長鏈非編碼RNA在肝癌診斷中的作用

徐 魯 馮家立 沈 昕

湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 (湖北 武漢， 430000)

近年來肝細(xì)胞癌(HCC)在世界范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢，WHO認(rèn)為肝癌給中國帶來的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)在所有腫瘤中排名第一[1]。HCC目前主要的有效治療方式是手術(shù)切除和肝移植。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，HCC患者的生存質(zhì)量日益提高，但術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)仍然嚴(yán)重影響HCC患者的預(yù)后。HCC病程進(jìn)展快且預(yù)后差，患者確診時(shí)多為中晚期，失去了治療的最佳時(shí)機(jī)，因此HCC的早期診斷對(duì)患者的治療和預(yù)后意義重大。甲胎蛋白(AFP)是常用的HCC診斷標(biāo)志物之一，研究顯示約50%的HCC患者血清中可檢測到AFP，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AFP在部分患者中并不升高[2]。因此，AFP對(duì)于HCC的診斷有一定的漏診，尋找HCC的新型標(biāo)志物對(duì)提高HCC診斷的靈敏度和特異性意義重大。近年來長鏈非編碼RNA(lncRNA)受到越來越多的關(guān)注，本文就lncRNA的功能以及在HCC診斷中的作用做一綜述。

1 lncRNA簡介

1.1 lncRNA的來源與分類 lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度為200 nt～100 kb的無編碼功能的RNA分子。lncRNA起初被認(rèn)為是一種幾乎沒有功能的轉(zhuǎn)錄序列[3]，然而隨后的研究揭示了lncRNA在各種細(xì)胞過程中的重要作用，包括參與基因的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染和染色體重塑等功能[4,5]。目前根據(jù)lncRNA與mRNA的相似性，推測lncRNA的可能來源如下。①編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因由于開放讀碼框架(ORF)突變導(dǎo)致核苷酸序列斷裂；②染色質(zhì)重排；③非編碼基因轉(zhuǎn)錄；④基因中插入一個(gè)轉(zhuǎn)座成分而產(chǎn)生；⑤lncRNA部分序列重復(fù)形成[6,7]。根據(jù)編碼基因在基因組中的位置，lncRNA可分為正義、反義、雙向、基因間及基因內(nèi)5大類型。

1.2 lncRNA的功能 lncRNA的調(diào)控功能主要通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)分子相互作用來實(shí)現(xiàn)。在細(xì)胞內(nèi)，lncRNA通過廣泛調(diào)節(jié)DNA甲基化、組蛋白修飾和染色體重構(gòu)從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。DNA甲基化被證明與許多腫瘤的發(fā)生相關(guān)，許多抑癌基因的啟動(dòng)子CPG島發(fā)生甲基化后，使得抑癌基因無法轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[8]。真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程需要多種蛋白因子的輔助，轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶Ⅱ形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過程。lncRNA通過一系列的順式調(diào)節(jié)和反式作用來影響DNA信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯。Yang等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PRNCR 1和PCGEM 1與前列腺癌細(xì)胞表面雄激素受體結(jié)合增強(qiáng)配體依賴和非配體依賴的雄激素受體激活通路從而導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞增殖。lncRNA還可與靶mRNA序列互補(bǔ)配對(duì)，從而影響mRNA的拼接、編輯、運(yùn)輸、翻譯和降解過程[10]。

在腫瘤細(xì)胞中，lncRNA可維持細(xì)胞的生長與增殖，促進(jìn)轉(zhuǎn)移和腫瘤的侵襲，誘導(dǎo)血管的形成，抑制細(xì)胞的凋亡，還可影響腫瘤的代謝。研究顯示，腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移以及血管形成的過程通常伴隨著lncRNA表達(dá)的改變，這說明lncRNA可以通過調(diào)控這些過程進(jìn)而影響腫瘤的代謝變化[11]。

