間充質(zhì)干細胞來源外泌體治療骨關(guān)節(jié)炎的研究進展

劉文彬

軟骨組織是一種具有彈性的結(jié)締組織，由透明質(zhì)酸、膠原纖維、蛋白多糖和軟骨細胞組成。軟骨組織無血管及神經(jīng)結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)特征往往限制了軟骨中氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的充足供應(yīng)，從而限制了受損軟骨組織的有效再生[1-2]。因此軟骨組織在創(chuàng)傷、持續(xù)負重后易發(fā)生骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis, OA）[3-4]。目前，OA的發(fā)病機制尚不明確。因此，針對OA的治療尚無有效的治療手段。目前，OA的治療方法主要包括：關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)、截骨畸形矯正術(shù)、單髁表面置換術(shù)和全膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)。這些手段往往存在外源植入物感染、植入物或組織替代物壽命短、需要二次手術(shù)、新形成組織與天然軟骨界面不一致等缺點[5]。要克服這些限制，最近有研究通過使用間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell, MSC）或軟骨細胞移植到受損的軟骨部位可以達到修復(fù)軟骨缺損的效果[6]。MSC可以從不同的組織如外周血、骨髓、脂肪中提取到，具有低成本、易獲得、免疫抑制能力低等優(yōu)點[7-8]。然而，骨髓間充質(zhì)干細胞移植在制備細胞來源方面也存在以下技術(shù)缺陷：1）供體部位的并發(fā)癥不容忽視；2）細胞擴張需要一定的時間；3）培養(yǎng)細胞時會存在去分化不良；4）供體年齡較大時，獲得的細胞的內(nèi)在活性和功能降低；5）大規(guī)模細胞生產(chǎn)的質(zhì)量控制不一致。

最新研究利用來自MSC的外泌體以取代傳統(tǒng)的細胞為基礎(chǔ)的OA治療可以避免MSC移植的缺點。外泌體是直徑為30～150 nm的細胞囊泡，外泌體作為生物信號系統(tǒng)，其攜帶的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和RNA參與細胞間的多種生物學(xué)過程[9]。特別是MSC來源的外泌體不僅具有免疫調(diào)節(jié)和組織再生能力，而且還表現(xiàn)出一定的免疫治療優(yōu)勢[10]。此外，MSC來源的外泌體可避免肺栓塞等相關(guān)并發(fā)癥[11]。同時，MSC的細胞治療有可能在分化過程中形成腫瘤，但是MSC來源的外泌體本身不具有代謝功能，因此不具有致瘤性?；贛SC來源的外泌體的特點，近年來，一系列研究探討了MSC來源的外泌體對皮膚[12]、心臟[13]、骨[14]和軟骨等[15]組織再生的療效。特別是外源性MSC來源外泌體可作為增強軟骨組織再生，有效治療軟骨組織缺損。本文就以下3個方面進行綜述：1）利用MSC來源的外泌體治療OA的研究進展；2）外泌體中miRNA的研究進展；3）外泌體組織工程支架的設(shè)計和應(yīng)用。

1 MSC來源的外泌體治療OA

最近的研究表明，移植MSC后產(chǎn)生的各種旁分泌信號可誘導(dǎo)軟骨組織再生。在這一組織愈合過程中，外泌體是細胞間通信的重要介質(zhì)。MSC來源的外泌體的治療功能之一是抗炎。在OA發(fā)生過程中，促炎介質(zhì)分泌水平升高，細胞外基質(zhì)降解以及軟骨細胞凋亡。由于炎癥與OA的進展密切相關(guān)，MSC來源的外泌體的抗炎作用可用于OA的治療。脂肪來源MSC可以通過抗炎作用發(fā)揮軟骨保護作用。脂肪來源MSC的外泌體可減少OA軟骨細胞中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10等炎性因子的產(chǎn)生。此外，環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）[16]和前列腺素E1（prostaglandin E1，PGE1）的表達水平下調(diào)，最終導(dǎo)致前列腺素 E2（prostaglandin E2， PGE2）的產(chǎn)生減少[17]。此外，脂肪來源MSC的外泌體可以抑制軟骨細胞核因子（NF）-κB信號通路的激活，因此發(fā)揮抗炎作用。研究表明，BMSC來源的細胞外囊泡（BMSC-EV）可以抑制炎癥介質(zhì)對軟骨穩(wěn)態(tài)的細胞的破壞，也可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的OA患者軟骨細胞的炎癥作用。BMSC-EV處理后可以明顯降低COX-2和IL-1、IL-6、IL-8和IL-1這些炎癥介質(zhì)的表達。相反，MSC來源外泌體可降低膠原酶活性，促進軟骨細胞增殖和糖胺聚糖沉積。Cosenza等[18]研究了MSC來源外泌體對OA小鼠軟骨降解的保護作用。結(jié)果提示，MSC來源外泌體可以通過逆轉(zhuǎn)IL-1β處理軟骨細胞后的軟骨基質(zhì)降解。

