脂肪源性干細胞在慢性創(chuàng)面愈合中的作用及研究進展

黃海燕，李展鵬，吳澤勇，廖思牡，吳志遠（審校）

（廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院整形外科，廣東 湛江，524000）

慢性創(chuàng)面亦稱慢性傷口、難愈性創(chuàng)面，一般認為由各種原因引起的，經正規(guī)治療超過4周仍未愈合或沒有愈合趨勢的創(chuàng)面[1]。慢性創(chuàng)面病程冗長，常引起嚴重功能障礙，對患者及患者家庭的正常生活造成嚴重干擾，慢性創(chuàng)面患者多數為中老年人，隨著人口老齡化，其發(fā)生率呈日益增長趨勢。根據我國流行病學研究，2011年住院患者中慢性創(chuàng)面發(fā)生率已達1.7‰[2]。目前，我國每年慢性難愈合創(chuàng)面的治療需求在3000萬人次，而整個創(chuàng)面治療需求高達1億人次[3]。糖尿病足是形成慢性創(chuàng)面的主要病因之一，我國50歲以上的糖尿病患者糖尿病足的發(fā)病率高達8.1%，糖尿病的發(fā)生率從1986年的0.67%上升至2020年的11.2%[4]，預計到2030年全球患病人數將達到5.78億人，到2045年升至7億[5]。慢性創(chuàng)面已儼然成為一個嚴重的全球健康問題。由于其形成機制復雜，影響因素眾多，根據病因的不同，臨床上主要分為：創(chuàng)傷性潰瘍、壓迫性潰瘍、糖尿病潰瘍、靜脈性潰瘍、缺血性潰瘍，另外還包括感染性潰瘍、神經性潰瘍、放射性潰瘍等類型[6]。

慢性創(chuàng)面的傳統治療方法包括創(chuàng)面保守清潔換藥、抗生素局部或全身應用、各種物理療法、創(chuàng)面允許時進行外科手術治療等。近年來，國內外許多學者通過對影響創(chuàng)面愈合因素及促進創(chuàng)面愈合機制的深入研究陸續(xù)推出新的治療理念和方法，如在換藥基礎上聯合各種新型敷料及生長因子、亦或者聯合富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）、富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）、人工真皮、創(chuàng)面負壓封閉治療等，但仍然難以獲得令人滿意的愈合效果，且慢性創(chuàng)面常伴有感染，可導致膿毒癥等并發(fā)癥，嚴重可對患者生命造成威脅。一種被認為特別有前景的治療策略是利用脂肪源性干細胞（adiposederived stem cells，ADSCs）。相比較于骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，ADSCs不僅具有相似的基因結構以及相同的分化潛能，能表達相同的表面標志物，且來源廣泛、含量較多、獲取方式簡單、患者承受的痛苦也較少，被認為是BMSCs的替代來源[7]。本文旨在概述ADSCs的特性以及其治療慢性創(chuàng)面的作用機制、基礎研究及可能的臨床應用。

1 ADSCs

脂肪組織被認為是一種能量調節(jié)組織，主要由脂肪細胞組成，除此之外，還包括前脂肪細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞和多種免疫細胞。ADSCs來源于脂肪組織，最早于2001年被Zuk[8]首次從脂肪抽吸物中分離出來，隨后逐漸被發(fā)現具有自我更新能力、多重分化潛能，并具有許多重要生長因子的旁分泌功能[9]。由于人體脂肪組織分布廣泛，來源豐富，因而ADSCs可以從人體脂肪組織中大量分離出來，且供體發(fā)病率低，低溫沉淀可保存六個月以上[10]。目前臨床上獲得ADSCs的兩種最重要的方法是抽脂術和脂肪切除術。相關研究[11]認為抽脂術所使用的局部腫脹麻醉液是導致自體脂肪移植后出現局部壞死、液化和纖維化，存活率較低的關鍵因素。Bian等[12]從細胞形態(tài)、生長動力學、功能等方面比較抽脂術和脂肪切除術所獲取的ADSCs的生物學特性，結果顯示，與抽脂所得的ADSCs相比，脂肪切除術所得ADSCs具有更好的生物學特性。通過不同濃度的利多卡因和腎上腺素處理細胞，顯示其對ADSCs的細胞毒性呈劑量依賴性，降低了ADSCs的活力。獲取脂肪組織片段后，最廣泛使用的分離方法是膠原酶消化，其次是離心。最后，將分離的ADSCs在常規(guī)培養(yǎng)條件下進行增殖，為了獲得純化的ADSCs，通常需進行傳代培養(yǎng)。

