閉塞性細(xì)支氣管炎動物模型研究進(jìn)展

張冰雪，宋桂華，張巖

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 兒科，河南 鄭州 450000)

閉塞性細(xì)支氣管炎(bronchiolitis obliterans，BO)以小氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及纖維化收縮，致使氣道管腔狹窄或閉塞為主要病理學(xué)表現(xiàn)[1]，是嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)慢性疾病。該病可能發(fā)生于器官移植(肺移植、骨髓移植等)后，嚴(yán)重的感染性疾病或者在吸入有毒物質(zhì)或結(jié)締組織疾病后也可能出現(xiàn)[2]。其臨床癥狀以反復(fù)的咳嗽、咯痰、持續(xù)喘息、氣促或呼吸困難，運(yùn)動耐力下降為主要表現(xiàn)。BO根據(jù)不同的病理表現(xiàn)類型可分為限制性細(xì)支氣管炎及增殖性細(xì)支氣管炎，前者以細(xì)支氣管管壁周圍纖維化和瘢痕收縮引起管腔扭曲和縮窄為特征性改變，后者特點是息肉狀的肉芽組織阻塞氣道管腔。BO病因復(fù)雜多，見于移植后、感染、有毒物質(zhì)吸入、藥物誘發(fā)以及結(jié)締組織病等。遺憾的是，針對BO的治療，尤其是對肺功能的改善尚無特效手段，BO缺乏干預(yù)和治療策略的部分原因可歸于用以研究疾病發(fā)展的動物模型的有限可用性，理想的動物模型在了解疾病的復(fù)雜病理生理學(xué)并制定新的預(yù)防和治療策略的過程中起著至關(guān)重要的作用。目前的動物模型的構(gòu)建多以氣管或肺移植方法為主，除此外，以化學(xué)損傷、病毒感染等方法構(gòu)建BO動物模型的方法也有報道[3-5]。本文就近年來文獻(xiàn)中BO模型的研究進(jìn)展進(jìn)行簡要總結(jié)，以供實驗研究參考。

1 移植模型

1.1 肺移植

1.1.1原位肺移植 原位肺移植模型首次報道見于1971年[6]，此后便有學(xué)者將肺移植模型用以BO的研究，De Vleeschauwer等[7]發(fā)現(xiàn)，肺移植后2周表現(xiàn)出在血管和氣道周圍的急性排斥，在4～12周內(nèi)，在25%～50%的小鼠中觀察到BO病變，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤、管腔狹窄或閉塞。原位肺移植模型的優(yōu)勢在于，該方式更接近人體的正常生理狀態(tài)，是最符合BO發(fā)生機(jī)制的實驗動物模型，但將該模型用于BO研究時所面臨的主要挑戰(zhàn)除急性排斥反應(yīng)外，肺移植過程對操作者手術(shù)和顯微外科操作技術(shù)有較高的要求，其關(guān)鍵和難點在于需在顯微鏡下分別吻合肺動脈和肺靜脈。盡管有研究通過對套管吻合局部操作的改良，簡化手術(shù)步驟[8]，但除外手術(shù)因素，肺移植術(shù)后受體動物的死亡率高，形成病理改變周期長等因素也限制了該造模方式的推廣。

1.1.2異位肺移植 嚙齒動物異位肺移植尚無成功建立BO模型的報道，盡管Hertz、Xavier-elsas等[9-10]構(gòu)建小鼠異位肺移植動物模型，但是異體供肺在植入受體后短期內(nèi)迅速發(fā)生壞死。Salminen等[11]進(jìn)行大型動物豬的BO模型研究，將豬的終末細(xì)支氣管及周圍肺組織植入皮下，1～3周植物病理出現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞脫落、支氣管管腔狹窄、管壁纖維化、軟骨環(huán)變性以及單個核細(xì)胞浸潤聚集等變化。該模型的優(yōu)點在于手術(shù)操作簡單，能夠?qū)⒁浦参锒辔稽c植入，但缺點在于，大型動物的飼養(yǎng)成本高，手術(shù)復(fù)雜，故異位肺移植BO模型的實用性及可重復(fù)性不高。

