雄激素1,4-雄烯二酮和雄烯二酮對斑馬魚胚胎晝夜節(jié)律和下丘腦-垂體-性腺軸通路中基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

馬棟棟，蔣宇霞，楊雷，應(yīng)光國,*，史文俊,#

1. 華南師范大學(xué)環(huán)境研究院，廣東省化學(xué)污染與環(huán)境安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南師范大學(xué)環(huán)境理論化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006 2. 中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所有機(jī)地球化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640

類固醇激素根據(jù)作用受體不同可分為雄激素、糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、孕激素和雌激素。類固醇激素已經(jīng)在環(huán)境中頻繁檢出，由于它們具有潛在的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[1-4]。雄激素是一類重要的類固醇激素，經(jīng)常被用于生長促進(jìn)劑和動物疾病的預(yù)防和治療[5]。由于牲畜飼養(yǎng)過程中產(chǎn)生的內(nèi)源性污染物糞便和尿液中含有雄激素類物質(zhì)，并且所產(chǎn)生的糞肥常應(yīng)用于農(nóng)田或者直接排入自然河流，因此，在不同環(huán)境樣本中已經(jīng)檢測出多種雄激素[6-17]。其中，雄激素1,4-雄烯二酮(androstadienedione, ADD)和雄烯二酮(androstenedione, AED)在各種受納環(huán)境中被廣泛檢出，并且濃度較高。

在我國廣東省污水處理廠出水中，檢測出ADD的濃度可達(dá)13.8 ng·L-1，AED濃度為5.5 ng·L-1 [10]。在我國北京市污水處理廠出水中，ADD檢測濃度達(dá)到18.9 ng·L-1，AED濃度最高也達(dá)到12 ng·L-1 [8]。在瑞士和日本的污水處理廠出水中也檢測出不同濃度的ADD和AED[6,13]。相比較于污水處理廠出水，本研究更關(guān)注ADD和AED在地表水中的濃度水平。研究發(fā)現(xiàn)，廣東省河流中ADD和AED的濃度分別在8.2～17.9 ng·L-1和8.1～8.6 ng·L-1范圍內(nèi)[9]，最高甚至可以達(dá)到548 ng·L-1和197 ng·L-1 [14]。在北京市河流中AED濃度也可達(dá)到99 ng·L-1 [7]。法國地表水中AED的濃度較低，為2.8 ng·L-1 [15]。除了在受納水體環(huán)境中檢測出ADD和AED，多種魚類體內(nèi)也檢測到較高濃度的ADD和AED。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)在中國廣東省的河流中ADD和AED富集在多種魚類體內(nèi)，該研究結(jié)果顯示，鯪魚血漿中AED濃度達(dá)到9.7 μg·L-1；在羅非魚肝臟中AED濃度為2.8 ng·g-1，膽汁中ADD濃度達(dá)到12 μg·L-1，肌肉中AED濃度為0.44 ng·g-1；鯽魚膽汁中AED濃度達(dá)到7.6 μg·L-1。由于ADD和AED在環(huán)境介質(zhì)中檢出頻率和濃度均較高，其可能對水生生物產(chǎn)生毒性效應(yīng)。

目前研究表明，AED是一種弱雄激素受體激動劑。AED的雄激素效應(yīng)比魚類雄激素11-酮基睪酮(11-KT)以及睪酮(T)弱[18]。AED可以引起斑馬魚性逆轉(zhuǎn)，誘導(dǎo)雌性黑頭呆魚和食蚊魚雄性化[3,19-20]。另有研究表明，造紙廢水中的AED可以誘導(dǎo)食蚊魚雄性化[21-22]。最新研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎短期暴露(120 h)于高濃度(6.56 μg·L-1)AED，可增加細(xì)胞色素P450芳香化酶基因(cyp19b和cyp2k7)和硫酸基轉(zhuǎn)移酶基因(sult2st3)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平[23]。此外，古明宗等[24]研究發(fā)現(xiàn)，ADD可以增加食蚊魚體長，減少雌魚臀鰭長度以及減少體重、性腺和肝臟的重量；還影響食蚊魚的卵巢發(fā)育，引起卵細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。這些結(jié)果表明，ADD和AED對魚類具有潛在的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，但是，目前研究主要集中在形態(tài)學(xué)方面，ADD和AED對魚類的分子水平的毒理效應(yīng)研究較少，如晝夜節(jié)律通路和下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)相關(guān)通路。

