利用12C6+重離子輻射和尖孢鐮刀菌毒素篩選雜交蘭抗莖腐病突變體

郭和蓉 張 騰 袁紅麗 曾瑞珍 張志勝,3 謝 利,*

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642；2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣東省植物分子育種重點實驗室，廣東 廣州 510642；3 國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

雜交蘭(HybridCymbidium)是用國蘭(ChineseCymbidium)和大花蕙蘭(Cymbidiumhybridium)雜交培育的蘭花新類型，集國蘭和大花蕙蘭的優(yōu)良性狀于一身，具有很高的觀賞價值和廣闊的市場前景[1]。莖腐病是蘭花規(guī)模化生產(chǎn)中最嚴重的病害之一，尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是該病最主要的病原菌[2-5]。感染莖腐病的蘭株死亡率高達20%～30%，對蘭花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了嚴重威脅[2]。目前對莖腐病主要采取化學(xué)防治[6-7]，存在成本高、污染環(huán)境等問題。選育抗病品種是防治病害最經(jīng)濟有效的方法，其中篩選和鑒定抗病種質(zhì)是抗病育種的基礎(chǔ)。但目前市場上流行的雜交蘭品種普遍不抗莖腐病[8]。因此創(chuàng)建抗莖腐病雜交蘭資源，對于培育抗病新品種，促進雜交蘭產(chǎn)業(yè)高效可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

重離子輻射是近年來新興的輻射誘變技術(shù)，其與組織離體培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，具有操作簡單、誘變率高、培育周期短等特點[9-14]。目前利用該技術(shù)已獲得花形、花色或葉色等性狀發(fā)生變異的仙客來(Cyclamen)[15]、月季(RosachinensisJacq.)[16]、美女櫻(Verbenahybrida)[17]、矮牽牛(Petuniahvbrida)[18]、鼠尾草(Salviasplendens)[19]、紫露草(Tradescantiafluminensis)[20]、菊花(Chrysanthemummorifolium)[21-22]等觀賞植物的突變體。突變體的離體篩選是創(chuàng)建抗病突變體的有效方法，目前利用該方法已獲得抗疫霉菌(Phytophthoraparasitica)的粗皮檸檬(Citrusjambhiri)[23]、抗枯萎病(Fusariumoxysporump.sp.cubense)的香蕉(Musaspp.)[24]、草莓(FragariaananassaDuch.)[25]和百合(Lilium)[26]、抗葉枯病(Kabatiellamicrosticta)的大花萱草(Hemerocallishybrida)[27]突變體，但鮮見利用重離子輻射并定向篩選抗病突變體材料的報道。

玉女蘭(Cym.Yunv)是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)選育出的雜交蘭新品種，其株型緊湊、花型優(yōu)美、花色純正、觀賞期長[28]，但栽培生產(chǎn)上表現(xiàn)出不抗莖腐病。本試驗以玉女蘭類原球莖為材料，采用尖孢鐮刀菌為接種病原菌，研究通過重離子輻射創(chuàng)建抗莖腐病雜交蘭突變體的技術(shù)，以期為選育抗莖腐病的蘭花新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試玉女蘭類原球莖(protocorm-like bodies,LBS)通過莖尖組織培養(yǎng)快速繁殖獲得；尖孢鐮刀菌從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家航天育種工程技術(shù)中心花卉基地感染莖腐病的玉女蘭病葉中分離得到。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉女蘭類原球莖的重離子輻射 選取直徑約0.4 cm的類原球莖送至中國科學(xué)院蘭州高能離子研究所進行12C6+重離子輻射，輻射劑量為30、50、70和90 Gy，劑量率為35 Gy·min-1。

輻射后的玉女蘭類原球莖接種于增殖培養(yǎng)基中，在溫度25±2℃、光照強度2 500 lx、光照時間13 h·d-1的條件下培養(yǎng)，30 d繼代1次，共繼代3次。每個輻射處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)接5瓶材料，每瓶含5塊類原球莖，以未輻射的材料為對照(CK)。培養(yǎng)過程中記錄褐化、死亡的類原球莖數(shù)量，分別計算褐化率和死亡率。其中，褐化率=褐化類原球莖數(shù)/接種類原球莖數(shù)×100%；死亡率=死亡類原球莖數(shù)/接種類原球莖數(shù)×100%。增殖培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有6-芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)1.0 mg·L-1、萘乙酸(1-naphthaleneaceticacid，NAA)0.1 mg·L-1、卡拉粉7.0 g·L-1、蔗糖30.0 g·L-1、活性炭0.1 g·L-1。