1.2 氣管移植

1.2.1原位氣管移植 相對于原位肺移植，嚙齒類動物氣管原位移植模型是比較常用的BO模型之一。首個小鼠原位氣管移植模型是Genden等[12]在2002公開報道，但模型建立過程需要手術(shù)顯微鏡，對器械及手術(shù)熟練度要求也較高。王欣等[13]改良?xì)夤芤浦布夹g(shù)，移植后直接用頸部肌肉和腺體包繞氣管，簡化了手術(shù)方式，并且移植后病理顯示黏膜下炎癥細(xì)胞浸潤、氣道上皮逐漸脫落壞死、氣管阻塞率于15、30及60 d逐漸增加，符合閉塞性細(xì)支氣管炎病理學(xué)特點。該模型被廣泛用于研究上皮細(xì)胞再生過程及其在排斥反應(yīng)中的保護(hù)作用，該模型手術(shù)操作過程相對簡單，氣管移植后病變出現(xiàn)早，縮短實驗時間，移植物與外界空氣相通。但同樣存在以下缺陷：移植物未進(jìn)行血管重建所用氣管屬于大氣道，缺乏肺內(nèi)微環(huán)境，并且由于移植后發(fā)生上皮細(xì)胞再生，因此不會出現(xiàn)明顯的管腔纖維化閉塞，很難觀察到典型病變。

1.2.2異位氣管移植 1993年，Hertz等[9]首次建立了異位氣管移植術(shù)后BO動物模型，將供體小鼠的氣管植入受體小鼠的背部皮下，10 d后，移植氣管出現(xiàn)淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤、纖維增生等改變，3周后管腔纖維增生、管腔狹窄、氣道壁和管腔內(nèi)肉芽組織增生。異位氣管移植操作簡單，受體動物死亡率較肺移植及原位氣管移植下降，然而，移植氣管通常為較大氣道，而BO多發(fā)生于終末細(xì)支氣管，且移植氣管無通氣換氣功能，氣道不能完成清除功能，不符合人體氣管的生理需求。Dutly等[14]提出了一種新型的動物模型，其中供體氣管被植入到受體動物的肺實質(zhì)中，盡管該方法比植入皮下更具技術(shù)挑戰(zhàn)性，但其具有幾個重要優(yōu)點，其中一些優(yōu)點是合適的局部環(huán)境，同時也為局部免疫抑制治療提供了可能性。

良好的動物模型對于進(jìn)一步剖析和揭示BO的發(fā)病機(jī)制是必不可少的，雖然已經(jīng)開發(fā)了許多動物模型來研究BO，但到目前為止，這些模型都無真正模仿人類的情況[15]，且傳統(tǒng)的移植模型需要的技術(shù)條件高，操作費時費力，術(shù)中和術(shù)后動物的死亡率高，發(fā)生BO病理改變周期較長，故近年來研究者更傾向于建立非移植的BO動物模型。

2 非移植模型

2.1 二乙酰2002年《新英格蘭雜志》報道一家微波爆米花生產(chǎn)廠工作過的人有嚴(yán)重的BO病例[16]，暴露與結(jié)局之間的關(guān)系表明，他們可能因吸入揮發(fā)性黃油味成分二乙酰而患有職業(yè)性BO，此后便有相關(guān)學(xué)者采用口咽吸入、氣管插管吸入二乙酰等方法構(gòu)建BO模型[17-19]。鄧華蓉等[20]在比較兩種不同建造模型時發(fā)現(xiàn)，無論哪種給藥方式，7 d后實驗動物出現(xiàn)氣道高反應(yīng)，肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞浸潤，肺組織病理切片顯示氣道上皮損傷脫落、氣道管腔閉塞、支氣管周圍和血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤，上皮下大量膠原物質(zhì)沉積，出現(xiàn)類纖維化等改變，但經(jīng)口咽吸入組死亡率相對較高，且同時存在腸道上皮損傷，氣管插管法給予二乙酰成功率更高。丁二酮造模相比較于移植模型，其能明顯縮短BO病變出現(xiàn)的時間，縮短造模時間和成本，且病理表現(xiàn)典型，肺功能與臨床BO結(jié)果相似，是BO模型的一種簡單、快捷、穩(wěn)定的方法。