下丘腦-垂體-性腺軸在內(nèi)分泌系統(tǒng)中起著重要的作用[25]。HPG軸主要通過分泌人促黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)來調(diào)節(jié)性腺功能以及激素水平并維持生物第二特征[26]。此外，晝夜節(jié)律通路可以調(diào)控多個(gè)生物學(xué)過程，比如內(nèi)分泌、細(xì)胞凋亡和眼睛發(fā)育等[27]。晝夜節(jié)律和HPG軸通路在內(nèi)分泌系統(tǒng)中起到關(guān)鍵作用，有很多研究已經(jīng)報(bào)道了雌激素和孕激素對它們的影響[1,28-29]，但是雄激素ADD和AED對其影響的研究還很少。因此，有必要進(jìn)一步研究ADD和AED對魚類晝夜節(jié)律和HPG軸相關(guān)通路的影響。

本研究在Shi等[28]研究的基礎(chǔ)上，以斑馬魚胚胎為受試生物，利用熒光定量PCR技術(shù)分析了ADD和AED短期暴露144 h后對斑馬魚胚胎晝夜節(jié)律相關(guān)基因(cry5、per1b、per2、cry1ab、cry2ad6、clocka、arntl2、nr1d2b和si:ch2ll-132b12.7)和HPG軸相關(guān)基因(ar、esr、vgt、cyp19a1a、cyp11b、hsd17b1、hsd17b2、hsd17b3、gnrh2、gnrhr4、lhb、fshb、atf4b1、atf4b2、cyp11a1和cyp17a1)通路表達(dá)的影響。本研究將為ADD和AED對魚類的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要儀器和試劑

Smart SpecTMPlus分光光度計(jì)購于美國伯樂公司，Applied BiosystemsTMQuantStudioTM7 Flex實(shí)時(shí)定量PCR儀購于美國賽默科技有限公司，1290系列超高效液相色譜串聯(lián)G6495三重四級桿質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)購于美國Agilent公司。

1,4-雄烯二酮(分子式C19H24O2，分子量284.39，CAS號897-06-3，純度98%)、雄烯二酮(分子式C19H26O2，分子量286.41，CAS號63-05-8，純度98%)，均購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)，HPLC級，純度>99.9%，購于Sigma公司。FSQ-301qPCR專用RT試劑盒和QPS-201熒光定量THUNDERBIRDTMSYBR?qPCR Mix均購于日本東洋紡試劑有限公司。

按照Shi等[30]的方法配制胚胎培養(yǎng)液母液，濃度如下：294.0 mg·L-1CaCl2·2H2O、123.3 mg·L-1MgSO4·7H2O、63.0 mg·L-1NaHCO3和5.5 mg·L-1KCl。配制完成后，將母液按體積比1∶5稀釋，曝氣24 h后，調(diào)節(jié)pH值到7.8±0.2，用于胚胎暴露實(shí)驗(yàn)。

