NLRP3炎性小體及其在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征中的研究進(jìn)展*

高志丹，金 娟，黃翠萍

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部健康醫(yī)學(xué)院)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是由各種肺內(nèi)、外致病因素(如肺炎、敗血癥、休克、呼吸道細(xì)菌或病毒感染)導(dǎo)致的急性、彌漫性、炎癥性肺損傷，進(jìn)而引起嚴(yán)重的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[1]。由于缺少特效藥和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，ALI/ARDS的發(fā)病率和死亡率在全世界都很高[2]。特別是新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)正在全球肆虐，重者也可引發(fā)嚴(yán)重呼吸窘迫綜合征。肺部炎癥反應(yīng)已被認(rèn)為在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的ALI中起著至關(guān)重要的作用[3]。大量炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生是肺部炎癥反應(yīng)進(jìn)展的重要因素[4]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding domain-like receptor protein 3,NLRP3)是細(xì)胞內(nèi)主要的炎癥通路，參與先天免疫反應(yīng)。有研究表明[5]，NLRP3炎性小體及其調(diào)控機(jī)制在ALI/ARDS的病理過程中發(fā)揮了重要作用。由此提示，防治ALI/ARDS的方法之一可能是針對(duì)NLRP3炎性小體的靶向治療。

1 NLRP3炎性小體

1.1 NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)

炎性小體是由胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRRs)參與組裝的多蛋白復(fù)合物，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。炎性小體能夠識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)，包括細(xì)菌、病毒、真菌、細(xì)胞外ATP、生物晶體(尿酸鹽、膽固醇等)和凋亡的細(xì)胞成分。NOD樣受體家族(nod-like receptors,NLRs)包括14名成員，即NLRP1至NLRP14，其中一些參與炎性小體的組裝，包括NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP6、NLRP7和NLRP12[6]。NLRP3炎性小體是先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)多蛋白復(fù)合物，主要由NLRs家族成員之一的NLRP3，銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白(apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD domain,ASC)和反射蛋白pro-caspase-1組成。 NLRP3主要含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域：N末端熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain,PYD),主要負(fù)責(zé)傳遞危險(xiǎn)信號(hào)；C末端亮氨酸富集重復(fù)域(leucine-rich-repeat domain，LRR)，主要負(fù)責(zé)識(shí)別PAMPs或DAMPs等危險(xiǎn)信號(hào)；中心段含特異性核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide binding and oligomerization domain,NOD)，又稱NACHT結(jié)構(gòu)域，是炎性小體的主要結(jié)構(gòu)。

1.2 NLRP3炎性小體的功能

當(dāng)NLRP3被PAMPs和DAMPs激活時(shí)，NLRP3發(fā)生寡聚化使PYD發(fā)生聚合，招募含有PYD和胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain,CARD)的接頭蛋白ASC。ASC通過CARD結(jié)構(gòu)域招募pro-caspase-1,促進(jìn)pro-caspase-1的二聚化和近端誘導(dǎo)的蛋白水解過程，使其變成兩個(gè)亞基(P10、P20)，從而激活具有酶活性的異二聚體caspase-1，形成活化的NLRP3炎性小體。活化后的NLRP3炎性小體可介導(dǎo)促炎作用的pro-IL-1β和pro-IL-18的剪切成熟，將其加工成為有致炎作用的炎性因子IL-1β和IL-18，并釋放至細(xì)胞外，進(jìn)一步啟動(dòng)下游信號(hào)通路，最終介導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生[7]。

2 NLRP3炎性小體的活化

炎性小體的活化是復(fù)雜的，在大多數(shù)細(xì)胞類型中，微生物刺激并不能直接激活NLRP3炎性小體。而是在ATP、成孔毒素或顆粒物質(zhì)誘導(dǎo)NLRP3激活之前，需要微生物刺激或細(xì)胞因子對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，為其活化做準(zhǔn)備。經(jīng)典NLRP3炎性小體的激活主要包括啟動(dòng)和組裝活化兩個(gè)步驟。