1.2.2 粗毒素濾液的制備 參考臺蓮梅等[29]的方法：用接種環(huán)將尖孢鐮刀菌菌株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基上，在25℃下培養(yǎng)7 d，將培養(yǎng)出的菌落沿邊緣打出直徑為8 mm的菌塊，接種于裝有100 mL馬鈴薯蔗糖(potato sucrose，PSC)培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，每瓶接4塊，然后將培養(yǎng)瓶置于控溫搖床上，在25℃、120 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)15 d。待菌絲體長出，營養(yǎng)液由混濁變?yōu)榍宄簳r，先用2層紗布過濾掉培養(yǎng)液中的大量菌絲，再用2層濾紙過濾1次，將過濾后的溶液裝入離心管中，3 000 r·min-1離心20 min，去沉淀后用真空泵經(jīng)0.45 μm水相濾膜抽濾，再用細菌過濾器過濾滅菌，即得尖孢鐮刀菌粗毒素濾液，保存在4℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.3 尖孢鐮刀菌粗毒素篩選濃度的確定 將未經(jīng)輻射處理的玉女蘭類原球莖分別接到含0、20%、40%、60%和80%(v/v)粗毒素濾液的增殖培養(yǎng)基上，在26±1℃、散射光下培養(yǎng)30 d。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)18塊，15 d后記錄類原球莖的存活數(shù)，計算存活率，以存活率接近50%的粗毒素濃度作為突變體篩選濃度。類原球莖存活率=粗毒素處理后存活的類原球莖數(shù)/粗毒素處理的類原球莖數(shù)×100%。

1.2.4 玉女蘭抗性類原球莖的篩選 采用逐步篩選法[30]篩選抗性類原球莖。具體方法：將經(jīng)50 Gy12C6+重離子輻射后和未經(jīng)輻射的類原球莖接種在含20%粗毒素濾液的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d；隨后將存活的類原球莖接入含30%粗毒素濾液的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d；依次增加粗毒素濾液濃度至80%(每次遞增10%)，每30 d轉(zhuǎn)接1次；最后將存活的類原球莖轉(zhuǎn)接至不含粗毒素濾液的增殖培養(yǎng)基上進行增殖和分化。將分化出的高3～5 cm的苗轉(zhuǎn)接到以MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+卡拉粉7.8 g·L-1+蔗糖20.0 g·L-1和活性炭0.1 g·L-1的培養(yǎng)基中進行生根壯苗培養(yǎng)，當試管苗長到7 cm左右時進行移栽。移栽基質(zhì)為樹皮和泥炭的混合基質(zhì)(樹皮∶泥炭=2∶1)，花盆直徑為15 cm，在環(huán)控溫室中栽培。

篩選和培養(yǎng)過程中記錄存活的類原球莖(稱為抗性系)數(shù)量、分化成苗的抗性系數(shù)量和移栽成活的抗性系數(shù)量，計算抗性系篩選率。抗性系篩選率=篩選后存活的類原球莖數(shù)/篩選前類原球莖總數(shù)×100%。

1.2.5 玉女蘭抗性類原球莖防御酶活性的測定 將玉女蘭抗性系類原球莖和未經(jīng)處理的類原球莖分別接到含80%粗毒素濾液和不含粗毒素濾液的增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分別于0、12、24、36、48和72 h取樣測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、過氧化物酶(peroxidase，POD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。具體方法：取0.3 g新鮮類原球莖加入4 mL 0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(pH值7.8)于冰浴中研磨成漿，轉(zhuǎn)入5 mL離心管，于4℃、8 000 r·min-1離心15 min，取上清液用于酶活性測定。POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，SOD活性測定采用NBT光化學(xué)還原法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[31]。每個處理重復(fù)3次。

1.2.6 抗性系苗期莖腐病的抗性鑒定 采用有傷貼接法對抗性系試管苗和移栽7個月的小苗進行病原菌接種。具體方法：用無菌針從側(cè)面中間刺入蘭花假鱗莖2～3 mm，挑取直徑5 mm活化好的尖孢鐮刀菌菌絲塊貼接于刺傷部位，每株1片，每個抗性系試管苗接種10株，小苗接種30株，以未經(jīng)輻射的玉女蘭類原球莖分化的試管苗和移栽7個月的小苗為對照。接種后的試管苗在空氣濕度80%、溫度25℃、光照強度13 000 lx、光照時間10 h·d-1的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，而小苗在白天28±2℃/夜晚20±2℃、空氣濕度80%、光照時間10 h·d-1、光照強度15 000 lx的環(huán)境中栽培。每日觀察試管苗和小苗的發(fā)病情況，15 d后統(tǒng)計試管苗的存活數(shù)，25 d后記錄小苗的發(fā)病情況，根據(jù)發(fā)病癥狀確定病情等級(表1)，計算病情指數(shù)，進行病情評價和抗病性評價。病情指數(shù)=[∑(病級株數(shù)×病級數(shù)值)/(株數(shù)總和×最高病級數(shù)值)]×100%，病情評價和抗病性評價參照方中達[32]的方法。