ADSCs的特性需要滿足免疫非典型和分化能力標準,國際細胞治療協會(ISCT)和國際脂肪治療與科學聯合會(IFATS)指定了定義ADSCs的三個最低標準：(1)細胞可黏附性；(2)必須表達CD73、CD90、CD105，缺乏CD14、CD11b、CD45、CD19、CD79和人白細胞抗原-dr (HLA-DR)的表達；(3)必須具有分化為前脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞的潛力[13]。

由于ADSCs的多功能性，使其在組織工程和器官再生的應用中越來越受到重視。近年來，相關學者將ADSCs作為再生治療中的新臨床應用，研究包括骨再生、軟骨再生、神經系統修復、肝臟再生、心肌修復、皮膚創(chuàng)面愈合等領域均有令人驚喜的發(fā)現[14]。以骨再生為例，Zhang等[15]將ADSCs注射到小鼠骨折部位及周圍肌肉內，與對照組相比，ADSCs治療增加了骨痂骨膜區(qū)域的血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達、膠原向礦化骨痂的重塑和骨強度。通過增加生長因子的產生刺激血管生成和ADSCs向成骨細胞分化，從而形成新骨并加速骨折修復。

2 ADSCs 在創(chuàng)傷愈合中的作用機制

2.1 增加膠原分泌和沉積

臨床前研究[16]表明，ADSCs通過調節(jié)細胞外基質(extracellular matrix,ECM)蛋白的mRNA水平，增強人真皮成纖維細胞(human dermal fibroblasts,HDFs)中I型膠原的分泌，上調I型膠原、III型膠原和纖連蛋白，下調MMP-1從而促進皮膚創(chuàng)面愈合。Zhou等[17]通過體內實驗證明，與單純注射PBS的小鼠相比，由ADSCs產生的ECM可以更快地促進創(chuàng)面愈合以及I型和III型膠原的表達增加，從而驗證了ADSCs對皮膚創(chuàng)面愈合的積極作用。Shen等[18]利用人ADSCs、殼聚糖支架（PLGA）構建的人工真皮修復鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠創(chuàng)面中發(fā)現與單獨使用支架或不使用支架治療的創(chuàng)面相比，ADSCs/PLGA人工真皮可通過促進血管生成生長因子和真皮膠原合成從而有效促進糖尿病創(chuàng)面愈合。此外，ADSCs不僅能增強成纖維細胞的遷移和增殖，還能抑制增生性瘢痕成纖維細胞中膠原沉積和α-平滑肌肌動蛋白的表達[19]。

2.2 促進上皮化

作為具有分化潛能的干細胞，ADSCs具有上皮化的潛能。Kim等[16]通過體外創(chuàng)面愈合模型得到ADSCs對HDF的遷移具有促進作用。在此基礎上，他們利用動物實驗驗證了ADSCs能顯著減小創(chuàng)面的大小，加速創(chuàng)面邊緣的再上皮化從而促進創(chuàng)面愈合。Altman等[20]研究發(fā)現，人ADSCs通過分化為表皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞促進小鼠皮膚全層缺損創(chuàng)面的上皮化。Ebrahimian等人[21]將ADSCs注入未輻照和輻照小鼠的皮膚穿孔創(chuàng)面。第14天時發(fā)現ADSCs促進輻照和未輻照小鼠皮膚創(chuàng)面愈合，增強創(chuàng)面閉合、黏性和膠原組織分泌。另外，ADSCs在體內與真皮和表皮組織結合，表達表皮標記物K5和K14。在角質形成細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ADSCs可分化為K5和k14陽性細胞，并產生高水平的角化細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)。因此得出ADSCs可通過促進再上皮化參與生理和病理條件下的皮膚創(chuàng)面愈合。

