不同添加量的聚-β-羥基丁酸酯作為生物絮凝緩釋碳源的應(yīng)用效果

吳 霞，吳長勝，王國慶，羅國芝 ，2，3，譚洪新 ，2，3

(1 上海海洋大學(xué) 上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2 上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

生物絮凝技術(shù)(Bio-floc Technology，BFT)通過向養(yǎng)殖水體添加有機(jī)碳源來提高養(yǎng)殖水體的碳氮比(C/N>15)[1]，培育系統(tǒng)自身對于氨氮的控制能力，形成細(xì)菌、原生動(dòng)物、有機(jī)顆粒物等聚焦而成的生物絮團(tuán)[2-3]，獲能的異養(yǎng)細(xì)菌得到較高的生長速率獲得優(yōu)勢生長，構(gòu)建了水體中穩(wěn)定的微生物群落抑制病原體的生長[4-5]。

碳源的選擇對養(yǎng)殖對象的生長、絮團(tuán)營養(yǎng)組分及水質(zhì)都可能產(chǎn)生影響[6-8]。傳統(tǒng)碳源主要有葡萄糖、淀粉、糖蜜等[9-10]?？缮锝到饩酆衔?Biological degradable polymers，BDPs)作為生物絮凝養(yǎng)殖模式的緩釋碳源時(shí)可以避免過量添加、添加不足或難以計(jì)算等問題[11]。聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone，PCL)被證實(shí)可以成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中進(jìn)行異養(yǎng)反硝化的優(yōu)質(zhì)碳源[12]。Qiao等[13]研究表明，養(yǎng)殖過程中在飼料中添加4%的聚-β-羥基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate，PHB)可以顯著改變養(yǎng)殖生物的腸道微生物結(jié)構(gòu)，上調(diào)相關(guān)免疫基因表達(dá)，PHB在水體中也可作為微生物集聚的媒介。BFT形成生物絮體時(shí)水體中的糞便和殘飼也得以被重新利用，形成的生物絮團(tuán)也可被濾食性養(yǎng)殖對象攝食[14]，PHB作為微生物介導(dǎo)的緩釋碳源在水體中降解緩慢不會(huì)留下過多殘余[15-17]。張楠等[18]研究了PHB與傳統(tǒng)碳源葡萄糖作為生物絮凝碳源對羅非魚養(yǎng)殖效率的影響對比，羅非魚的生長指標(biāo)并沒有出現(xiàn)顯著差異，且使用PHB代替?zhèn)鹘y(tǒng)碳源可以在養(yǎng)殖階段維持水體C/N適宜。

目前有關(guān)PHB作為生物絮凝碳源的研究，多集中在PHB作為生物絮凝系統(tǒng)緩釋碳源的可行性的探索階段，缺少PHB作為生物絮凝系統(tǒng)緩釋碳源投放策略的進(jìn)一步研究。本研究以PHB作為生物絮凝的緩釋碳源，研究不同添加量的PHB作為BFT碳源對羅非魚生長及對生物絮凝系統(tǒng)的影響，尋求PHB作為BFT碳源的適宜添加量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)在上海海洋大學(xué)養(yǎng)殖工程與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水養(yǎng)殖研發(fā)中心進(jìn)行。養(yǎng)殖裝置為9個(gè)白色牛筋塑料桶，其規(guī)格為上外徑為65 cm，上內(nèi)徑58 cm、下外徑51 cm、下內(nèi)徑50 cm、高度76 cm、質(zhì)量4.5 kg。養(yǎng)殖桶容積150 L，試驗(yàn)所用工作容積120 L。所有養(yǎng)殖桶安置在室內(nèi)環(huán)境中，養(yǎng)殖桶上方全程蓋上配套桶蓋。養(yǎng)殖桶連接羅茨鼓風(fēng)機(jī)(型號HG-750，浙江森森森股份有限公司)，桶內(nèi)接入一個(gè)直徑為50 mm的面包形曝氣石，沉于桶底正中央使得各桶獲得足夠的溶氧及使絮團(tuán)懸浮的攪拌力。