表1 蘭花莖腐病病情分級Table 1 The disease grade of stem rot in Cymbidium

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和作圖，用SPSS 20.0進行單因素方差分析和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 12C6+重離子輻射對玉女蘭類原球莖的致死效應(yīng)

經(jīng)不同劑量12C6+重離子輻射后的玉女蘭類原球莖在增殖培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3個月后，其褐化和死亡情況見表2。結(jié)果表明，12C6+輻射顯著提高了玉女蘭類原球莖的褐化率和死亡率，且輻射劑量愈高，褐化率和死亡率愈高；當輻射劑量為50 Gy時，玉女蘭類原球莖的死亡率為54.66%，接近半致死劑量。對不同輻射劑量的死亡率進行線性回歸分析，計算得到玉女蘭類原球莖12C6+重離子輻射的半致死劑量為49 Gy。

表2 輻射劑量對玉女蘭類原球莖褐化率和死亡率的影響Table 2 Effect of irradiation dosage on mortality and browning rate of PLBs in Cym. Yunv

2.2 尖孢鐮刀菌粗毒素篩選濃度的確定

尖孢鐮刀菌粗毒素濾液對玉女蘭類原球莖的存活有顯著的抑制作用(圖1)，且粗毒素濃度越高，抑制效果越明顯。對不同粗毒素濾液濃度的存活率進行線性回歸分析，計算得到玉女蘭類原球莖的半致死濃度為80.5%。當粗毒素濾液濃度為80%時，玉女蘭類原球莖的存活率為41.98%，接近半致死劑量，因此可采用80%粗毒素濾液濃度作為玉女蘭抗莖腐病突變體篩選的篩選壓。

注：不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。Note:Different lowercase letters in the same line indicate significant difference at 0.05 level.The same as following.圖1 粗毒素濃度對玉女蘭類原球莖存活率的影響Fig.1 Effect of crude toxin concentration on PLBs survival rate in Cym. Yunv

2.3 玉女蘭抗尖孢鐮刀菌抗性系的篩選

采用圖2所示的篩選流程，以尖孢鐮刀菌粗毒素濾液為篩選劑，采用逐步篩選法對經(jīng)50 Gy12C6+重離子輻射的300塊玉女蘭類原球莖進行抗莖腐病突變體篩選。當尖孢鐮刀菌粗毒素濾液濃度增加到80%篩選壓下，共篩選到14個抗性系類原球莖，篩選率為4.67%；其中僅有5個抗性系類原球莖分化成苗，最終有3個抗性系的試管苗移栽成活，分別為Z50Gt1、Z50Gt2和Z50Gt3；而對照組類原球莖全部死亡(圖3)，即未能從未經(jīng)重離子輻射的類原球莖中獲得抗病突變體。

圖2 玉女蘭抗莖腐病突變體的篩選過程Fig.2 The screening process of mutants resistant to stem rot in Cym. Yunv

注：a～c為尖孢鐮刀菌粗毒素濾液多步篩選獲得的抗性系類原球莖；a：抗性系類原球莖Z50Gt1和Z50Gt2(箭示)；b：抗性系類原球莖Z50Gt3(箭示)；c：未經(jīng)輻射的類原球莖；d～f為抗性系類原球莖在不含尖孢鐮刀菌粗毒素濾液培養(yǎng)基上的增殖和分化；d：Z50Gt1；e：Z50Gt2；f：Z50Gt3；g～i為抗性系試管苗接種鑒定；g：Z50Gt3(左)和對照(右)；h：Z50Gt2；i：Z50Gt1。Note:a to c represents PLBs of resistant lines developed on the medium containing crude toxic leachate of Fusarium oxysporum. a:PLBs of resistant line Z50Gt1 and Z50Gt2 (arrow).b:PLBs of resistant line Z50Gt3 (arrow).c:PLBs of CK.d to f represents proliferation and differentiation of PLBs of resistant lines on medium without crude toxic leachate.d:Z50Gt1,e:Z50Gt2,f:Z50Gt3.g to i represents evaluation of test-tube seedling resistant to stem rot by artificial inoculation.g:Z50Gt3 (left)and CK (right).h:Z50Gt2,i:Z50Gt1.圖3 玉女蘭抗性系類原球莖及其組織培養(yǎng)和試管苗抗性鑒定Fig.3 The PLBs of resistant lines and its tissue culture,and resistant identification of its test-tube seedling in Cym. Yunv