2 lncRNA與肝癌

2.1 與肝癌細(xì)胞增殖相關(guān)的lncRNA 肝癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本(HULC)位于染色體6p24.3， HULC的表達(dá)可以影響腫瘤抑制基因p18啟動(dòng)子的活性，并影響p18蛋白的表達(dá)，從而影響p18抑制細(xì)胞過度生長，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[12]。URHC通過調(diào)控ZAK蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，研究發(fā)現(xiàn)URHC與預(yù)后不良相關(guān)[13]。有研究發(fā)現(xiàn)有56種超保守RNA(ucRNA)在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)異常，其中uc.338在肝癌組織中表達(dá)升高[14]。

2.2 與肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)的lncRNA 母本印跡表達(dá)基因3(MEG3)在4種肝癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，RNA原位雜交顯示在肝癌組織中MEG3雜交信號(hào)弱或缺失，而在正常肝組織中信號(hào)強(qiáng)烈，MEG3抑制細(xì)胞增殖、與肝癌細(xì)胞的凋亡有相關(guān)性[15]。uc002mbe.2對(duì)組蛋白去乙酰酶抑制劑曲古抑菌素A(TSA)介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞系中uc002mbe.2的表達(dá)低于正常肝臟細(xì)胞系[16]。

2.3 與肝癌預(yù)后和轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA lncRNA MVIH與血管形成有關(guān)，新生血管形成利于癌細(xì)胞生存，且方便癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，lncRNA MVIH在肝癌中高表達(dá)，與患者的生存率低密切相關(guān)[16]。lncRNA ATB在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，lncRNA ATB與微血管和大血管的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，lncRNA ATB與miR-200家族結(jié)合使miR-200家族對(duì)基因ZEB1、ZEB2的抑制作用變?nèi)?，?dǎo)致ZEB1蛋白和ZEB2蛋白的表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而使腫瘤細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)[17]。lncRNA LET在肝癌患者肝組織中表達(dá)下調(diào)與腫瘤的微轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性[18]。lncRNA HOTAIR 高表達(dá)的患者易淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增高、影響生存率[19]。

2.4 與HBV感染相關(guān)的lnc RNA lncRNA HEIH(lncRNA high expression in HCC)對(duì)HBV相關(guān)的肝癌進(jìn)展有作用，在肝癌組織中表達(dá)高于非癌肝組織，表達(dá)HEIH高的患者預(yù)后比表達(dá)HEIH低的患者差，HEIH高表達(dá)與肝癌復(fù)發(fā)的相關(guān)性高，HEIH可作為評(píng)判肝癌患者生存率的預(yù)后指標(biāo)[20]。lncRNA Dreh高表達(dá)組的復(fù)發(fā)率比低表達(dá)組的復(fù)發(fā)率低，生存期延長明顯，Dreh與肝癌患者預(yù)后有相關(guān)性[21]。

2.5 與肝癌耐藥相關(guān)的lncRNA lncRNA H19可以誘導(dǎo)P-糖蛋白的表達(dá)引起MDRI相關(guān)的耐藥[22]。lncRNA CUDR在肝癌細(xì)胞系HepG2中高表達(dá)，由CUDR基因編碼且與化療藥物的耐藥有相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)CUDR表達(dá)的下調(diào)使得腫瘤細(xì)胞易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥[23]。

3 lncRNA在肝癌診斷與預(yù)后中的應(yīng)用

肝癌的預(yù)后與癌癥的臨床分期息息相關(guān)，提高肝癌的早期診斷率可以降低肝癌的死亡率，改善患者的預(yù)后。大多數(shù)早期肝癌沒有明顯的臨床癥狀，當(dāng)發(fā)現(xiàn)臨床癥狀時(shí)，腫瘤細(xì)胞往往已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或侵犯周圍組織，臨床預(yù)后往往很差，患者生存率較低?；谀壳暗脑\斷手段，早期肝癌的診斷率并不高。早期較小的腫瘤病灶一般的影像學(xué)手段往往無法發(fā)現(xiàn)。研究表明，在早期肝癌患者中，只有10%～20%的患者出現(xiàn)AFP異常[24,25]。在2011年歐洲肝病協(xié)會(huì)發(fā)布的臨床指南中不再使用AFP作為診斷指標(biāo)[26]。近年來雖然有一些新的肝癌診斷指標(biāo)應(yīng)用于臨床，如異常凝血酶原(DCP)，提高了肝癌的診斷效果，但是這些標(biāo)志物也存著一定的局限性。隨著lncRNA研究特別是lncRNA與肝癌關(guān)系的研究的進(jìn)展，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)可用于肝癌的診斷。