2.1 NLRP3炎性小體的啟動(dòng)階段

NLRP3炎性小體是通過啟動(dòng)NLRP3基因的轉(zhuǎn)錄來啟動(dòng)細(xì)胞，這是NLRP3炎性小體完全激活的第一個(gè)信號(hào)步驟。微生物或內(nèi)源性分子通過啟動(dòng)NLRP3基因的轉(zhuǎn)錄來激活并參與Toll樣受體4(Toll-like receptor-4,TLR4)信號(hào)通路介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa-B,NF-κB)入核而產(chǎn)生機(jī)制，進(jìn)而調(diào)控NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，為其激活做準(zhǔn)備[8]。有研究表明[9]，AKT作為PI3K的主要下游效應(yīng)因子，在其激活后調(diào)節(jié)了許多細(xì)胞功能，它能通過激活I(lǐng)KB激酶，促進(jìn)NF-κB從細(xì)胞質(zhì)釋放并向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而激活靶基因，提高靶蛋白的轉(zhuǎn)錄水平。由此提示，PI3K/AKT與NLRP3炎性小體的啟動(dòng)步驟密切相關(guān)。

2.2 NLRP3炎性小體的組裝和活化階段

NLRP3炎性小體的激活作為第二個(gè)步驟是由ATP、成孔毒素、病毒RNA或顆粒物質(zhì)引起的，通過DAMPs和PAMPs模式作用于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Nod樣受體(NOD-like receptor,NLR)作為第二信號(hào)，最終介導(dǎo)NLRP3炎性小體各組分(NLRP3、ASC、pro-caspase-1)的組裝及活化，完成IL-1β、IL-18等促炎因子的加工及分泌[10]，從而誘導(dǎo)NLRP3-ASC-caspase-1復(fù)合物的形成。NLPR3炎性小體的活化方式主要包括離子通道、溶酶體破裂和線粒體損傷三種經(jīng)典途徑。

2.2.1 離子通道活化途徑

研究發(fā)現(xiàn)[11],在樹突狀細(xì)胞中刺激因子可通過介導(dǎo)Syk-JNK信號(hào)通路，促使K+釋放，進(jìn)而促進(jìn)NLRP3炎性小體被激活。另外，在非經(jīng)典炎性小體的激活過程中，caspase-1作用于Gasdermin D(GSDMD)蛋白或Pannexin-1(PANX1)膜孔蛋白，使質(zhì)膜產(chǎn)生穿孔通道或非選擇性通道，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外離子濃度的高低致使NLRP3炎性小體的活化[12]。同時(shí)，質(zhì)膜上的相關(guān)受體能夠與刺激物結(jié)合，在內(nèi)吞作用下向胞質(zhì)溶膠中釋放應(yīng)激信號(hào)，從而誘導(dǎo)K+外排或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放致使NLRP3炎性小體的激活[13]。一般認(rèn)為，NLRP3不直接與刺激相互作用，而是通過感知細(xì)胞內(nèi)的低K+信號(hào)來激活炎性小體。有報(bào)道表明[14]，nek7是NLRP3在K+外排作用下被激活的重要偶聯(lián)蛋白。

2.2.2 溶酶體破裂途徑

溶酶體內(nèi)含有多種水解酶，是一種分解生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸、多糖等)的細(xì)胞器，它不僅能分解外界進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，也能分解細(xì)胞自身的局部大分子物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)[15],顆?；蚓w物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)與溶酶體膜透化(lysosomal membrane permeabilization,LMP)和多種溶酶體組織蛋白酶(如組織蛋白酶B等)反應(yīng)降低溶酶體膜穩(wěn)定性，破壞溶酶體膜，使溶酶體蛋白水解酶-B(cathepsin-B)進(jìn)入胞漿內(nèi)，最終激活NLRP3炎性小體。