PHB購自廣東迪捷塑化有限公司，為白色米粒狀結(jié)晶顆粒，長度3～5 mm，中心橫切直徑約3 mm，經(jīng)純水2～3次清洗后經(jīng)過45℃恒溫烘箱烘干至恒重后備用。

試驗(yàn)用魚為吉富羅非魚(GIFT Oreochromis niloticus)取自上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后在循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)至(8.97±2.53)g/尾。使用預(yù)先培育好的生物絮團(tuán)。暫養(yǎng)及試驗(yàn)期間用于投喂羅非魚的飼料皆為通威股份有限公司出產(chǎn)的魚用膨化配合飼料“魚倍健150”。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)周期為48 d，在9個(gè)養(yǎng)殖桶接種預(yù)先培好的生物絮團(tuán)，調(diào)控其絮團(tuán)含量為300 mg/L。養(yǎng)殖的羅非魚初始質(zhì)量為(8.97±2.53)g，每個(gè)養(yǎng)殖桶初始投放20尾魚苗。各組通過尼龍網(wǎng)袋分別按照約80 g/m3、200 g/m3、320 g/m3的比例添加PHB，添加量分別為A組10 g、B組25 g、C組40 g，每組3個(gè)平行。網(wǎng)袋懸于水體上層區(qū)域并于袋中置入4只玻璃珠用于幫助掛袋懸浮不受水體攪拌力的影響。

試驗(yàn)期間每日按3.00%投飼量分早中晚3次投喂，每10 d隨機(jī)稱重羅非魚，根據(jù)稱重結(jié)果進(jìn)行投喂量的調(diào)整。每4 d測定堿度及總固體懸浮顆粒物(TSS)質(zhì)量濃度，使用碳酸氫鈉以調(diào)整堿度，使堿度維持在150.00～300.00 mg CaCO3/L，將TSS維持在300～600 mg/L。

1.3 水質(zhì)指標(biāo)的測定

SR=(N2/N1)×100%

(1)

WGR=(W2-W1)/W1×100%

(2)

SGR=(lnW2-lnW1)/t×100%

(3)

FCR=F1/(W2-W1)

(4)

式中：SR—存活率；WGR—增重率；SGR—特定生長率；FCR—飼料系數(shù)；N1—投入養(yǎng)殖水體魚的數(shù)量，尾；N2—試驗(yàn)結(jié)束后還存活魚的數(shù)量，尾；W1—投入養(yǎng)殖水體魚的初始質(zhì)量，g；W2—養(yǎng)殖階段結(jié)束后魚的質(zhì)量，g；t—養(yǎng)殖天數(shù)，d；F1—飼料投喂量，g。

1.4 絮團(tuán)營養(yǎng)指標(biāo)的測定

養(yǎng)殖階段結(jié)束后，養(yǎng)殖水經(jīng)過自然沉降后過800目尼龍篩布濾出絮體，將絮體進(jìn)行冷凍干燥48 h，利用粉碎機(jī)研磨至粉末狀，使用碳、氮元素分析儀測定絮體粉末碳氮元素的含量。粗蛋白使用凱氏定氮儀(Kjeltec2300)直接測定；取干燥恒重后的絮體粉末先在電爐進(jìn)行5 min灼燒后轉(zhuǎn)移至馬弗爐(SR-JX3-9 箱式電爐)中，設(shè)置溫度260 ℃，灼燒5 h至恒重，根據(jù)差值測定其粗灰分，水解氨基酸參照國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

在Excel軟件內(nèi)進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，并且使用 Origin2018以及Adobe Illustrator CC 2018 軟件進(jìn)行相關(guān)的圖表繪制。試驗(yàn)數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)的形式表示，采用IBM SPSS Statistics 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行 ANOVA 單因素方差分析，(P<0.05)為差異性顯著，(P>0.05)為差異性不顯著。