2.3 促新生血管生成

創(chuàng)面內毛細血管的新生是創(chuàng)面愈合或缺血修復過程中必不可少的一步，組織再生需要流動的血液提供氧氣和營養(yǎng)并清除廢物，充足的血液可以改善局部微循環(huán)、減少感染發(fā)生。在成人中，血管發(fā)生和血管新生同時發(fā)生，而VEGF和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)在血管生成因子中起著關鍵作用[22]。Li等人通過實驗證明在缺血環(huán)境下，ADSCs介導后產生的細胞因子通過誘導血管生成促進創(chuàng)面血供恢復[23]。同樣的，Justyna等利用小鼠后肢缺血模型進行實驗，研究表明，ADSCs促進了浸潤性巨噬細胞的形態(tài)變化及其與血管形成的緊密聯系。將ADSCs注入缺血肌肉會影響浸潤細胞（如巨噬細胞、中性粒細胞等）的分布，這些細胞參與血管形成的每個步驟，促進有效的缺血組織新生血管[24]。Mendez等人開發(fā)了一種纖維蛋白配方，允許ADSCs在體外形成管狀結構，此結構可表達內皮細胞標記物，包括CD31、血管內皮細胞鈣黏蛋白以及周細胞標記物NG2。通過評估創(chuàng)面大小、肉芽組織數量和膠原蛋白含量得出ADSCs在硬纖維蛋白凝膠中形成血管，使創(chuàng)面更快愈合[25]。

2.4 免疫調節(jié)

炎癥期的延長是慢性創(chuàng)面形成的一個重要因素，持續(xù)的炎癥期會引起炎癥細胞因子的異常分泌，如中性粒細胞增多；另外，基質金屬蛋白酶（matrix Metalloproteinases，MMPs）分泌的增多及促進創(chuàng)面愈合的重要因子的減少加速了細胞外基質的降解。我們已經知道ADSCs的旁分泌作用可以分泌大量細胞因子，而研究[26]表明，這些細胞因子可以增強ADSCs的血管生成和抗炎因子的分泌。在由葉酸誘導的腎毒性小鼠模型中，接受ADSCs治療的小鼠在治療24小時后表現為血清尿素降低，提示腎功能改善。這些數據通過減少趨化因子表達和減少中性粒細胞浸潤與細胞周期調節(jié)和免疫反應調節(jié)相關。且長達4周的分析表明，ADSCs治療通過減少間質膠原沉積、組織趨化因子和細胞因子的表達證明了腎纖維化和慢性炎癥的減少。因此得出ADSCs治療通過調節(jié)炎癥和細胞周期在腎毒性損傷小鼠模型中發(fā)揮減少腎損傷、改善腎功能，抑制器官纖維化并提供長期免疫調節(jié)的保護作用[27]。

3 ADSCs 應用于慢性創(chuàng)面的基礎研究

Strong等[28]利用小鼠壓瘡創(chuàng)面模擬人類壓瘡狀況，應用同種異體鼠ADSCs進行治療時顯示創(chuàng)面閉合速度增快以及明顯組織學改善。Hamada等[29]利用大鼠建立頭部骨外露模型，取大鼠自身脂肪組織制備ADSCs，分組植入或不植入ADSCs的人工真皮覆蓋后進行觀察，結果顯示ADSCs治療組創(chuàng)面面積縮小速度、創(chuàng)面血管密度及FGF、VEGF表達水平均高于對照組。Kuo等[30]將體外培養(yǎng)的ADSCs局部注射至鏈霉素誘導的糖尿病小鼠的創(chuàng)面邊緣，結果顯示ADSCs治療組創(chuàng)面愈合時間較對照組明顯縮短，且有效降低炎癥反應，促進新生血管生成和組織再生。Cooker等[31]將ADSCs應用在缺血性創(chuàng)面的小鼠上，觀察劃痕實驗結果和創(chuàng)面愈合情況。結果顯示，ADSCs外泌體可促進成纖維細胞遷移，實驗組小鼠的創(chuàng)面愈合速度較對照組明顯增快。