MSC來源外泌體除了可以減輕軟骨細胞炎癥反應(yīng)之外，同樣可以調(diào)節(jié)軟骨細胞凋亡和巨噬細胞活性。比如，Cosenza等[18]研究了MSC來源外泌體對OA大鼠軟骨降解的保護作用。作者發(fā)現(xiàn)MSC來源外泌體可以明顯降低IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞的凋亡。另外MSC來源外泌體可以降低F4/80巨噬細胞CD86、MHCII以及CD40的表達量。同樣的，當(dāng)MSC與巨噬細胞共培養(yǎng)時，能夠減少M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化[19]。而且在膠原酶誘導(dǎo)的OA模型中，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSC來源外泌體可以明顯提高軟骨的體積，軟骨表面體積比以及厚度。Zhang等[20]從胚胎來源的間充質(zhì)干細胞中獲得外泌體，并利用此外泌體探討了對關(guān)節(jié)炎軟骨再生的影響。在這項研究中，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）來源外泌體用于治療臨界軟骨缺損，發(fā)現(xiàn)在術(shù)后12周時，ESC來源外泌體可以明顯促進II型膠原（collagen type II alpha 1，COL2A1）的表達。ESC來源外泌體對軟骨修復(fù)的主要機制如下：1）促進軟骨細胞增殖；2）降低軟骨細胞凋亡；3）減少炎性細胞因子的水平；4）提高M2巨噬細胞浸潤；5）調(diào)制免疫表型和反應(yīng)[21]。此項研究還發(fā)現(xiàn)，ESC來源外泌體可增加AKT和ERK磷酸化進而介導(dǎo)軟骨組織的修復(fù)和再生。此外，ESC來源外泌體還可用于顳下頜關(guān)節(jié)OA的治療。本研究還表明，可以通過調(diào)節(jié)AKT、ERK和AMPK信號，通過減輕炎癥和恢復(fù)軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)來減輕顳下頜關(guān)節(jié)OA。

在動物實驗中，當(dāng)AMPK不足時，OA的發(fā)展加速[22]。ESC來源外泌體通過抑制了基質(zhì)金屬酶13 （matrix metallopeptidase，MMP13）和一氧化氮（nitric oxide，NO）的產(chǎn)生，并能防止顳下頜關(guān)節(jié)OA大鼠的細胞損傷、凋亡、線粒體功能障礙和基質(zhì)降解。

2 使用MSC外泌體中包含的miRNA治療OA

外泌體包含了蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和RNA等多種物質(zhì)。之前研究證明，外泌體中miR-92a-3p可以通過靶向WNT5A的表達，增強軟骨形成并抑制軟骨降解，而WNT5A在軟骨形成的晚期可以激活MMPs，減少軟骨ECM的降解[23]。在其他研究中也發(fā)現(xiàn)，miR-92a-3p同樣可以增強軟骨形成能力[24]。將miR-92a-3p注射到OA小鼠模型后，發(fā)現(xiàn)miR-92a-3p能抑制軟骨的降解[25]。

miR-140-5p同樣可以促進軟骨組織再生，延緩OA的進展[26]。Tao等[27]將來源于人類滑膜間充質(zhì)干細胞的外泌體和過表達miR-140-5p過表達的人類滑膜間充質(zhì)干細胞的外泌體用于治療大鼠OA。人滑膜間充質(zhì)干細胞來源的外泌體能刺激軟骨細胞的遷移和增殖。但是人滑膜間充質(zhì)干細胞來源的外泌體抑制ECM的合成。為了克服人類滑膜間充質(zhì)干細胞來源外泌體的這一缺陷，通過慢病毒轉(zhuǎn)染使miR-140-5p在人類滑膜間充質(zhì)干細胞中高表達，發(fā)揮miR-140-5p促ECM合成的作用可以有效避免人類滑膜間充質(zhì)干細胞來源外泌體的缺陷。此外，外源性給予轉(zhuǎn)化生長因子 -β（transforming growth factor，TGF-β）生長因子可刺激外泌體miRNA在間充質(zhì)干細胞中的表達。已有研究表明，TGF-β可通過下調(diào)特異性蛋白1（special protein，SP1），增強MSC來源外泌體中miR-135b的表達，促進軟骨細胞增殖。miR-135b可以通過與SP1的3’-UTR位點反應(yīng)調(diào)節(jié)SP1的活性[28]。其他報道也發(fā)現(xiàn)SP1是miR-140維持軟骨細胞增殖的靶點[29]。髕下脂肪墊間質(zhì)干細胞的外泌體可通過抑制mTOR信號通路提高軟骨細胞自噬水平[30-31]，緩解IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡。