2 結(jié)果

2.1 水質(zhì)參數(shù)

如表1所示，試驗(yàn)期間各處理組溶氧為7.69～8.62，pH的范圍在7.82～8.43，各組水溫維持在23.18～24.50℃。PHB添加量的不同對溶解性有機(jī)碳比總氮的比值有顯著影響，B組的碳氮比(DOC/TN)顯著低于A組及C組(P<0.05)。

表1 試驗(yàn)期間各處理組水質(zhì)指標(biāo)的平均值Tab.1 Mean values of water quality indexes in different groups

圖1 養(yǎng)殖過程中各組三態(tài)氮及總氮的變化Fig.1 Dynamic changes of three-state nitrogen and total nitrogen in each group

由圖2可知，各組DOC質(zhì)量濃度隨著試驗(yàn)的進(jìn)行出現(xiàn)了積累，B組及C組于試驗(yàn)后第36 天開始出現(xiàn)下降后再上升的情況，B組于試驗(yàn)后期積累程度更小，試驗(yàn)結(jié)束后A組的DOC積累高于C組。隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，A組試驗(yàn)后期可以將碳氮比穩(wěn)定維持在15以上的較高水平，C組碳氮比波動(dòng)較為劇烈，部分時(shí)期無法維持碳氮比在15以上，而B組于試驗(yàn)后期碳氮比無法穩(wěn)定維持在15以上。

圖2 各組溶解性有機(jī)碳及溶解性有機(jī)碳比總氮的變化Fig.2 Changes of dissolved organic carbon and the ratio of dissolved organic carbon to total nitrogen in each group

2.2 羅非魚的生長指標(biāo)

表2可知，各組羅非魚的生長指標(biāo)在存活率、增重率及特定增重率上，組間差異不顯著(P>0.05)，B組存活率相對較低(P>0.05)，特定增長率相對較高(P>0.05)。C組的飼料系數(shù)顯著低于A組和B組(P<0.05)，不同添加量PHB對羅非魚的生長指標(biāo)并不產(chǎn)生顯著影響。

表2 羅非魚的生長指標(biāo)Tab.2 Growth indexes of tilapias during the experiment

2.3 PHB的降解情況

各組試驗(yàn)前后PHB的質(zhì)量及耗損情況如表3所示，不同添加量的PHB作為系統(tǒng)碳源出現(xiàn)不同程度的降解耗損，降解耗損量差異顯著(P<0.05)，降解耗損量上整體呈現(xiàn)為A組0.05)，其中A、B組耗損率高于C組(P>0.05)。

表3 各組PHB試驗(yàn)前后質(zhì)量、試驗(yàn)后降解耗損質(zhì)量及耗損率Tab.3 The quality of PHB before and after the experiment,the quality of degradation and loss after the experiment,and the loss rate

圖3為試驗(yàn)前后各組PHB掃描電鏡檢測結(jié)果，圖3d為試驗(yàn)前未使用的PHB通過掃描電鏡對其表面進(jìn)行觀察，PHB表面皆呈現(xiàn)為光滑平坦，無明顯孔徑。70倍放大下，各組的PHB表面均出現(xiàn)的明顯的蜂窩狀孔徑。6 k及20 k倍放大下掃描成像可見，A組的PHB表面呈現(xiàn)出B組及C組沒有的蜂窩狀凹陷，B組及C組之間PHB表面破損情況在掃描電鏡放大60 k及20 k倍放大成像下差異不顯著，可見隨著PHB添加量的減少，較低的PHB作為碳源，PHB顆粒的降解破損程度更高。

圖3 各組PHB掃描電鏡圖Fig.3 PHB scanning electron micrographs of each group

試驗(yàn)后，各組PHB及未作為碳源的PHB做紅外光譜檢測，檢測圖譜如圖4所示，PHB紅外譜圖中1 452 cm-1和1 387 cm-1處的峰值與-CH3和-CH2基團(tuán)對應(yīng)，2 946 cm-1處的峰值對應(yīng)的是烷基-CH3基團(tuán)的延伸波段[21]。各組PHB與未經(jīng)歷降解的PHB主要吸收峰值基本保持一致?？梢奝HB作為碳源經(jīng)過降解后其分子結(jié)構(gòu)及主要化學(xué)鍵并未改變。