3.1 單一lncRNA應(yīng)用于肝癌的診斷 單一的lncRNA應(yīng)用于肝癌的診斷表現(xiàn)出較高的診斷效能。多位研究者發(fā)現(xiàn)UCA1在診斷肝癌中有較高的診斷效能。Zheng等[27]的一項(xiàng)包含105例HCC患者、105名健康志愿者以及105例良性肝病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，但選擇UCA1截?cái)嘀禐?.85時(shí)在健康人群和HCC患者中鑒別出HCC患者的靈敏度為73.3%，特異性為99.0%，ROC曲線下面積為0.902，這說明UCA1在肝癌的篩查中具有較高的特異性。研究還發(fā)現(xiàn)在區(qū)分良性肝病和HCC患者時(shí)，UCA1同樣也表現(xiàn)出較好的診斷效能。EL-Tawdi等[28]的研究也得出了類似的結(jié)論，值得注意的是EL-Tawdi還研究了UCA1應(yīng)用于區(qū)分慢性丙型肝炎患者和HCC患者時(shí)的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)UCA1也具有較高的診斷效能(AUC=0.838)。Wang等[29]對(duì)lncRNA GAS5-AS1的研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的GAS5-AS1與肝癌的發(fā)生相關(guān)，并表現(xiàn)出作為肝癌診斷標(biāo)志物的潛力，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)GAS5-AS1在區(qū)分HCC與肝硬化方面具有較高的準(zhǔn)確度(AUC=0.824)，當(dāng)區(qū)分AFP<200 ng/ml 的HCC病例與AFP<200 ng/ml的肝硬化病例以及區(qū)分AFP<200 ng/ml 的HCC病例和乙型肝炎病例時(shí)，GAS5-AS1具有較高的靈敏度(分別為89.5%和89.5%)，表明GAS5-AS1可能是HCC的潛在診斷標(biāo)志物。此外，還有許多學(xué)者研究了其他lncRNA作為肝癌診斷標(biāo)志物的可能，例如MALAT1、SHNG1、Lnc-PCDH9-13∶1，這些lncRNA都表現(xiàn)出較好的診斷價(jià)值[30-32]。值得一提的是，Xie等[31]的研究樣本為唾液，發(fā)現(xiàn)唾液中的Lnc-PCDH9-13:1在區(qū)分HCC患者和健康人群具有較高的特異性和AUC面積(特異性為98%，AUC=0.898)。唾液標(biāo)本留取簡單，值得進(jìn)一步研究。

3.2 多種lncRNA聯(lián)合檢測應(yīng)用于肝癌的診斷 有些lncRNA單獨(dú)應(yīng)用于肝癌的診斷時(shí)，其診斷效能表現(xiàn)不夠出色，但多種lncRNA聯(lián)合檢測往往可以提高診斷效能。包含3種血漿lncRNA的組合(LINC00152、RP11-160H22.5和XLOC014172)可能是區(qū)分HCC患者和健康人群以及慢性肝炎患者的指標(biāo)[33]。另一項(xiàng)研究使用了血漿RP11-160H22.5、XLOC_014172、LOC149086作為lncRNA組合，這項(xiàng)研究包含147例HCC患者和180例健康人員，但選擇7.449為截?cái)嘀禃r(shí)ROC曲線下面積最大(AUC=0.896)，診斷特異性為82%，靈敏度為73%，具有較好的診斷效能[34]。Wang等[35]選擇測定血清uc001ncr和AX800134作為lncRNA組合，在區(qū)分早期乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌(BCLC分級(jí)別為0+A)和乙型肝炎患者以及健康人群表現(xiàn)出極高的診斷價(jià)值，靈敏度為81.08%，特異性為90.91%，ROC曲線下面積為0.9564，但其研究的早期肝癌患者數(shù)量較少，結(jié)果的準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

