黃條鰤MSTN基因的克隆及其在早期發(fā)育中的表達特征?

史 寶, 曹亞男, 柳學周,3??, 孫冉冉,3, 徐永江, 王 濱, 姜 燕

(1. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室, 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071; 2. 煙臺市海洋經(jīng)濟研究院, 山東 煙臺 264000; 3. 大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院, 遼寧 大連 116023)

肌肉生長抑制素(Myostatin, MSTN)又稱為生長分化因子8(GDF8)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族(TGF-β)，通過抑制生肌決定因子(MyoD)家族成員的轉(zhuǎn)錄活性來調(diào)控肌細胞的生長，抑止肌衛(wèi)星細胞的增殖和分化[1]，既是骨骼肌發(fā)育生長的負向調(diào)控因子[2]，又是影響骨骼肌生長的關鍵因子[3]。MSTN基因最早在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)，隨后也在十多種魚類中克隆到該基因[4]。在動物體內(nèi)MSTN起初是被翻譯成前體蛋白，在蛋白酶的水解作用下形成前肽與成熟肽兩部分[5]。成熟肽是該基因的功能域，具有抑制肌肉生長的作用，同時前肽可與成熟肽結(jié)合形成二聚體，使成熟肽的功能被抑制[6]。在哺乳動物中，MSTN通過腫瘤生長因子—B途徑包括激活素受體，Act RIIB和Smads 2和3的磷酸化抑制成肌細胞增殖和分化[7]。 敲除小鼠(Musmusculus)的MSTN基因，發(fā)現(xiàn)其不僅能正常生長發(fā)育，體重還比野生型增加了數(shù)倍，且骨骼肌數(shù)量顯著增加，該研究首次證實MSTN是肌肉生長的負調(diào)控因子[8]。在魚類中，應俊等通過對大黃魚(Larimichthyscrocea)MSTN-1前肽基因的原核表達、多克隆抗體制備，并采用該抗體注射大黃魚幼魚，發(fā)現(xiàn)注射組實驗魚增重率比對照組低，證明了MSTN對其生長具有抑制作用[9]。在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)MSTN的全序列中發(fā)現(xiàn)有與生長、體重相關的位點[10]。另外，有研究表明MSTN是仔稚幼魚階段分化和激活肌細胞的關鍵轉(zhuǎn)錄因子之一[11-12]。

黃條鰤(Seriolaaureovittata)屬鱸形目(Perciformes)鯵科(Carangidae)鰤屬(Seriola)，是中國本土分布的大洋性經(jīng)濟魚類，具有營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮嫩，消費市場潛力大等優(yōu)點[13-15]。國內(nèi)外關于黃條鰤生長、發(fā)育相關基因的研究報道較少，目前未見黃條鰤MSTN研究報道。本研究對黃條鰤MSTN基因全長cDNA序列進行了克隆，并且對其在不同組織、胚胎發(fā)育各時期以及仔稚幼魚發(fā)育階段的表達特征進行了研究，旨在為探討MSTN在黃條鰤肌肉生長及早期發(fā)育過程中的調(diào)控機制奠定分子生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚及樣品處理

實驗用黃條鰤取自大連富谷水產(chǎn)有限公司。 實驗用魚的培育條件：養(yǎng)殖期間投喂新鮮鮮雜魚餌料，養(yǎng)殖期間控制水溫為18～25 ℃、鹽度為28～30、pH為8.0～8.3；每日投餌2次，飼喂量為魚自身體重的2%～5%。一齡黃條鰤(雌性3尾)，全長33～35 cm，體重450～500 g。通過MS-222(260 mg/L)麻醉后快速解剖，采集采集腦、垂體、肝臟、肌肉、脾臟、腎臟、鰓、心臟、胃、腸、頭腎11個組織投入液氮中速凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低冰箱保存，提取總RNA，用于基因克隆和組織表達分布特征研究。

