，t=17.03，P=0.0034<0.01)，pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics組RAF1 mRNA表達(dá)顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1.32±0.71 vs 0.34±0.04，t=17.58，P=0.0033<0.01)。與pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics組相比，pcDNA-H19+miR-370-3p mimics組RAF1 mRNA表達(dá)顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.34±0.04 vs 1.48±0.26，t=15.36，P=0.0036<0.01)，見圖7A。與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-H19+mimics NC組RAF1蛋白表達(dá)顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.93±0.53 vs 1.92±0.08，t=19.53，P=0.0026<0.01)，pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics組RAF1蛋白表達(dá)顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.93±0.53 vs 0.16±0.02，t=18.37，P=0.0030<0.01)。與pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics組相比，pcDNA-H19+miR-370-3p mimics組RAF1蛋白表達(dá)顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.16±0.02 vs 0.87±0.35，t=15.94，P=0.0039<0.01)，見圖7B。

圖7 LncRNA H19通過miR-370-3p對(duì)RAF1表達(dá)的影響

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤。盡管晚期手術(shù)和放化療有效，但晚期膠質(zhì)瘤患者的5年生存率低于6%。已有研究報(bào)道lncRNA H19在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用，Qin等發(fā)現(xiàn)lncRNA H19啟動(dòng)子區(qū)域的功能多態(tài)性與晚期結(jié)直腸癌的癌癥風(fēng)險(xiǎn)和臨床結(jié)果有關(guān)。還發(fā)現(xiàn)LncRNA-H19通過調(diào)控miR-124-3p靶向ITGB3調(diào)控異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖和侵襲[12]。然而，其在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。在本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)升高。為了探討lncRNA H19在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的生物學(xué)功能，我們進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，顯示lncRNA H19的下調(diào)抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外增殖和轉(zhuǎn)移，而且還發(fā)現(xiàn)下調(diào)lncRNA H19表達(dá)會(huì)使X射線照射的T98G細(xì)胞凋亡率升高，提高細(xì)胞的放射敏感性揭示了lncRNA H19可能作為膠質(zhì)瘤治療的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

lncRNA與miRNAs具有序列互補(bǔ)性，lncRNA可靶向miRNAs調(diào)控腫瘤的發(fā)展。LncRNA SNHG15通過靶向miR141/PD-L1參與胃癌的免疫逃逸[13]。LncRNA-SNHG6通過靶向miR-6509-5p和HIF1A促進(jìn)肝癌的發(fā)展。在我們的研究中，生物信息分析和熒光素酶報(bào)告分析顯示，miR-370-3p是膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LncRNA H19的潛在靶點(diǎn)。此外，LncRNA H19的上調(diào)與膠質(zhì)瘤組織中miR-370-3p的下調(diào)密切相關(guān)。在本研究證實(shí)了miR-370-3p是LncRNA H19的直接靶點(diǎn)。生物學(xué)功能研究表明下調(diào)miR-370-3p促進(jìn)了T98G細(xì)胞增殖和侵襲。此外上調(diào)LncRNA H19靶向miR-370-3p促進(jìn)了T98G細(xì)胞增殖和侵襲，降低了T98G細(xì)胞的放療敏感性。越來越多的研究表明RAF1參與了各種癌癥的發(fā)展。如Zhi等發(fā)現(xiàn)吉非替尼通過RAF1/ERK通路逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞系的多藥耐藥[14]。在人類結(jié)直腸癌中，抑制RAF1激酶活性恢復(fù)根尖基極性并損害腫瘤生長(zhǎng)。CircAGFG1通過miR-370-3p/RAF1信號(hào)促進(jìn)宮頸癌進(jìn)展[15]。在本研究發(fā)現(xiàn)miR-370-3p靶向RAF1，下調(diào)RAF1表達(dá)后抑制了T98G細(xì)胞增殖和侵襲，提高了T98G細(xì)胞的放療敏感性，在膠質(zhì)瘤發(fā)展過程中也發(fā)揮了重要作用。

總之，在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中，lncRNA H19和RAF1表達(dá)上調(diào)，而miR-370-3p表達(dá)下調(diào)。我們的研究結(jié)果表明，lncRNA H19可以通過結(jié)合miR-370-3p，進(jìn)而上調(diào)RAF1的表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，這可能是膠質(zhì)瘤治療的一個(gè)很有前景的靶點(diǎn)。