2.2.3 線粒體損傷途徑

氧化應(yīng)激是由于活性氧(reactive oxygen species,ROS)的持續(xù)產(chǎn)生，使機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)能力超載，導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)損傷而產(chǎn)生的反應(yīng)。Nrf2作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，已被廣泛應(yīng)用于抑制氧化應(yīng)激和由此產(chǎn)生的炎癥的啟動(dòng)子。當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)抗氧化酶(SOD、GSH)和抗氧化基因(HO-1、NQ-O1、GCLM)的轉(zhuǎn)錄，最終減輕氧化損傷[16]；另外，細(xì)菌感染會(huì)引起線粒體損傷，并導(dǎo)致線粒體活性氧(mtROS)和線粒體DNA(mtDNA)的累積和釋放。線粒體自噬缺陷導(dǎo)致mtROS積累，mtROS誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的過度激活，然后觸發(fā)caspase-1依賴性焦亡。我們之前的研究表明NLRP3炎性小體的激活和肺泡巨噬細(xì)胞的焦亡是炎癥反應(yīng)的重要驅(qū)動(dòng)因素[17]，提示NLRP3炎性小體的激活可能與自噬密切相關(guān)。

3 脂多糖(LPS)模型

脂多糖(LPS)，又稱內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要活性成分，其在正常情況下是無毒的，當(dāng)受到刺激或細(xì)菌死亡時(shí)釋放游離的LPS是有毒的，會(huì)引起機(jī)體炎癥反應(yīng)(如肺泡細(xì)胞病變、肺泡水腫、免疫細(xì)胞數(shù)量增加等)。LPS被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)ALI小鼠肺部炎癥模型，在動(dòng)物模型中，暴露于LPS可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞募集，并增加促炎分子的表達(dá)。同時(shí)，LPS也是NLRP3炎性小體激活劑，可通過NLRP3炎性小體在LPS誘導(dǎo)的ALI中誘導(dǎo)caspase-1活化和IL-1β成熟。有研究表明[18]，在LPS被TLR4受體識(shí)別后，IRAK4和IRAK1被髓樣分化因子88(MYD88)信號(hào)復(fù)合物招募，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長因子β激酶1(AKT1)、IKK-α、IKK-β的激活，繼而引起IκB-α磷酸化降解和NFκB的活化。LPS刺激還促使髓過氧化物酶(MPO)和丙二醛(MDA)的形成，降低抗氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的含量[19]。

4 NLRP3炎性小體與急性肺損傷

如前所述，NLRP3可被多種信號(hào)激活，包括PAMPs、DAMPs和細(xì)菌毒素，NLRP3的激活導(dǎo)致炎性小體的組裝，炎性小體是激活caspase-1的多蛋白復(fù)合物，它在蛋白水解成熟和釋放促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18過程中是必不可少的。雖然NLRP3炎性小體的激活在驅(qū)動(dòng)急性肺部炎癥和幫助清除病毒和細(xì)菌感染方面至關(guān)重要，但刺激物持續(xù)激活NLRP3會(huì)導(dǎo)致IL-1β的產(chǎn)生。它增加了流感或其他病毒感染后繼發(fā)細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，提示NLRP3炎性小體與急性肺損傷的發(fā)展密切相關(guān)。

4.1 NLRP3炎性小體在ALI中促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生

當(dāng)器官不能嚴(yán)格調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，促炎性細(xì)胞因子分泌過多，致使自身免疫性炎癥、組織損傷或慢性炎癥等多種生理疾病的發(fā)生。因此，維持促炎性細(xì)胞因子的平衡在治療ALI中至關(guān)重要。IL-1β是關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，不僅導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，更重要的是可以誘導(dǎo)一系列的促炎細(xì)胞因子及黏附分子的產(chǎn)生并加重肺部炎癥的發(fā)展。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[20]，在膿毒癥引發(fā)的ALI中，IL-1β、IL-18、TNF-α等炎性因子的表達(dá)增高，提示NLRP3炎性小體的激活會(huì)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，且它們的表達(dá)水平與病情嚴(yán)重程度及病死率呈正相關(guān)。此外有文獻(xiàn)報(bào)道[21],干預(yù)高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)是ALI中的重要中介物，NLRP3和ASC/caspase-1/IL-1β信號(hào)通路促進(jìn)HMGB1的產(chǎn)生和釋放。上述研究表明，NLRP3炎性小體通過調(diào)控促炎細(xì)胞因子的分泌來影響ALI的發(fā)生和發(fā)展。