依據(jù)黃條鰤胚胎時期發(fā)育階段的劃分[16]，采用NIKON解剖鏡(MSZ800,日本)進行胚胎發(fā)育觀察，記錄發(fā)育時序，并采集受精卵到初孵仔魚等18個發(fā)育時期的胚胎樣本。同時，采集孵化后的仔稚幼魚(1～60日齡)14個生長發(fā)育階段樣品。迅速凍于液氮，用于胚胎和仔稚幼魚發(fā)育過程的基因表達分析。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

利用RNAiso Plus(TaKaRa,日本)提取肌肉組織中的總RNA，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，使用Nanodrop2000 (Thermo,美國)測定RNA濃度。 以總RNA為模板，采用PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,日本)合成cDNA第一鏈用于保守區(qū)域擴增。5′RACE及3′RACE cDNA第一鏈通過SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech,美國)合成，用于后續(xù)的RACE全長實驗。

1.3 MSTN基因cDNA 的RACE克隆

用Primer Premier 5.0軟件設計特異擴增引物(見表1)。保守片段擴增以肌肉cDNA為模板，PCR反應體系包含2 μL cDNA第一鏈、2 μL 10×PCR Buffer、0.5 μL Taq 酶、2.5 μL dNTP Mixture、2 μL的MSTN-F1、2 μL的 MSTN-R1、14 μL ddH2O，總體積為25 μL。PCR擴增條件94 ℃ 5 min 、95 ℃ 30 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，36個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳跑膠檢測，通過E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit Manual膠回收試劑盒(Omega,美國)純化。 將回收的產(chǎn)物與pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化入Transl-T1感受態(tài)細胞(全式金,中國)，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，對有插入片段的陽性克隆進行測序(上海生工生物工程股份有限公司)。

表1 黃條鰤基因克隆、定量分析使用的引物序列

通過得到的保守片段序列設計RACE反應特異引物(見表1)。 根據(jù)SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒進行5′RACE和3′RACE反應。 5′RACE的第一次梯度PCR反應體系包含0.5 μL 50×Advantage 2 Polymerase Mix、17.5 μL Water、2 μL 50×dNTP Mix、2.5 μL 10×Advantage 2 PCR Buf-fer、1 μL模板，1 μL UPM，0.5 μL MSTN-5′-R1，總體積25 μL，混勻并離心。PCR反應條件同上，以10倍稀釋后的第一次PCR產(chǎn)物為模板，MSTN-5′-R2、NUP為引物，進行第二次PCR擴增目標基因的5′RACE。3′RACE的PCR體系及反應條件與5′RACE相似。RACE產(chǎn)物測序操作與保守片段克隆實驗中測序步驟相同。

1.4 反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

利用熒光定量PCR檢測MSTN基因的表達水平。根據(jù)克隆獲得的黃條鰤MSTNcDNA全長序列和內(nèi)參基因18s設計熒光定量PCR引物(見表1)。參照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Takara,日本) 說明書進行熒光定量PCR擴增。PCR擴增體系(20 μL)為SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，ddH2O 6.4 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L) 各0.8 μL。擴增程序為95 ℃預變性30 s；95 ℃循環(huán)變性5 s，60 ℃退火復性20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。標準曲線以肌肉組織cDNA為模板，通過10 倍梯度稀釋，選取其中8個梯度濃度繪制而成。每個樣品測試所有實驗設置3個重復，結(jié)果采用2-ΔΔCT對不同基因的表達量進行比較分析[17]。

1.5 序列結(jié)構及系統(tǒng)進化分析

使用Expasy在線數(shù)據(jù)庫預測(www.expasy.org/tools/protparam.html)進行黃條鰤MSTN的結(jié)構、分子量和等電點的預測；使用DNAMAN 6.0軟件進行氨基酸序列推導、序列拼接和氨基酸同源性分析；使用NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 進行結(jié)構域的預測；SOPM (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl/page=npsa-sopma.html) 分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構；ClustalW在線軟件(http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)進行氨基酸序列多重比對；使用MEGA 6軟件的鄰接法(NJ)構建系統(tǒng)系統(tǒng)進化樹，自展值為1 000。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用平均值±標準差(Mean±S.D.)表示MSTNmRNA相對表達量，采用SPSS 19.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan多重比較分析，P<0.05表示具有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 MSTN基因結(jié)構與氨基酸序列分析