ADSCs聯合生物支架應用于創(chuàng)面也是組織工程用于修復損傷的常用方法。Nambu等[32]將自體ADSCs聯合膠原支架應用于有愈合缺陷的糖尿病db/bd小鼠背部皮膚創(chuàng)面，結果與對照組相比，ADSCs可通過分泌具有生物活性的bFGF、VEGF、血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF）、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)促進再上皮化、毛細血管形成和肉芽組織增生進而加速創(chuàng)面愈合。Shen等[18]將ADSCs接種在聚乙烯-殼聚糖支架中作為人工真皮修復糖尿病創(chuàng)面，發(fā)現其能有效加速創(chuàng)面愈合。Tyeb[33]等人將ADSCs注入涂有層粘連蛋白的抗氧化明膠-絲膠(GS)支架上應用于糖尿病創(chuàng)面大鼠模型，最后驗證結果表明，GSL-ADSCs在蘇木精和伊紅、Masson等染色中與其他對照組相比較具有更好的創(chuàng)面組織再生和膠原重塑能力，且免疫組化CD31染色顯示血管新生增強。此外，近期有學者利用3D生物技術打印了一種高效的載ADSCs和一氧化氮（NO）的水凝膠支架（3D ADSCs/NO）應用于嚴重燒傷創(chuàng)面。通過小鼠燒傷創(chuàng)面模型實驗表明，3D-ADSCs/NO通過促進上皮化和膠原沉積加快創(chuàng)面愈合。由于3D生物系統中ADSC中VEGF-mRNA的上調致使CD31免疫組織化學顯示新生血管增多。這些發(fā)現表明3D-ADSC/NO水凝膠支架可通過VEGF信號通路增加新生血管，從而促進嚴重燒傷創(chuàng)面愈合[34]。

除支架材料外，細胞膜片同樣是近年興起的一種組織工程新技術。Cerqueira等[35]使用人ADSCs薄片移植到具有延遲愈合的全層切除小鼠皮膚傷口中。實驗發(fā)現，此細胞薄片可以促進小鼠創(chuàng)面的神經血管化和上皮形成，創(chuàng)面愈合速度較對照組明顯增快。Rezapour-Lactoee等[36]將ADSCs在體外條件下置于熱響應性敷料膜表面使其生長，隨后把帶有其分泌的ECM細胞薄片轉移到受損皮膚上。結果顯示ADSCs治療組的傷口閉合率較高。對于這組大鼠，根據組織學和免疫組化分析結果表明，其新表皮長度，再上皮化層厚度，新生血管和毛細血管密度均明顯優(yōu)于對照組。此外，ADSCs聯合PRP也已被證實具有協同促進作用，Ni等[37]將ADSCs聯合PRP應用于SD大鼠背部糖尿病創(chuàng)面模型，實驗結果表明，與ADSCs、PRP和陰性對照組相比，ADSCPRP組VEGF、p-STAT3、SDF-1表達水平更高，創(chuàng)面愈合速度更快。ADSCs與PRP聯合處理可強烈刺激內皮細胞增殖從而促進創(chuàng)面新生血管形成。