2.4 抗尖孢鐮刀菌玉女蘭類原球莖防御酶活性的變化

在粗毒素濃度為80%的培養(yǎng)基上，抗性玉女蘭類原球莖和對照的SOD活性均隨處理時間增加逐漸升高，但抗性類原球莖的SOD活性始終高于對照(圖4-a)，說明經(jīng)篩選得到的抗性類原球莖清除氧自由基的能力增強，SOD活性的變化與其抗性增強有關(guān)?？剐杂衽m類原球莖和對照的POD活性隨處理時間的延長呈先上升后下降趨勢，且活性峰值均出現(xiàn)在處理24 h時；抗性類原球莖的POD活性始終高于對照，峰值比對照提高了867.67 U·g-1·h-1(圖4-b)，說明毒素處理可誘導(dǎo)POD活性的增加。處理36 h前，抗性玉女蘭類原球莖的MDA含量高于對照；處理36 h后，對照類原球莖的MDA含量迅速上升并高于抗性玉女蘭類原球莖(圖4-c)，這說明對照類原球莖對毒素脅迫更加敏感，使體內(nèi)迅速累積大量的MDA，而抗性類原球莖在毒素協(xié)迫下MDA含量緩慢上升，說明其具有較強的抵御膜脂過氧化的能力。

2.5 玉女蘭抗性系苗期莖腐病抗性鑒定

分別從玉女蘭抗性系Z50Gt1、Z50Gt2和Z50Gt3的試管苗中選擇10株苗進行尖孢鐮刀菌病原菌接種鑒定，結(jié)果見表3。Z50Gt2和Z50Gt3兩個抗性系試管苗分別有4株(圖3-g)和2株存活(圖3-h)，存活率分別為40%和20%；而抗性系Z50Gt1(圖3-i)和對照試管苗全部感病死亡(圖3-g)，表明Z50Gt2和Z50Gt3兩個抗性系是抗莖腐病突變體。

表3 玉女蘭試管苗莖腐病抗性鑒定Table 3 Resistance evaluation of test-tube seedlings in Cym. Yunv

對Z50Gt2和Z50Gt3移栽后7個月的盆栽小苗進行接種鑒定，結(jié)果表明，Z50Gt2和Z50Gt3的病情指數(shù)顯著低于對照，分別為20.00%和19.33%，屬于抗性級別(表4和圖5)，說明經(jīng)毒素篩選后的類原球莖的抗性顯著高于對照。

表4 玉女蘭小苗莖腐病抗性鑒定Table 4 Resistance evaluation of 7-month-old pot plants in Cym. Yunv

注：數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；*表示抗性類原球莖與對照差異顯著(P<0.05)。Note:Data was presented as mean ± S.E.* indicated significant difference between resistant PLBs and control at 0.05 level.圖4 玉女蘭類原球莖在含毒素培養(yǎng)基上SOD(a)、POD(b)活性和MDA含量(c)的變化Fig.4 Changes of SOD (a),POD (b)activity and MDA content (c)of PLBs on the toxin-containing medium

注：a：接種前對照植株；b：接種前突變體植株(右Z50Gt2，左Z50Gt3)；C：接種30 d的對照植株；D：接種30 d的突變體植株(右Z50Gt2，左Z50Gt3)。Note:a:CK plants before inoculation.b:Mutants plant (right Z50Gt2,left Z50Gt3)before inoculation.c:CK plants of 30 d after inoculation.d:Mutant plants (right Z50Gt2,left Z50Gt3)of 30 d after inoculation.圖5 接種前后玉女蘭抗性突變體和對照小苗的表現(xiàn)Fig.5 Symptoms of 7-month-old pot plants from mutants and CK before and after inoculation in Cym. Yunv

3 討論

莖腐病是蘭花的主要病害，嚴重威脅蘭花產(chǎn)業(yè)的高效可持續(xù)發(fā)展。玉女蘭是本研究前期培育的觀賞價值極高的雜交蘭，在中國蘭花博覽會、北京世界園藝博覽會等屢獲大獎，市場前景十分廣闊，但該品種不抗莖腐病，嚴重限制了其推廣應(yīng)用。

