單眼剝奪性弱視小鼠圖形視覺(jué)誘發(fā)電位時(shí)間頻率調(diào)制變化的研究

馬博文，呂文超，王玨，張偉，史學(xué)鋒

在視覺(jué)發(fā)育早期，由于異常視覺(jué)經(jīng)驗(yàn)引起的視覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異?？蓪?dǎo)致弱視［1-2］。弱視在兒童中的患病率為2%～3%［3］。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，弱視是以空間分辨力（視銳度）下降、對(duì)比敏感度降低和整體加工能力降低等為特點(diǎn)的空間信息處理能力缺陷為主的疾?。?］。然而，近年有研究表明，在弱視患者中，視覺(jué)相關(guān)的時(shí)間信息處理能力也會(huì)發(fā)生改變［5-6］。諸多與時(shí)間頻率有關(guān)的指標(biāo)，如臨界融合頻率、時(shí)間對(duì)比敏感度［7］、時(shí)空對(duì)比敏感度、時(shí)間超銳度等均會(huì)出現(xiàn)一定程度的損害。有關(guān)弱視猴的研究顯示，與正常眼相比，弱視眼在高時(shí)間頻率時(shí)的時(shí)間對(duì)比敏感度差異大于低時(shí)間頻率時(shí)的差異［8］。因此，深入研究弱視的時(shí)間信息處理能力缺陷及其機(jī)制有重要的臨床意義。視覺(jué)誘發(fā)電位（visual evoked potential，VEP）是從視皮層腦電活動(dòng)中提取的視覺(jué)刺激誘發(fā)的電生理信號(hào)，是評(píng)估弱視視覺(jué)功能的一種重要的客觀檢查方法。本研究采用基于腦表面埋置電極記錄［9］的方法觀察單眼剝奪性弱視小鼠圖形視覺(jué)誘發(fā)電位（pattern visual evoked potential，PVEP）的時(shí)間頻率調(diào)制的變化，為深入探討弱視的時(shí)間信息加工功能損害機(jī)制建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 C57BL/6J雄性SPF級(jí)小鼠18只，生后26 d，體質(zhì)量12～15 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，屈光間質(zhì)透明無(wú)病變。將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和單眼剝奪（monocular deprivation，MD）組，每組9只。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，溫度18～26℃，采用12 h/12 h光照/黑夜環(huán)境交替飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)要求（倫理審查編號(hào)：IRM-DWLL-2020159）。

1.2研究方法

1.2.1單眼剝奪性弱視模型的建立 小鼠于麻醉?xiàng)l件下，剪去右眼的上下瞼緣，采用10/0尼龍線將上下瞼緣對(duì)齊縫合，在切口處涂典必殊眼膏預(yù)防感染。術(shù)后每天檢查切口愈合情況，5 d后拆除縫合線，打開(kāi)已閉合的眼瞼，并在顯微鏡下觀察屈光間質(zhì)的透明度。如遇造模中途眼瞼開(kāi)裂，或造模完成后發(fā)現(xiàn)屈光間質(zhì)混濁等異常情況，則不予入組并以新鼠替補(bǔ)，重新造模。見(jiàn)圖1。

1.2.2電極埋置 采用腦表面電極埋置技術(shù)［9］。小鼠行5%水合氯醛（10μL/g）麻醉后，將其固定在立體定位儀上。使用體溫維持儀保持其體溫在36.5℃。雙眼涂眼膏或硅油以防止其角膜干燥。碘附消毒后，剪去小鼠顱骨表面的皮毛，于記錄眼對(duì)側(cè)視皮層雙眼區(qū)（后囟旁3 mm），以1.5 mm為直徑開(kāi)一個(gè)微小顱窗，保留硬腦膜，并將自制金屬電極放置在視皮層表面硬腦膜上，將透明玻璃片蓋于其上，并用生物膠固定，即完成記錄電極的埋置。于記錄眼同側(cè)額骨上，用相同方法埋置參考電極。最后使用牙科水泥覆蓋暴露的顱骨。待小鼠在體溫維持儀上蘇醒后，再將其放回籠中。