2.2 硝酸早在1977年，Kleinerman等[21]發(fā)現(xiàn)吸入二氧化氮(NO2)會導(dǎo)致肺部損傷，一次暴露于高濃度的NO25～6 h會產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞增殖，終末呼吸細(xì)支氣管區(qū)域和肺泡出現(xiàn)類似于BO的組織病變。Kubota等[22]利用二氧化氮誘發(fā)大鼠模型，發(fā)現(xiàn)實驗大鼠在體積分?jǐn)?shù)為0.004%的NO2暴露9個月后，支氣管上皮細(xì)胞顯示出典型的增生，18個月時病變進(jìn)一步發(fā)展，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增殖和間質(zhì)組織水腫擴(kuò)展明顯，并在27個月時發(fā)生纖維化。為了縮短病理改變時間，Costa等[23]用硝酸(nitric acid，NA)進(jìn)行誘導(dǎo)，在大鼠氣管內(nèi)滴入5 g·L-1NA，實驗大鼠表現(xiàn)出十分明顯的呼吸費力，活動量明顯減少，稍加活動后呼吸困難更明顯，隨后出現(xiàn)食欲不振，虛弱無力，體質(zhì)量進(jìn)行性下降，毛發(fā)粗糙、無光澤等全身癥狀。研究者在第2、7、14和30天發(fā)現(xiàn)了組織學(xué)損傷，滴入NA的動物出現(xiàn)了一系列細(xì)支氣管病變，包括巨噬細(xì)胞聚集、壞死性細(xì)支氣管炎，支氣管狹窄及管腔肉芽增生等。該模型與BO的組織學(xué)變化呈現(xiàn)相似性，可適用于該領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)和治療實驗研究。

2.3 氯氣氯是一種廣泛使用的有毒化合物，吸入氯會損傷氣道上皮細(xì)胞，導(dǎo)致肺部異常。氯暴露導(dǎo)致纖毛細(xì)胞從氣管上皮脫落，在殘留區(qū)域，上皮細(xì)胞修復(fù)效率低下，導(dǎo)致氣道纖維化[24]。O’Koren等[25]描述了一種氯誘導(dǎo)的BO模型，在這種模型中，小鼠在暴露于氯氣的情況下，10 d內(nèi)出現(xiàn)氣管和大氣道閉塞性病變。其中，暴露后第2天炎癥細(xì)胞浸潤，第5天成纖維細(xì)胞浸潤、膠原蛋白沉積，9～12 d出現(xiàn)致死性氣道阻塞。但是由于上呼吸道內(nèi)氯的吸收將改變對其對下呼吸道的毒性[26]，因此，暴露于低濃度的氯首先會對大氣道造成損傷，而肺泡損害則需要暴露于高濃度的氣體，而這樣的暴露必定會造成同時的廣泛氣道損害。

2.4 硫芥第一次世界大戰(zhàn)和伊朗-伊拉克戰(zhàn)爭中暴露于硫芥子氣的受害者，以及遭受職業(yè)或偶然暴露的受害者，在暴露后的早期階段就出現(xiàn)了呼吸系統(tǒng)癥狀，后期則出現(xiàn)明顯的肺纖維化、閉塞性細(xì)支氣管炎或肺癌等嚴(yán)重的慢性肺疾病[27]?；诹蚪孀託鈱獾赖膿p傷，Malaviya等[28]開發(fā)了一種硫芥子氣毒性的大鼠模型，吸入硫芥子氣蒸氣在暴露后3 d，觀察到近端細(xì)支氣管上皮細(xì)胞水腫和炎癥，以及在肺泡區(qū)炎癥細(xì)胞的蛋白質(zhì)滲出液，28 d出現(xiàn)更強(qiáng)烈的反應(yīng)，包括上皮壞死和細(xì)支氣管遠(yuǎn)端增生、肺泡壁增厚、空泡巨噬細(xì)胞增大和間質(zhì)纖維化。雖然氯氣吸入劑硫芥吸入構(gòu)建的動物模型可以模擬人類吸入損傷性BO，但有毒氣體吸入操作過程對研究者也存在暴露風(fēng)險。