利用重離子輻射可獲得花色、花形等性狀發(fā)生變異的突變體，同時也會對輻射材料產(chǎn)生損傷和抑制效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)12C+6重離子輻射對玉女蘭類原球莖具有明顯的致死效應(yīng)，且隨著輻射劑量的升高，致死效應(yīng)增強，與陳臻等[33]、朱宗文等[34]和Nakano等[35]的研究結(jié)果一致。

大量研究表明，利用離體誘變、組織培養(yǎng)和毒素篩選技術(shù)可以較快獲得抗病突變體[27,36-37]。本研究利用12C6+重離子輻射技術(shù)，結(jié)合尖孢鐮刀菌粗毒素離體篩選技術(shù)，成功獲得了抗莖腐病突變體植株，而在未輻射的類原球莖中未獲得抗病突變體，說明重離子輻射能提高輻射材料的抗逆性，與李雪虎等[38]、薛林貴等[39]的研究結(jié)果一致。利用致病毒素篩選抗病突變體時大多采用逐步遞增毒素濃度的正選擇法。趙蕾等[40]認為利用毒素篩選抗性突變體時，采用多步正向選擇法可選出多基因突變的突變體；劉海瑞等[41]在利用枯萎病菌粗毒素篩選香蕉抗枯萎病突變體時確定多步篩選方案為最佳篩選方案；楊媚等[24]、林叢發(fā)等[42]、蘇媛等[43]和Yerzhebayeva等[44]采用逐級加壓法分別獲得了香蕉抗枯萎病突變體、太子參抗葉斑病突變體、草莓抗枯萎病突變體和甜菜抗尖孢鐮刀菌突變體。本研究在利用尖孢鐮刀菌粗毒素篩選玉女蘭抗性類原球莖時，采取將粗毒素濃度從10%逐步增加到80%的多步篩選法，從300塊經(jīng)12C6+重離子輻射的類原球莖中獲得5塊具有芽分化能力的抗性類原球莖，說明采用正向多步篩選法進行蘭花抗病突變體篩選是可行的。

曲玲等[45]認為由于愈傷組織細胞之間的接觸較緊密，使一些細胞可能逃脫選擇劑的作用而出現(xiàn)漏篩，因此有必要對抗性愈傷組織變異體進行鑒定。研究者們普遍采用一些生理生化指標對抗病細胞突變體進行間接鑒定，常用指標有苯丙氨酸酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)、POD、SOD、PPO等保護酶活性和MDA含量[46-50]。本試驗對抗性類原球莖在毒素脅迫下的SOD、POD活性及MDA含量進行了測定，發(fā)現(xiàn)抗性類原球莖的SOD、POD活性均比對照高，隨著毒素脅迫時間的延長，兩種酶的活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，說明抗性變異系通過增強與抗病性相關(guān)酶的活性，以加強同植物防衛(wèi)有關(guān)的物質(zhì)代謝，與曲玲等[45]的研究結(jié)果一致。

對通過病原菌毒素壓力選擇的抗性變異體進行抗性和穩(wěn)定性分析是必要的，植株接種鑒定是最直接有效的抗性鑒定方法[25,51]。程智慧等[52]利用大蒜葉枯病粗毒素離體篩選出抗葉枯病變異系，經(jīng)病菌孢子懸浮液接種鑒定發(fā)現(xiàn)變異系苗抗病性較對照提高，通過毒素篩選獲得的再生植株，后代在侵染初期通過抑制或延緩病菌的生長而達到高度的抗病性。本研究對2個抗性系7個月的盆栽小苗進行病原菌接種鑒定，結(jié)果表明，2個抗性系植株的抗病水平顯著高于對照，對莖腐病的抗性均達到了抗級，與楊媚等[24]、劉海瑞等[41]、王荔等[53]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，以尖孢鐮刀菌粗毒素濾液為篩選劑，采用逐步篩選法從300塊經(jīng)50 Gy12C6+重離子輻射過的玉女蘭類原球莖中篩選出3個抗性系，Z50Gt1、Z50Gt2和Z50Gt3；3個抗性系的試管苗經(jīng)人工接種鑒定表明，抗性系Z50Gt2和Z50Gt3的再生植株具有莖腐病抗性，2個抗病株系7個月大的盆栽植株病情指數(shù)分別為20.00%和19.33%，顯著低于對照，達到了抗性級別。本研究結(jié)果表明通過重離子輻射結(jié)合毒素篩選是培育蘭花抗莖腐病新品種的有效途徑。