1.2 斑馬魚飼養(yǎng)和胚胎收集

成年斑馬魚(Daniorerio)由華南師范大學(xué)廣東省化學(xué)品控制和生物安全實(shí)驗(yàn)室提供。飼養(yǎng)于流動式循環(huán)系統(tǒng)中。在飼養(yǎng)期間，保持水的氧飽和度不低于80%，pH 7～8，同時(shí)光照和黑暗周期設(shè)置為14 h∶10 h，溫度(27±1) ℃。每隔3天換一次水。飼養(yǎng)期間，每天早晚各飼喂紅蟲和豐年蝦一次，并清洗循環(huán)系統(tǒng)中殘留的食物殘?jiān)图S便，以保證循環(huán)水的潔凈。產(chǎn)卵前一天傍晚將1只雌魚和2只雄魚放入斑馬魚交配盒中。雌魚和雄魚由一透明擋板隔開，并用黑色不透光塑料袋包裹交配盒以確保黑暗條件下過夜。第2天清晨緩慢去除塑料袋，小心抽出擋板，打開白熾燈均勻刺激交配盒中的斑馬魚。0.5 h后，收集沉在交配盒底部的受精卵。用胚胎培養(yǎng)液緩慢沖洗胚胎中雜物，并剔除未正常受精的胚胎。再利用光學(xué)顯微鏡，收集發(fā)育正常的胚胎用于暴露實(shí)驗(yàn)。

1.3 暴露試驗(yàn)

根據(jù)ADD和AED在環(huán)境中檢測到的濃度水平[7-14]，均設(shè)置以下暴露濃度：5、50和500 ng·L-1。同時(shí)設(shè)置溶劑對照組。所有處理組中，DMSO濃度均為0.001%(V/V)。每個(gè)處理組包含有4個(gè)平行，暴露試驗(yàn)在1 000 mL燒杯中進(jìn)行，每個(gè)燒杯中包含100個(gè)胚胎和600 mL暴露溶液，連續(xù)暴露144 h。暴露液每天更新一次，并剔除未孵化的胚胎。暴露期間，溫度保持在(27±1) ℃，光照和黑暗周期為14 h∶10 h。暴露結(jié)束后，從每個(gè)燒杯中隨機(jī)吸取25只幼魚，放入RNAlater中，用于提取幼魚中的mRNA。

1.4 基因轉(zhuǎn)錄水平分析

根據(jù)筆者課題組前期已經(jīng)建立好的方法[31-32]進(jìn)行RNA提取、cDNA合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。具體如下：利用Trizol方法提取胚胎中的RNA；使用Smart SpecTMPlus Spectrophotometer (Bio Rad, USA)檢測RNA質(zhì)量和濃度；所有RNA樣品的260 nm和280 nm比值在1.8～2.0。使用東洋紡試劑盒(ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with gDNA Remover, Japan)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。目標(biāo)基因引物均參考筆者課題組已發(fā)表的論文[28,30,33-34]。引物設(shè)計(jì)和要求如下：使用batchprimer3設(shè)計(jì)跨越內(nèi)含子的引物并利用Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)分析引物的特異性，再交由上海生工合成；引物的擴(kuò)增效率均在95%～105%之間。在Applied BiosystemsTMQuantStudioTM7 Flex平臺上進(jìn)行熒光定量PCR分析。反應(yīng)體系如下：總體積為20 μL，包括10 μL THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix試劑(Toyobo)，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，2.5 μL cDNA樣品和6.7 μL DEPC水。反應(yīng)條件為：預(yù)變性后，在95 ℃×15 s、60 ℃×60 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。引物信息如表1中所示。Shi等[28]的研究已表明，斑馬魚長期暴露于去氫孕酮(dydrogesterone, DDG)后，RpL13α、Actin-β和EF1-α這3個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)均非常穩(wěn)定。Liang等[29]的研究也表明，斑馬魚胚胎分別暴露于炔雌醇(17α-ethinylestradiol, EE2)、甲炔諾酮(norgestrel, NGT)和EE2+NGT中96 h后，上述3個(gè)內(nèi)參基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)都非常穩(wěn)定。因此，qPCR的結(jié)果利用RpL13α、Actin-β和EF1-α這3個(gè)內(nèi)參基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的平均值對目標(biāo)基因進(jìn)行歸一化分析。然后，采用-ΔΔCT方法分析目標(biāo)基因相對于內(nèi)參基因的差異表達(dá)倍數(shù)[35]。