2.5 罌粟堿1995年8月，中國臺灣爆發(fā)了一種與未煮熟野菜守宮木的食用有關(guān)的閉塞性細(xì)支氣管炎[29]。這種植物的罌粟堿含量很高，隨即Lai等[30]試圖通過對大鼠喂食不同劑量的罌粟堿4周證實其對氣道的損傷作用，但遺憾的是，實驗中并未得出閉塞性細(xì)支氣管炎結(jié)局，實驗大鼠支氣管周和血管周外膜的炎癥變化正常或僅有很小的變化。Svetlecic等[31]改變了給藥方式，利用微型滲透泵通過氣管內(nèi)泵入罌粟堿創(chuàng)建大鼠模型，第7天時便觀察到支氣管周圍炎癥、支氣管黏膜損傷以及支氣管周圍膠原蛋白的增加，在28 d后出現(xiàn)了更廣泛的損害，在肺勻漿中觀察到T細(xì)胞生長因子-β和內(nèi)皮型一氧化氮合酶顯著升高。該模型可模擬藥物誘發(fā)BO進(jìn)而探索發(fā)病機(jī)制和診療策略。

3 感染模型

BO兒童中最常見的發(fā)病因素是感染，尤其以3歲前嚴(yán)重的病毒感染密切相關(guān)，30%～60%的感染后閉塞性細(xì)支氣管炎(post-infectious bronchiolitis obliterans PIBO)為腺病毒所致[32]，因此，構(gòu)建腺病毒誘導(dǎo)的PIBO實驗?zāi)Ｐ?，能夠較好地反映病毒感染所致PIBO形成的病理生理過程。Castleman等[33]對比格犬進(jìn)行實驗性接種2型犬腺病毒，并在接種后1～26 d通過病毒學(xué)、組織學(xué)、免疫過氧化物酶和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。接種后15、26 d觀察到結(jié)締組織細(xì)支氣管的部分或完全狹窄。接種后26 d，病毒感染狗的右中葉平均終末細(xì)支氣管橫截面積減少了50%，實驗性腺病毒感染在狗中會引起B(yǎng)O，該實驗?zāi)Ｐ蛯τ谘芯吭缙谏邢俨《疽鸬姆螕p傷可能是有用的。但該模型尚未在嚙齒類動物中得到驗證，大型動物的飼養(yǎng)與操作，增加實驗成本，故可復(fù)制性較差。

4 總結(jié)

動物模型是實驗研究的基礎(chǔ)，雖然近年來隨著學(xué)術(shù)界對本病不斷重視，圍繞BO病因及發(fā)病機(jī)制而建立的動物模型不斷增多，但目前國內(nèi)對BO詳細(xì)的動物模型研究尚未成熟。在造模方式上，移植手術(shù)法更符合BO發(fā)生的機(jī)制，但對操作者技術(shù)要求較高，且移植后實驗動物死亡率較高。既往對于BO的動物模型，曾選用狗、家兔、倉鼠、大鼠、小鼠等。其中，大型動物的優(yōu)勢在于易于對其實施較為復(fù)雜的手術(shù)操作過程，但難于飼養(yǎng)，且不易獲得研究所需的目的抗體。小鼠作為與人類具有高度同源性的哺乳類動物，是生命科學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的實驗動物。在以小鼠為對象的非移植模型中，氣管給藥更加符合誤吸、誤食等BO發(fā)病過程，但操作難度較大；霧化更符合人體感染的天然途徑，且操作簡單，故其可作為感染后BO和某些揮發(fā)性物質(zhì)吸入導(dǎo)致的BO的模型制備方式。對于研究者說，最重要的問題不是證明哪種模型是最好的，而是哪種是最合適的模型來檢驗研究者的科學(xué)假設(shè)。因此，充分發(fā)掘利用動物模型，并不斷完善構(gòu)建BO模型，對疾病的發(fā)病機(jī)制及治療方法探索都具有重要意義。