圖4 各組PHB紅外光譜掃描圖譜Fig.4 Infrared spectrum of PHB of each group

2.4 絮團(tuán)營養(yǎng)成分分析

如表4試驗(yàn)前后各組絮團(tuán)組分指標(biāo)所示，B組粗灰分含量(33.64±3.03)%顯著低于試驗(yàn)前絮團(tuán)中的粗灰分含量(39.25±0.45)%(P<0.05)，各組之間C/N、粗蛋白及粗灰分含量無顯著差異(P>0.05)，C組試驗(yàn)后C/N相對較低而粗蛋白相對較高(P>0.05)。A、B和C組組間粗脂肪含量差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)前后，A組粗脂肪皆高于B、C組，試驗(yàn)后各組的粗脂肪相比與試驗(yàn)前出現(xiàn)量不同程度的升高(P>0.05)。

表4 試驗(yàn)前后各組絮團(tuán)組分指標(biāo)Tab.4 Index of group floccules before and after the experiment

對比試驗(yàn)前絮團(tuán)，試驗(yàn)后各組生物絮團(tuán)中的17種氨基酸的相對含量如表5所示。試驗(yàn)后的各組絮團(tuán)的必需氨基酸Thr、Phe、His及非必需氨基酸Asp、Cys、Tyr較試驗(yàn)前出現(xiàn)的顯著下降(P<0.05)。試驗(yàn)前生物絮團(tuán)的非必需氨基酸Ser顯著低于試驗(yàn)后各組生物絮團(tuán)Ser的相對含量(P<0.05)。必需氨基酸Thr、Phe、His、Asp、Cys、Tyr的相對含量試驗(yàn)前后及組間無顯著差異(P>0.05)，必需氨基酸Glu、Gly、Ala試驗(yàn)前后及組間無顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)后的B組的必需氨基酸Met的相對含量顯著高于C組，A組及C組Met相對含量差異不顯著(P>0.05)，不同的PHB添加量對胱氨酸Cys相對含量影響顯著(P<0.05)。

表5 試驗(yàn)前后各組17種氨基酸相對含量(%)Tab.5 The relative content of 17 amino acids in each group before and after the experiment(%)

3 討論

3.1 各組PHB作為系統(tǒng)碳源的損耗情況

不同的投放量的PHB作為BFT系統(tǒng)的碳源，各組損耗質(zhì)量出現(xiàn)顯著差異，3組的降解耗損質(zhì)量隨著PHB的投放量增加而增大。而PHB表面的降解破損程度并不是隨著添加劑添加量的提高而增高，A組的損耗質(zhì)量最少但PHB表面形成了更為明顯的蜂窩狀孔徑。陳珊等[23]研究表示，PHB是由外部的非結(jié)晶部分及內(nèi)部的結(jié)晶部分組成，而內(nèi)部結(jié)晶易降解程度更高。由此可知，PHB是一種內(nèi)外部分結(jié)構(gòu)致密程度不同的物質(zhì)，微生物附著于PHB表面會(huì)首先降解表面的非結(jié)晶部分，其次是內(nèi)部結(jié)晶部分，因此系統(tǒng)中的微生物為了獲得足夠的碳會(huì)優(yōu)先利用到PHB內(nèi)部的結(jié)晶部分，內(nèi)部的結(jié)晶部分更易受到降解，形成的孔徑又可在PHB表面加大與水體接觸面從而附著更多的微生物，進(jìn)一步促進(jìn)A組的降解。因此A組的PHB表面破損程度更高。