3 外泌體傳遞功能支架的開發(fā)

將外泌體用于軟骨再生的過程中，只需將外泌體溶解至PBS或生理鹽水中，然后將制備好的懸浮液局部注射到軟骨缺損部位。但是注射外泌體在軟骨缺損的局部保留是困難的，注射后會發(fā)生彌散。為了更好維持外泌體在缺損局部的濃度，組織工程技術(shù)如水凝膠和支架可以有效地解決外泌體應(yīng)用的不足。組織工程技術(shù)可增加外泌體在局部缺陷部位的存留時間，并可持續(xù)促進軟骨缺損的修復(fù)。既往研究提示原位水凝膠膠可以用于外源性外泌體的靶向傳遞。這種水凝膠膠的優(yōu)點是：1）軟骨缺損修復(fù)的原位凝膠可以提供形態(tài)缺陷特異性；2）有效保留外泌體的各項生物學(xué)特征；3）水凝膠材料與天然軟骨組織的結(jié)合緊密；4）水凝膠內(nèi)的信號分子可以進行動態(tài)交換[32]。亞胺介導(dǎo)的鄰硝基芐醇基（HA-NB）光交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠可以實現(xiàn)原位凝膠化[33-34]。作為一種有效的外泌體儲液體，初始加入的外泌體在HA-NB水凝膠中可以保留14 d，外泌體的釋放率約為每天1×1010/mL[35]。釋放的外泌體可以內(nèi)化并協(xié)同包裹凝膠中的軟骨細胞和MSC。為了評價外泌體復(fù)合HA-NB水凝膠的體內(nèi)修復(fù)效果，將含有1×1011/mL外泌體的原位形成凝膠填充在兔膝關(guān)節(jié)股骨髁中全層骨軟骨缺損（直徑4 mm，深度3 mm）中。組織學(xué)分析顯示，外泌體復(fù)合HA-NB水凝膠改善了細胞向凝膠中的遷移，使新形成的軟骨組織與已有的組織融合，有效誘導(dǎo)軟骨再生。

有研究應(yīng)用3D打印的甲基丙烯酸明膠/軟骨ECM/外泌體支架同樣可以達到良好的軟骨缺損修復(fù)效果[36]。外泌體和ECM成分的結(jié)合協(xié)同增強了3D打印復(fù)合支架的成軟骨能力。另外取向的支架通道及其可控結(jié)構(gòu)可以促進支架內(nèi)細胞生長以及營養(yǎng)物質(zhì)。與未處理對照組和只使用凝膠組相比，包覆外泌體的生物支持除了結(jié)構(gòu)上的優(yōu)勢外，還表現(xiàn)為體內(nèi)M2巨噬細胞極化，線粒體功能障礙恢復(fù)以及軟骨再生。

4 總結(jié)

近年來，MSC來源外泌體在科研領(lǐng)域已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，由于其便于獲取及操作，MSC來源外泌體在治療應(yīng)用中具有巨大的潛力。相比于MSC的全細胞療法，MSC來源外泌體有良好的耐受性，并且免疫原性的不良反應(yīng)風(fēng)險更低，盡管已有研究證實MSC來源外泌體是安全有效的，但是MSC來源外泌體應(yīng)用在臨床治療中還需要對其生物發(fā)生、藥代動力學(xué)和生物分布機制等進一步深入探究。外泌體參與細胞之間的信息傳遞，對軟骨細胞的凋亡、細胞外基質(zhì)降解以及炎癥反應(yīng)等過程發(fā)揮重要作用。隨著對MSC來源外泌體研究的深入，以及對外泌體提取、分離和藥物裝載方法的完善與提高，外泌體對軟骨再生的靶向治療，可能在未來OA治療中發(fā)揮重要作用。