對黃條鰤MSTN cDNA擴增獲得1 828 bp基因序列(GenBank登錄號: MH144053)，包括159 bp的5′UTR、1 131 bp的ORF和538 bp的3′UTR，編碼376個氨基酸，蛋白預測分子量為42 kDa，等電點為5.4。黃條鰤MSTN包含兩段保守區(qū)域即TGF-β前肽區(qū)域(37～253)和TGF-β功能域(282～376)，共有13個半胱氨酸殘基，序列中還含有1個糖基化位點，位于第73位氨基酸，前22個氨基酸殘基是信號肽序列(見圖1)。

(方框表示信號肽序列; 下劃線表示TGF-β前肽區(qū)域; 雙下劃線表示TGF-β功能域; *代表終止密碼子。The signal peptide sequence was framed. The TGF-β propeptide region was underlined. The TGF-β functional domain was double underlined. “*” indicated the stop codon.)

2.2 MSTN的氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

黃條鰤MSTN蛋白與脊椎動物對應的氨基酸序列顯示出保守的同一性。序列比對分析顯示，黃條鰤MSTN的氨基酸序列與同屬鱸形目高體鰤(S.dume-rili)的同源性最高99.5%，與大黃魚(Larimichthyscrocea)同源性為94.4%，與鯽魚(Carassiuscarassius)同源性為82.4%，與人(Homosapiens)的同源性為65.9%，與雞(Gallusgallus)的同源性為65.6% (見圖2)。

(MSTN氨基酸序列GenBank登錄號：GG: 雞, AAR18244; HS: 人, ABI48390; CC: 鯽魚，AGK84718; LC: 大黃魚, AAW34055; SD: 高體鰤, XP_022596066; SA: 黃條鰤, AZQ19980。 “*”表示一致的氨基酸殘基; “:”表示高度保守度的氨基酸; “.”表示低保守度的氨基酸. The GenBank accession numbers of MSTN amino acid sequences are as follows: GG: Gallus gallus, AAR18244; HS: Homo sapiens, ABI48390; CC: Carassius carassius, AGK84718; LC: Larimichthys crocea, AAW34055; SD: Seriola dumerili, XP_022596066; SA: Seriola aureovittata, AZQ19980. “*”indicated identical amino acid sequences; “:” indicated highly conserved amino acid sequences; “.” indicated amino acid sequences of low degree conserved.)

利用NJ法構建了基于氨基酸序列的黃條鰤MSTN和其他脊椎動物的系統(tǒng)進化樹(見圖3)，結(jié)果表明進化樹中魚類聚為一枝，其他脊椎動物聚為另一枝。在比對的物種中，黃條鰤的MSTN與高體鰤聚為一支，再與鱸形總目聚為一支；這說明黃條鰤與高體鰤親緣關系最近，與哺乳類、鳥類、嚙齒類親緣關系較遠。

圖3 基于MSTN氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進化樹

2.3 MSTN在不同組織的定量分析

RT-qPCR檢測到MSTNmRNA在黃條鰤的腦、垂體、肝臟、肌肉、脾臟、腎臟、鰓、心臟、胃、腸、頭腎11個組織中均有表達，但其表達量存在差異。分析表明MSTNmRNA在黃條鰤肌肉中表達量最高(P<0.05)，其次在腦和胃中也檢測到少量表達，而在垂體、肝、脾、腎、鰓、心、腸和頭腎等組織中檢測到微量表達(見圖4)。