Fig.1 Monocularly deprived mouse model圖1 單眼剝奪性弱視小鼠模型

1.2.3數(shù)據(jù)采集 于電極埋置術(shù)后第1天，將小鼠麻醉后，待其尾部夾捏反應(yīng)消失，將其置于視覺(jué)刺激器屏幕正前方15 cm處。將記錄電極和參考電極與前置放大器的電極接頭相連。記錄過(guò)程中若小鼠出現(xiàn)夾捏反應(yīng)，則追加少量麻醉藥。測(cè)試過(guò)程中使用的視覺(jué)刺激采用自編的Matlab程序控制。采用垂直光柵圖形刺激，光柵空間頻率一致，均為0.02周/度，疊加次數(shù)240次，屏幕亮度20坎德拉/平方米（cd/m2），對(duì)比度為80%。按照事先設(shè)計(jì)的偽隨機(jī)序列給予小鼠6種不同時(shí)間頻率的視覺(jué)刺激。6種時(shí)間頻率分別為2.50、1.25、1.00、0.75、0.50和0.25 Hz。相鄰2次刺激間在空間相位上以180°翻轉(zhuǎn)，后一次刺激發(fā)生的時(shí)間間隔為偽隨機(jī)序列確定的相應(yīng)時(shí)間頻率的倒數(shù)。所有數(shù)據(jù)采集過(guò)程均在暗環(huán)境中進(jìn)行。記錄到的視覺(jué)誘發(fā)電位信號(hào)通過(guò)CED1401數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（英國(guó)Cambridge Electronic Design公司）采集并通過(guò)Spike2軟件（英國(guó)Cambridge Electronic Design公司）保存在電腦中。將采集到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Matlab軟件，用自編的程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行疊加平均處理，分析不同刺激條件下得到的PVEP P100波振幅。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9.1.1統(tǒng)計(jì)軟件（美國(guó)GraphPad Software公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，采用±s形式表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法。2組間相同時(shí)間頻率條件下PVEP測(cè)量結(jié)果的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MD小鼠PVEP反應(yīng)的時(shí)間頻率調(diào)制特性的改變 對(duì)照組小鼠對(duì)所有6種時(shí)間頻率的PVEP P100波反應(yīng)幅值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.214，P＞0.05），見(jiàn)圖2。MD組小鼠對(duì)6種時(shí)間頻率的PVEP P100波反應(yīng)幅值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.588，P＜0.01），其時(shí)間頻率調(diào)制曲線表現(xiàn)為低通特性，在高時(shí)間頻率刺激條件下的反應(yīng)顯著低于低時(shí)間頻率刺激條件下反應(yīng)，見(jiàn)圖3。

Fig.2 Temporal frequency tuning curve of PVEP responses in the Ctrl group圖2 對(duì)照組小鼠PVEP反應(yīng)的時(shí)間頻率調(diào)制曲線

Fig.3 Temporal frequency tuning curve of PVEP responses in the MD group圖3 MD組小鼠PVEP反應(yīng)的時(shí)間頻率調(diào)制曲線

2.2 不同時(shí)間頻率刺激條件下2組小鼠PVEP反應(yīng)幅值的比較 高時(shí)間頻率（2.50和1.25 Hz）視覺(jué)刺激條件下，與對(duì)照組（145.7μV±63.8μV，155.7μV±54.2μV）相比，MD組（85.7μV±41.6μV，94.8μV±52.3μV）P100波幅值顯著降低（t分別為2.362和2.425，P＜0.05）。在中低時(shí)間頻率（1.00 Hz、0.75 Hz、0.50 Hz、0.25 Hz）刺激條件下，2組間P100波反應(yīng)幅值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為1.347、0.583、1.155和0.054，均P＞0.05）。