3.2 不同PHB作為碳源對羅非魚養(yǎng)殖及系統(tǒng)水質(zhì)的影響

本試驗(yàn)經(jīng)過48 d的養(yǎng)殖周期，各組存活率、增重率及特定增長率差異均不顯著，與邵李娜等[15]使用BHPV作為碳源養(yǎng)殖斑點(diǎn)叉尾研究結(jié)果相同，考慮可能是養(yǎng)殖周期短的原因。

氨氮及亞硝酸鹽氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要指標(biāo)，因其對系統(tǒng)及養(yǎng)殖對象等毒害作用需要進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測[23-26]。試驗(yàn)開始的20 d后TAN的峰值隨著PHB添加量的減少而提高，C組的水質(zhì)相對更加穩(wěn)定，但試驗(yàn)期間各組TAN均處于低于2 mg/L的較低范圍內(nèi)。亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度各組試驗(yàn)期間低于0.5 mg/L。由陳偉等[27]研究表明，添加碳源有助于反應(yīng)器TN的去除，各處理組之間TN的去除隨著C/N的升高，去除率也逐漸升高，與本試驗(yàn)結(jié)果相同。

基于BFT的水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中實(shí)時(shí)監(jiān)測C/N非常困難，不論是水溶性碳源還是PHB作為碳源C/N隨著碳源的添加或消耗以及魚飼料或糞便中的氮素水平都會(huì)不斷變化。因此各組PHB釋碳量的差異并不是造成組間DOC、DOC/TN的組間差異的唯一原因。但鑒于C/N對于BFT養(yǎng)殖模式的重要意義，依舊選用DOC/TN作為考察PHB作為碳源釋碳效果的重要指標(biāo)。由于PHB的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)PHB內(nèi)外部分釋放碳量存在的差異性，無法為水體在試驗(yàn)開始的前期提供過多的碳[28-29]。試驗(yàn)后期各組的DOC/TN水平出現(xiàn)顯著差異，B組的DOC/TN顯著低于其他兩組，A組已經(jīng)開始降解內(nèi)部結(jié)晶部分，釋碳量加大，而C組由于投放量大，PHB與水體接觸面積更高，使得C組相較于B組于同一時(shí)間時(shí)降解更充分。A組PHB降解損耗質(zhì)量最小，但試驗(yàn)期間可以將C/N穩(wěn)定維持在15以上，而B和C組于試驗(yàn)期間無法穩(wěn)定維持C/N在較高水平。結(jié)合各組PHB降解消耗質(zhì)量的結(jié)果，從使用最優(yōu)化的角度出發(fā)，按80 g/m3的添加比例添加PHB為更好的選擇，另外關(guān)于使用量的進(jìn)一步減少是否合適也有待在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步進(jìn)行。

3.3 不同PHB添加量對絮團(tuán)的營養(yǎng)組分的影響

有相關(guān)研究表明絮團(tuán)的粗蛋白含量在38.5%～57.4%，粗灰分<20%，粗脂肪在20%～35%,能量在 20～25 kJ/g[30]。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明不同添加量的PHB作為BFT的碳源對系統(tǒng)絮團(tuán)的粗蛋白、粗灰分及粗脂肪的含量并不會(huì)造成顯著影響。考慮本身PHB的消耗量較少無法對絮團(tuán)產(chǎn)生顯著影響，且 PHB作為中微生物介導(dǎo)的緩釋碳源，本身在釋放碳的過程中不會(huì)在水體中形成過多殘留，因此各組絮團(tuán)營養(yǎng)組分差異不顯著。因此相較于水溶性的碳源只要保證適合的PHB添加量，不會(huì)產(chǎn)生碳源添加過量影響系統(tǒng)絮團(tuán)穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

由于PHB自身結(jié)構(gòu)特性，維持生物絮凝C/N的水平并不隨著添加量的提高而升高，當(dāng)PHB的添加比例為80 g/m3時(shí)，可以在養(yǎng)殖過程中穩(wěn)定維持生物絮凝系統(tǒng)較高的C/N，更有利于系統(tǒng)水質(zhì)穩(wěn)定，養(yǎng)殖適宜。

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