2.4 MSTN在早期發(fā)育階段的表達分析

MSTNmRNA在黃條鰤早期胚胎中表達量都較低，在胚體下包1/2之前表達量呈現(xiàn)無規(guī)律的上下波動，整體上表達量都較低，且沒有顯著差異(P>0.05)；從胚體下包2/3至孵化期MSTNmRNA的表達量顯著上調(diào)，至孵化期表達量達到峰值(P<0.05) (見圖5)。在仔稚幼魚時期，MSTNmRNA在孵化后3 d內(nèi)表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，后又在20 d降低至較低水平(P<0.05)，25 d后表達量再次顯著升高至30 d達到峰值(P<0.05)，隨后呈現(xiàn)顯著下降趨勢(見圖6)。

(BR: 腦; P: 垂體; L: 肝臟; M: 肌肉; SP: 脾臟; K: 腎臟; GI: 鰓; H: 心臟; ST: 胃; I: 腸; HK: 頭腎。不同組織差異顯著用不同字母表示, P<0.05。 BR: brain; P: pituitary; L: liver; M: muscle; SP: spleen; K: kindey; GI: gill; H: heart; ST: stomach; I: intestine; HK: head-kidney. Significant diffe-rence in differences tissues are indicated by different letters, P<0.05.)

(1. 受精卵; 2. 2細胞; 3. 4細胞; 4. 8細胞; 5. 16細胞; 6. 32細胞; 7. 多細胞; 8.桑椹胚; 9. 高囊胚; 10. 低囊胚; 11. 原腸胚早期; 12. 原腸胚中期; 13. 原腸胚末期; 14. 神經(jīng)胚; 15. 胚體下包1/2; 16. 胚體下包2/3; 17. 胚體全包; 18. 孵化期;不同字母表示差異顯著, P<0.05; 以受精卵 mRNA表達量為標準1。1. fertilized egg stage; 2. 2-cell stage; 3. 4-cell stage; 4. 8-cell stage; 5. 16-cell stage; 6. 32-cell stage; 7. multi-cell stage; 8. morula stage; 9. high blastula stage; 10. low blastula stage;11. early gastrula stage; 12. mid-gastrula stage; 13. late gastrula stage; 14. neurula stage; 15. embryo encirling 1/2 of yolk sac;16. embryo encircling 2/3 of yolk sac; 17. embryo encricling the whole yolk sac; 18. newly hatched larva; Different letters indicated significant diffe-rence, P<0.05; A relative abundance of 1 was set arbitrarily for the mRNA expression level in the fertilized egg.)

(日齡不同字母表示差異顯著, P<0.05; 以孵化后1 d MSTN表達量為標準1。 Different letters indicated significant difference, P<0.05. A relative abundance of 1 was set arbitrarily for the MSTN mRNA expression level in the 1 day after hatching.)

3 討論

本研究通過RT-PCR及RACE方法獲得了黃條鰤MSTN全長cDNA序列。 黃條鰤MSTN氨基酸序列含有N端信號肽、保守的半胱氨酸殘基以及TGF-β前肽域和TGF-β功能域等特征，符合TGF-β家族蛋白的特征，與其他物種的MSTN蛋白特征一致[4]。這種結(jié)構上的相似性，暗示黃條鰤在MSTN功能上的保守性。同源性分析結(jié)果表明，黃條鰤MSTN的氨基酸序列與同屬鱸形目高體鰤的同源性高達99.5%，與其他魚類、鳥類、人的MSTN同源性也較高。系統(tǒng)進化分析表明，黃條鰤的MSTN與高體鰤MSTN聚為一支，再與鱸形總目聚為一支，與哺乳類、鳥類、嚙齒類親緣關系較遠；表明鰤屬魚類MSTN進化上具有較強的保守性。