3 討論

弱視是指在兒童視覺(jué)發(fā)育早期由于單眼斜視、未矯正的屈光參差、高度屈光不正及形覺(jué)剝奪等異常視覺(jué)經(jīng)驗(yàn)而導(dǎo)致的單眼或雙眼視力受損的一種神經(jīng)發(fā)育異常性疾?。?0-11］。弱視引起的視覺(jué)損傷可伴隨終身且較明顯，是一個(gè)重要的公共健康問(wèn)題，其中單眼形覺(jué)剝奪性弱視較雙眼弱視后果更為嚴(yán)重。在視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期，視覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育非常迅速，這一時(shí)期各種異常視覺(jué)經(jīng)驗(yàn)即使是短暫的作用都極易干擾和破壞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，導(dǎo)致視力、立體視功能、眼球運(yùn)動(dòng)功能等發(fā)育的異常［12］。在視覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)中，視覺(jué)刺激引起視皮層神經(jīng)元群體產(chǎn)生的信號(hào)必須進(jìn)行整合以形成視覺(jué)感知［13］。正常的視覺(jué)信息的整合既包括空間信息的整合，也包括時(shí)間信息的整合。既往研究發(fā)現(xiàn)，大鼠外側(cè)膝狀體神經(jīng)元的時(shí)間頻率調(diào)諧特性隨著發(fā)育逐漸成熟，其最優(yōu)時(shí)間頻率至成年時(shí)達(dá)到最高值［14］。有研究推測(cè)，弱視患者之所以對(duì)高時(shí)間頻率視覺(jué)刺激的敏感性下降，可能原因是視覺(jué)系統(tǒng)對(duì)視覺(jué)信息的傳遞和整合存在缺陷［15］。功能性磁共振研究也發(fā)現(xiàn)，弱視患者對(duì)視覺(jué)信息的處理能力受損［16］，并且可能存在相關(guān)視皮層區(qū)域的神經(jīng)解剖學(xué)損害［17］。Yang等［6］通過(guò)心理物理學(xué)研究認(rèn)為，弱視患者存在時(shí)間頻率甄別缺陷。然而，目前尚鮮見(jiàn)有關(guān)弱視的時(shí)間信息整合能力缺陷的神經(jīng)回路和細(xì)胞分子機(jī)制及干預(yù)策略的深入研究，迫切需要在整體動(dòng)物水平建立可客觀評(píng)估的模型。PVEP是一種客觀評(píng)估整體視功能的技術(shù)手段。小鼠是廣泛應(yīng)用于眼科與視覺(jué)科學(xué)研究的模式動(dòng)物，其飼養(yǎng)簡(jiǎn)單、成本較低，且有大量以C57品系為背景的轉(zhuǎn)基因小鼠可供深入開(kāi)展相關(guān)機(jī)制的研究。然而，由于小鼠的PVEP記錄難度較高，以小鼠為模型動(dòng)物開(kāi)展的有關(guān)弱視時(shí)間信息整合能力缺陷的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用基于腦表面埋置電極記錄［9］的方法探討了MD小鼠PVEP的時(shí)間頻率調(diào)制的變化，揭示了MD組小鼠的時(shí)間頻率調(diào)制曲線表現(xiàn)為低通特性，其在高時(shí)間頻率刺激條件下的反應(yīng)顯著低于中低時(shí)間頻率刺激條件。與對(duì)照組相比，高時(shí)間頻率視覺(jué)刺激條件下，MD組反應(yīng)顯著降低，而在中低時(shí)間頻率刺激條件下，MD組視覺(jué)反應(yīng)的損害未受到明顯影響。筆者推測(cè)MD小鼠視皮層神經(jīng)元對(duì)于高時(shí)間頻率的視覺(jué)信息的加工整合和分析能力降低，造成視覺(jué)神經(jīng)元的反應(yīng)受到抑制。

另外，在本研究中，對(duì)照組小鼠對(duì)6種時(shí)間頻率的PVEP P100波反應(yīng)幅值無(wú)顯著差異，其時(shí)間頻率調(diào)制曲線基本表現(xiàn)為全通特性，但是在1.25 Hz和0.50 Hz處存在幅度較小的2個(gè)峰。既往研究發(fā)現(xiàn)，采用掃描VEP可記錄到雙峰現(xiàn)象［18-19］。這種雙峰是視覺(jué)信息在2個(gè)平行通道，即瞬態(tài)通道和持續(xù)通道交互作用的結(jié)果，2個(gè)通道具有不同的空間和時(shí)間處理能力。已知在視覺(jué)系統(tǒng)中存在2條主要的攜帶視覺(jué)信息的傳導(dǎo)通路，即大細(xì)胞通路和小細(xì)胞通路。大細(xì)胞通路主要攜帶高時(shí)間頻率和低空間頻率的視覺(jué)信息，小細(xì)胞通路主要攜帶高空間頻率和低時(shí)間頻率的視覺(jué)信息［20］。2種細(xì)胞通路將視覺(jué)信息從視網(wǎng)膜傳輸?shù)揭暺?。本研究發(fā)現(xiàn)，MD組時(shí)間頻率調(diào)制曲線既未出現(xiàn)雙峰，也未在低空間頻率段出現(xiàn)單峰，且在高時(shí)間頻率段PVEP反應(yīng)較對(duì)照組明顯降低，提示在MD組小鼠兩條通路的時(shí)間信息加工能力均存在損害，但以大細(xì)胞通路的時(shí)間信息加工功能受損更為明顯。