1.5 暴露液中ADD和AED濃度測定

為了測定AED和ADD在暴露水中的實(shí)際濃度，對溶劑對照組和各處理組中ADD和AED濃度進(jìn)行了化學(xué)分析。由于暴露水溶液每天都更新，因此，從更換暴露液(T0)到隔天更換暴露液前(T24)為一個(gè)周期。在暴露第5天，取每個(gè)處理組中T0和T24這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的水樣。每個(gè)平行取500 mL水樣，裝入棕色玻璃瓶中。每個(gè)處理組4個(gè)平行。依照筆者課題組已經(jīng)建立的方法[9]對水樣中的ADD和AED進(jìn)行固相萃取和上機(jī)分析。操作流程簡述如下：水樣取好后，每個(gè)樣品中加入25 mL甲醇和0.2 mL的H2SO4(2 mol·L-1)；使用0.7 μm玻璃纖維濾膜(Whatman)過濾；完成后，每個(gè)水樣中加入50 μL內(nèi)標(biāo)，充分搖勻；使用固相萃取柱(Oasis HLB，6 mL，500 mg)提取水樣中的ADD和AED；抽干柱子后，用10 mL色譜純的乙酸乙酯洗脫固相萃取柱，氮?dú)獯蹈?，并?.5 mL的甲醇(HPLC，Merk)定容，最后使用1290系列超高效液相色譜串聯(lián)G6495三重四級桿質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)上機(jī)檢測[9]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均利用SPSS進(jìn)行差異性分析。利用單因素方差分析(One Way ANOVA)中的Tukey多重比較分析轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的顯著性。當(dāng)P<0.05、P<0.01和P<0.001認(rèn)為差異顯著。利用cluster3.0對qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。使用Origin繪制柱狀圖，圖中所有結(jié)果均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 暴露濃度

由于暴露實(shí)驗(yàn)每24 h更新暴露液，每隔24 h為1個(gè)暴露周期。選取暴露的第5天收集暴露液樣品，包括更換新鮮暴露液后樣品(T0)和更換暴露液前樣品(T24)，分析ADD和AED的實(shí)際暴露濃度。檢測分析發(fā)現(xiàn)，ADD和AED的實(shí)際濃度在T0時(shí)刻均與名義濃度較為接近。但是，經(jīng)過24 h暴露后，除了低濃度組(5 ng·L-1)外，其他ADD和AED的實(shí)測濃度均降低較多；其中，ADD在T24的實(shí)際濃度下降了37.4%～82.3%；AED在T24的實(shí)際濃度下降了84.8%～92.4%。暴露24 h內(nèi)，ADD的平均濃度分別為4.48、30.0和231 ng·L-1，AED的平均濃度分別為3.64、21.7和230 ng·L-1(表2)。Fent等[23]的研究也表明，胚胎暴露于AED中24 h后，AED有降解現(xiàn)象。這可能是由于ADD或AED吸附在暴露容器表面或斑馬魚體表造成的，也有可能是魚缸內(nèi)的微生物降解ADD或AED引起的。

表1 用于qPCR分析的基因引物列表Table 1 Primers used for real-time qPCR analysis

注：a引自Shi等[28]；b引自Shi等[30]；c引自Liang等[33]；d引自Liang等[34]。

Note:arefer to Shi et al[28];brefer to Shi et al[30];crefer to Liang et al[33];drefer to Liang et al[34].

表2 ADD和AED在暴露實(shí)驗(yàn)中名義濃度和實(shí)測濃度Table 2 The nominal and measured concentrations of ADD and AED in the exposure experiment

注：ADD表示1,4-雄烯二酮，AED表示雄烯二酮；SC表示溶劑對照組；T0和T24表示取樣時(shí)間(0 h和24 h)；實(shí)測濃度為平均值(n=2)。

Note: ADD stands for androstadienedione; AED stands for androstenedione; SC stands for solution control;T0andT24represents exposure time (0 h and 24 h); measured concentrations are given as mean (n=2 replicates).