在許多方面，魚類MSTN的表達特征不同于高等脊椎動物。研究發(fā)現(xiàn)MSTN只在小鼠、比利時藍牛(Bostaurus)和皮爾蒙特牛(Bostaurus)的體節(jié)和骨骼肌中表達[5,18]，但魚類MSTN表達模式與哺乳類有明顯的差異。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)魚類的MSTN除了肌肉外，在腦、腸、鰓、腎、性腺等多個組織表達，對其他組織的發(fā)育和功能也有影響[19-20]。本研究中，組織表達分析發(fā)現(xiàn)MSTNmRNA在黃條鰤肌肉中表達量最高(P<0.05)，這表明MSTN參與了肌肉的生長調(diào)控；在黃條鰤腦中也檢測到MSTNmRNA微量表達，推斷可能在神經(jīng)系統(tǒng)也有其作用[21]。 除肌肉、腦外，MSTNmRNA在黃條鰤腎臟中表達，暗示其參與免疫系統(tǒng)的調(diào)控[22]。在斑馬魚(Daniorerio)和金頭鯛(Sparusaurata)的肌肉、眼、鰓絲、脾、卵巢、腸、腦組織均檢測到MSTN表達，在精巢檢測到MSTN微弱的表達[23-24]。 結(jié)合其他魚類MSTN廣泛的組織表達特性，我們推測黃條鰤MSTN的功能不僅調(diào)節(jié)肌肉的生長和發(fā)育，還作用于其他細胞和組織。

研究發(fā)現(xiàn)MSTN過表達導致斑馬魚體節(jié)發(fā)生期胚胎的背-腹軸縮短；脊索扭曲，體節(jié)發(fā)育受到強烈抑制而不分化[25]，而敲除斑馬魚MSTN則會使胚胎體節(jié)數(shù)目增多[26]；這說明MSTN對于魚類正常的胚胎發(fā)育是必須的。從黃條鰤受精卵到胚體下包1/2MSTNmRNA的表達量較低，推測此階段MSTN可能來源于母源性轉(zhuǎn)錄本。在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)MSTN的表達也是母源性的，從1細胞期就開始表達[22]。在黃條鰤胚胎發(fā)育后期MSTNmRNA表達量升高，表明是由胚胎轉(zhuǎn)錄出來的，這一時期也是黃條鰤肌節(jié)、心臟等器官開始形成的階段；MSTNmRNA大量表達可能是因為黃條鰤胚胎體節(jié)發(fā)育基本完成，形成生肌節(jié)細胞，并進一步激活肌肉特異基因的表達[27]。

研究表明MSTN表達與魚類肌肉生長相關[28-29]。在武昌魚(Megalobramaamblycephala)，肌肉中MSTN表達在2齡魚顯著高于1齡魚[30]。在黃條鰤，隨著胚后發(fā)育的進行，孵化出膜后的0～3 d和25～40 d的階段，MSTNmRNA表達量維持一個相對較高的表達趨勢，這可能與MSTN在個體生長不同階段肌肉發(fā)育過程所起的調(diào)控作用相關。在25 d左右為黃條鰤魚苗大量死亡時期，該階段MSTNmRNA表達量顯著升高，推斷出現(xiàn)魚苗死亡的原因之一可能是MSTNmRNA較高的表達水平導致的。在黃條鰤仔稚幼魚發(fā)育關鍵階段，MSTNmRNA表達特征變化與黃條鰤另一個肌肉發(fā)育負向調(diào)控因子PTEN表達變化趨勢相似[31]。MSTN作為肌肉發(fā)育的負向調(diào)控因子，45 d后MSTNmRNA表達量明顯降低并保持較低表達水平，這一階段黃條鰤魚苗生長速度較快，MSTNmRNA相對較低的表達說明其與黃條鰤肌肉生長密不可分。今后有必要繼續(xù)研究MSTN基因在黃條鰤生長發(fā)育過程的功能及作用機制。

4 結(jié)語

本研究聚焦肌肉生長發(fā)育的關鍵負調(diào)控基因-生長抑制素基因在黃條鰤不同組織、胚胎發(fā)育過程以及仔稚幼魚發(fā)育過程中的表達變化特征，首次揭示了MSTN在黃條鰤的胚胎及早期生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。相關研究結(jié)果為探討MSTN在黃條鰤生長發(fā)育的調(diào)控機制奠定了分子生物學基礎，并為今后開展黃條鰤繁養(yǎng)殖及育種工作提供理論參考。