4 ADSCs 促進慢性創(chuàng)面愈合的臨床應用

隨著ADSCs治療創(chuàng)面機制研究的進展及提取技術的成熟，ADSCs應用于慢性創(chuàng)面的治療研究逐漸向臨床轉化。Lee等[38]進行了一項初步研究，利用ADSCs對15例患有嚴重肢體缺血的患者進行多點肌內注射，在長達六個月的隨訪時間內無并發(fā)癥出現。66.7%（10例）的患者出現了臨床改善，包括疼痛評分和跛行行走距離。此外，ADSCs應用前及應用后6個月數字減影血管造影顯示有大量的血管側支網形成。因此他們認為，對于其他治療方式難以治療的肢體缺血患者，多次肌內注射ADSCs可能是一種安全的選擇。另一項類似的研究來源于Bura等學者[39]招募了7名非血管重建性肢體缺血(CLI)患者，抽取腹部脂肪培養(yǎng)ADSCs并將其肌肉注射到患者缺血腿部，同樣無并發(fā)癥出現。結果提示大多數患者潰瘍演變和創(chuàng)面愈合均有改善，且經皮氧壓有增加趨勢。Stasch等[40]對26例下肢慢性創(chuàng)面的患者進行手術清創(chuàng)和自體脂肪移植，25處創(chuàng)面中有22處在平均68.0±33.0天內完全愈合。平均4周后，創(chuàng)面大小減少了50%，此方法為其他介入治療失敗的糖尿病足和有外周血管疾病背景的下肢慢性創(chuàng)面提供了一種簡單而有用的選擇。Piccolo等[41]通過科爾曼技術使用脂肪移植輔助治療燒傷創(chuàng)面、靜脈潰瘍、糖尿病潰瘍，證明了注射到疤痕下的脂肪、注射到傷口下、傷口周圍和骨折線或空間內的脂肪以及沉積在傷口上的脂肪的再生效果。上述研究盡管在研究設計、基礎條件及應用方法等方面存在顯著差異，但均顯示ADSC是安全的，有促進慢性創(chuàng)面愈合并減輕疼痛的潛力?？傮w而言，目前大多數臨床試驗處于早期階段，且樣本量較小，ADSCs應用于慢性創(chuàng)面的安全性及有效性仍需大樣本量臨床應用進一步驗證。

5 問題及展望

本綜述所包括的研究均表明ADSCs在慢性創(chuàng)面愈合中具有良好的治療潛力。但仍存在一些問題，譬如目前較多的研究來自于動物模型，而鼠、兔等實驗動物與人體有明顯差異，如何構造與人體結構更為相似的動物模型有待進一步研究；雖然脂肪組織分布較廣，獲取方法簡便且損傷小，但存活率不高，隨著對脂肪機制的深入了解，研究者利用物理方法去除脂肪細胞，留下作用于創(chuàng)面修復的高濃度血管基質成分如納米脂肪(Nanofat)、血管基質成分凝膠(SVF-gel)，并且通過臨床應用發(fā)現均有效促進慢性創(chuàng)面愈合，但樣本量同樣較少，且目前尚未見其與直接利用ADSCs對比的相關報道，無法明確通過物理方法獲取的脂肪衍生物是否對慢性創(chuàng)面有更好的臨床效果；另外，慢性創(chuàng)面主要威脅伴有糖尿病等慢性病的中老年人，由于糖尿病持續(xù)存在的高血糖和糖基化產物使ADSCs分泌功能受損，從而影響ADSCs附著及增殖能力，導致其對創(chuàng)面的作用減弱，因此，糖尿病ADSCs功能受損的機制及同種異體ADSCs移植也是今后探討的方向；還有，由于ADSCs具有自我復制及多向分化潛能，與腫瘤細胞特性相似，盡管目前的基礎及臨床應用暫未發(fā)現其與腫瘤的發(fā)生相關，也沒有明確的研究證據表明其無致瘤性，仍有待進一步證實。

綜上所述，目前ADSCs在治療慢性創(chuàng)面上已經取得了一定的成果，但包括ADSCs促進創(chuàng)面愈合的機制、ADSCs的獲取及移植、達到治療效果時ADSCs的所需量以及慢性創(chuàng)面的治療方式選擇等均未達成共識，這是未來的研究方向?？偠灾珹DSCs在治療慢性創(chuàng)面上的潛能毋庸置疑，我們靜候其佳音。