2.2 ADD和AED短期暴露對斑馬魚晝夜節(jié)律通路中基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

如圖1所示，ADD處理組中所有濃度均顯著增大了per1b、nr1d2b、cry5和si:ch211-132b12.7的轉(zhuǎn)錄水平，4.48 ng·L-1的ADD顯著提高了per2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，30 ng·L-1的ADD顯著降低了arntl2的轉(zhuǎn)錄水平。3.64 ng·L-1AED處理組顯著增大了per1b、nr1d2b、cry5和si:ch211-132b12.7的轉(zhuǎn)錄水平，21.7 ng·L-1的AED顯著增大了per1b和nr1d2b的轉(zhuǎn)錄水平。230 ng·L-1的AED顯著降低了arntl2的表達(dá)水平(P<0.01)。

2.3 ADD和AED短期暴露對斑馬魚胚胎HPG軸中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

如圖2(a)所示，231 ng·L-1ADD暴露顯著下調(diào)了gnrh2和atf4b2的轉(zhuǎn)錄水平；30 ng·L-1的ADD暴露顯著降低了fshb的轉(zhuǎn)錄水平；4.48 ng·L-1和231 ng·L-1的ADD顯著上調(diào)了esr的轉(zhuǎn)錄水平。如圖2(b)所示，231 ng·L-1的ADD顯著下調(diào)了cyp17a1和vgt1的轉(zhuǎn)錄水平，30 ng·L-1的ADD顯著降低了cyp19a1a、hsd17b1和cyp11a1的表達(dá)水平，另外4.48 ng·L-1的ADD顯著降低了cyp11b和hsd17b1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。在AED處理組中，3.64 ng·L-1的AED顯著上調(diào)了lhb的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平；230 ng·L-1的AED顯著下調(diào)了atf4b2的轉(zhuǎn)錄水平，并且顯著上調(diào)了ar的轉(zhuǎn)錄水平(圖2(c))。3.64 ng·L-1和21.7 ng·L-1的AED顯著降低了cyp11b的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01)，230 ng·L-1的AED顯著降低了cyp11b和cyp19a1a的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，3.64 ng·L-1的AED顯著降低了star的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平(圖2(d))。

2.4 聚類分析

如圖3所示，聚類分析結(jié)果表明，ADD-L、ADD-M和ADD-H均被聚集到一起，AED-L和AED-M聚類到一起。ADD和AED對斑馬魚晝夜節(jié)律和胚胎HPG軸相關(guān)基因的影響具有物質(zhì)依賴性。其次，晝夜節(jié)律通路中基因大部分被富集到聚類圖中下面部分，HPG軸相關(guān)基因被富集到聚類圖中的上面部分，ADD和AED對晝夜節(jié)律和HPG軸的影響差異較大。

3 討論(Discussion)

本研究分析了ADD和AED短期暴露對斑馬魚胚胎的影響。結(jié)果顯示，ADD和AED可以影響晝夜節(jié)律和HPG軸相關(guān)通路基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，特別是影響了晝夜節(jié)律通路中基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。

qPCR的結(jié)果顯示，斑馬魚胚胎暴露于4.48 ng·L-1ADD后，per1b、nr1d2b和si:ch211-132b12.7轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分別上調(diào)了3.19倍、2.72倍和3.63倍。而3.64 ng·L-1AED暴露后per1b、nr1d2b和si:ch211-132b12.7轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分別上調(diào)了2.07倍、1.83倍和1.09倍。另外，低濃度處理下，ADD暴露對胚胎晝夜節(jié)律通路中基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響也較AED更強(qiáng)。目前，關(guān)于ADD和AED對斑馬魚晝夜節(jié)律相關(guān)通路中基因影響的相關(guān)研究很少。在本研究中，環(huán)境相關(guān)濃度ADD和AED短期暴露后，可以強(qiáng)烈影響斑馬魚晝夜節(jié)律通路中per1b、nr1d2b和si:ch211-132b12.7等基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。同時(shí)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的孕激素和雌激素單一暴露或者聯(lián)合暴露均可顯著影響晝夜節(jié)律相關(guān)通路中基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[1,28-29]。這些結(jié)果表明，晝夜節(jié)律通路中相關(guān)基因?qū)︻惞檀碱惣に乇┞遁^為敏感。