3.3 lncRNA聯(lián)合AFP或者其他指標(biāo)檢測應(yīng)用于肝癌的診斷Konishi等[30]在同一病例組和對(duì)照組中分別評(píng)估了血漿lncRNA MALAT1、AFP、維生素K缺乏誘導(dǎo)蛋白Ⅱ(PIVKAⅡ)以及三者聯(lián)合使用時(shí)區(qū)分HCC患者和肝病患者的診斷效能發(fā)現(xiàn)，當(dāng)三者聯(lián)合使用時(shí)靈敏度特異性明顯提高。同樣的研究結(jié)論也出現(xiàn)在Xu等[36]的研究中，當(dāng)ENSG00000258332.1、LINC00635、AFP聯(lián)合使用時(shí)達(dá)到最大的靈敏度特異性。Wang等[29]發(fā)現(xiàn)血清lncRNA LRB1聯(lián)合異常凝血酶原(DCP)與LRB1聯(lián)合AFP相比在區(qū)分HCC患者和健康人群是具有更高的靈敏度特異性和ROC曲線下面積，但三者聯(lián)用的診斷效能更高；三者同時(shí)聯(lián)用時(shí)，區(qū)分早期HCC患者(TNM分級(jí)為Ⅰ～Ⅱ級(jí))和健康人群相較于區(qū)分HCC和健康人群具有更高的診斷效能，這表明聯(lián)合檢測LRB1、AFP和DCP更加有助于早期肝癌的發(fā)現(xiàn)。

3.4 lncRNA與肝癌的預(yù)后 雖然lncRNA被人們熟知并進(jìn)行深入研究的時(shí)間不長，但已有很多研究發(fā)現(xiàn)lncRNA與肝癌患者的預(yù)后相關(guān)。Wang等[37]的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，采用lncRNA表達(dá)芯片和逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)分析檢測326例HCC患者和73例健康志愿者LRB1的表達(dá)水平，分析LRB1表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果表明，與健康志愿者相比，HCC患者血清LRB1水平顯著升高。血清LRB1水平與甲胎蛋白表達(dá)、腫瘤大小、腫瘤分期和靜脈侵襲呈正相關(guān)，與總生存呈負(fù)相關(guān)。Zeng等[38]的研究發(fā)現(xiàn)，lncDQ在HCC組織樣本和血清中均上調(diào)，并且與低存活率和不利的臨床病理特征相關(guān)。多變量分析表明lncDQ表達(dá)是HCC的獨(dú)立預(yù)后因素。Ma等[39]的一項(xiàng)研究通過定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR(qRT-PCR)評(píng)估68個(gè)HCC組織和鄰近正常組織中的JPX和XIST表達(dá)，分析了它們與病理特征和總體存活率的關(guān)系。結(jié)果表明，JPX和XIST水平在HCC中顯著降低，并且與組織學(xué)分級(jí)和腫瘤TNM分期相關(guān)。低JPX和XIST表達(dá)導(dǎo)致HCC的總體存活率顯著降低。多變量回歸分析表明，JPX / XIST表達(dá)水平是HCC總體存活率的獨(dú)立預(yù)后因素。

4 小結(jié)與展望

盡管lncRNA在肝癌診斷中表現(xiàn)出令人振奮的結(jié)果，但是也存在著許多問題。lncRNA的研究正處于起步階段，其作用機(jī)制尚不清楚。另外，lncRNA的作用靶點(diǎn)眾多，完整闡明某個(gè)lncRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)較為困難。lncRNA的研究目前較為分散，尚未有特定的lncRNA與肝癌相關(guān)性的系統(tǒng)研究。雖然，有研究報(bào)道了lncRNA在肝癌診斷中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，但是這些lncRNA應(yīng)用于臨床還需要更多的研究。在lncRNA對(duì)肝癌患者的預(yù)后方面，盡管多數(shù)研究都發(fā)現(xiàn)lncRNA的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)與肝癌的預(yù)后相關(guān)，但這些lncRNA是如何影響肝癌的預(yù)后并不十分清楚。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，lncRNA作為疾病的診斷預(yù)后標(biāo)志物是大勢所趨，高通量的測序方法以及非侵入性的檢測手段也需要在今后的研究中發(fā)現(xiàn)。