圖1 ADD(a)和AED(b)短期暴露對斑馬魚胚胎晝夜節(jié)律相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響注: ADD-L、ADD-M和ADD-H處理組中ADD濃度分別為4.48、30.0和231 ng·L-1；AED-L、AED-M和AED-H處理組中AED濃度分別為3.64、21.7和230 ng·L-1；下同。Fig. 1 Transcriptional alteration of genes related to circadian rhythm in zebrafish embryos exposed to ADD (a) and AED (b)Note: The ADD concentraitons in ADD-L, ADD-M and ADD-H treatment groups are 4.48, 30.0 and 231 ng·L-1; the AED concentraitons in AED-L, AED-M and AED-H treatment groups are 3.64, 21.7 and 230 ng·L-1; the same below.

圖2 ADD(a、b)和AED(c、d)短期暴露對斑馬魚胚胎下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響Fig. 2 Transcriptional alteration of genes related to hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis in zebrafish embryos exposed to ADD (a, b) and AED (c, d)

在晝夜節(jié)律通路中包含一個(gè)負(fù)反饋環(huán)和一個(gè)正反饋環(huán)。負(fù)反饋環(huán)主要包括生物鐘基因(per)和隱花色素基因(cry)編碼的PER和CRY蛋白通過作用時(shí)鐘節(jié)律調(diào)節(jié)因子a基因(clocka)和芳香烴受體核轉(zhuǎn)錄蛋白樣2基因(arntl2)編碼的CLOCK和BMAL二聚體，反饋抑制per和cry基因自身的轉(zhuǎn)錄[27,36]；正反饋環(huán)主要包括CLOCK和BMAL二聚體與含有E-box增強(qiáng)子反式作用元件結(jié)合調(diào)控per和cry的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[27,36]。在本研究中，雄激素ADD和AED均顯著增加了晝夜節(jié)律通路中生物鐘基因(per1b)、核受體亞族1的D群基因(nr1d2b)、隱花色素基因(cry5)和si:ch211-132b12.7的轉(zhuǎn)錄水平，卻降低了clocka和arntl2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。Shi等[28]的研究顯示，si:ch211-132b12.7可負(fù)調(diào)控晝夜節(jié)律通路。高轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的si:ch211-132b12.7表示ADD和AED暴露后，晝夜節(jié)律通路可能主要以負(fù)反饋環(huán)應(yīng)答為主。這與上調(diào)的per和cry以及下調(diào)的clocka和arntl2吻合。這些結(jié)果表明，ADD和AED暴露后，改變了斑馬魚胚胎中晝夜節(jié)律網(wǎng)絡(luò)。晝夜節(jié)律是維持高等生物24 h節(jié)律的關(guān)鍵通路，可以調(diào)控睡眠、內(nèi)分泌、細(xì)胞凋亡甚至生殖發(fā)育等多個(gè)生物過程[27]。比如，內(nèi)源性節(jié)律生物鐘可以調(diào)節(jié)嚙齒動物生殖周期[27]。本研究中分析的晝夜節(jié)律相關(guān)基因也參與多種生物過程。此外，nr1d2b是一類核受體，主要是與激素類信號分子結(jié)合，調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[36]。過度表達(dá)的nr1d2b則表示AED和ADD可能通過nr1d2b影響斑馬魚胚胎的激素應(yīng)答效應(yīng)。cry和per基因均在維護(hù)眼睛正常的視覺功能方面具有重要的作用[37-38]。上調(diào)的cry5和per1b基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)表明，ADD和AED可能會通過晝夜節(jié)律通路影響斑馬魚眼睛的正常功能[39]。綜上所述，晝夜節(jié)律的變化可能會影響多個(gè)下游通路，如激素應(yīng)答等。

HPG軸在內(nèi)分泌系統(tǒng)中扮演著重要的角色[25-27]。因此，本研究進(jìn)一步分析了ADD和AED對斑馬魚HPG軸相關(guān)通路中基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。通過研究發(fā)現(xiàn)，ADD降低lhb和fshb的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，而AED增加lhb的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。lhb和fshb主要由下丘腦垂體釋放，經(jīng)過血液循環(huán)作用于性腺，調(diào)節(jié)性腺相關(guān)生理過程，如激素合成等[25]。lhb和fshb的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化則可能會對激素的生物合成造成一定的影響。在本研究中，ADD和AED均降低cyp19a1a和cyp11b的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。其中，4.48 ng·L-1和30.0 ng·L-1ADD分別顯著抑制cyp19a1a和cyp11b的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。3.64、21.7和230 ng·L-1的AED分別下調(diào)cyp19a1a和cyp11b的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。Fent等[23]研究也發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎暴露于AED中96 h后，cyp19a1a和cyp11b的轉(zhuǎn)錄表達(dá)被抑制。cyp19a1a可表達(dá)并合成雌激素酶，主要催化雌激素生物合成的最后一步反應(yīng)，cyp11b則參與合成雄激素[40-41]。低轉(zhuǎn)錄表達(dá)的cyp19a1a和cyp11b預(yù)示著ADD和AED可能會抑制雌激素和雄激素的生物合成。

圖3 聚類分析HPG軸和晝夜節(jié)律相關(guān)基因的qPCR數(shù)據(jù)Fig. 3 Hierarchical clustering analysis of qPCR data for genes related to HPG axis and circadian rhythm

此外，本研究還分析了ADD和AED對雄激素受體(ar)、雌激素受體(esr)和卵黃蛋白(vtg1)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，230 ng·L-1AED可以增加ar的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平；231 ng·L-1ADD抑制vtg1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，卻增加了esr的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。Fent等[23]研究發(fā)現(xiàn)，6.56 μg·L-1AED暴露96 h后，可增加斑馬魚胚胎的ar和esr的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，并抑制vtg1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。多項(xiàng)研究表明，AED能引起斑馬魚性逆轉(zhuǎn)，并誘導(dǎo)雌性黑頭呆魚雄性化[3,18-19]。因此，不難理解AED可以誘導(dǎo)斑馬魚胚胎中雄激素受體的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。而ADD影響esr和vtg1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，這提示ADD對斑馬魚胚胎可能還有其他多種激素效應(yīng)，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，斑馬魚胚胎短期暴露于ADD和AED后，晝夜節(jié)律通路中per1b、nr1d2b和cry5的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平均顯著增加，甚至環(huán)境相關(guān)濃度的ADD和AED暴露也可產(chǎn)生影響。ADD和AED可能通過改變晝夜節(jié)律通路中的基因表達(dá)影響下游其他的生物過程和通路。此外，ADD和AED影響了HPG軸中l(wèi)hb和fshb的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，同時(shí)也抑制了雌激素合成相關(guān)的cyp19a1a和雄激素合成相關(guān)的hsd11b的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這表明，ADD和AED對斑馬魚胚胎具有潛在的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。由此可知，雄激素ADD和AED短期暴露144 h后，可影響斑馬魚胚胎內(nèi)分泌相關(guān)的生物學(xué)通路中基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對斑馬魚具有潛在的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。后續(xù)應(yīng)研究環(huán)境相關(guān)濃度ADD和AED長期暴露后，對斑馬魚產(chǎn)生的激素效應(yīng)。