4.2 NLRP3炎性小體增加肺泡上皮通透性

ALI的生理特性是肺泡-毛細(xì)血管膜屏障的破壞，導(dǎo)致非心源性肺水腫的發(fā)生，其中蛋白滲出物會(huì)淹沒肺泡間隙，妨礙氣體交換，進(jìn)而導(dǎo)致呼吸衰竭。越來越多的證據(jù)表明[22]，當(dāng)NLRP3炎性小體被激活時(shí)，中性粒細(xì)胞也會(huì)在肺部積聚并釋放促炎細(xì)胞因子和中性粒細(xì)胞胞外陷阱(NETs)，從而通過NETs來捕獲病原體。當(dāng)肺上皮，特別是Ⅱ型肺泡細(xì)胞被這些細(xì)胞及其產(chǎn)物破壞后，會(huì)導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管界面的破壞和微血管通透性的增加。這種情況往往發(fā)生于肺炎、胃誤吸、吸入煙霧和有毒氣體、PM、再灌注和嚴(yán)重膿毒癥等因素中。提示，NLRP3炎性小體在ALI中使肺泡上皮的通透性提高。

4.3 NLRP3炎性小體促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集

活化的中性粒細(xì)胞可直接誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷，破壞基底膜，導(dǎo)致血管滲漏，最終引起肺水腫。此外，中性粒細(xì)胞的減少可明顯減輕動(dòng)物模型中ALI的嚴(yán)重程度。關(guān)于NLRP3炎性小體與中性粒細(xì)胞募集的關(guān)系，有報(bào)道稱[21]，NLRP3在肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中表達(dá)明顯，而在肺泡上皮中不表達(dá)。 NLRP3基因敲除小鼠也能抵抗高氧誘導(dǎo)的ALI和肝臟缺血-再灌注損傷，因?yàn)槠錅p少了中性粒細(xì)胞的遷移和組織損傷[23]。還有研究發(fā)現(xiàn)[24]，NLRP3敲除或caspase-1抑制可以減弱因敗血癥誘導(dǎo)的腎中性粒細(xì)胞的浸潤。這些都提示NLRP3炎性小體的過度激活可能會(huì)促進(jìn)ALI中中性粒細(xì)胞的募集。

5 小結(jié)與展望

新生兒急性肺損傷是臨床上常見的新生兒急重癥,因此，尋找有效的診斷方式對(duì)新生兒來說具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)[25]，血小板活化因子(PAF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、肺表面活性蛋白A(SP-A)在新生兒急性肺損傷中均表達(dá)異常，提示炎癥反應(yīng)的發(fā)生伴隨炎癥因子的大量釋放。臨床上，中藥被廣泛用于治療ALI/ARDS，不僅褪黑素可通過抑制NLRP3炎性小體的表達(dá)，中藥成分蒼術(shù)苷也可通過抑制NLRP3炎癥小體被激活，繼而減輕脂多糖誘導(dǎo)的ALI[26]，提示中藥成分研究可作用于NLRP3/ASC/caspase-1軸，為ALI/ARDS的治療提供新思路。

本文主要闡述了NLRP3炎性小體的組成和其在ALI/ARDS發(fā)生和發(fā)展中的作用。大量研究表明NLRP3炎性小體與ALI/ARDS存在緊密聯(lián)系， NLRP3炎性小體上游和下游通路的任何蛋白及炎性因子的表達(dá)失調(diào)都可能引起肺部炎癥反應(yīng)。NLRP3炎性小體在不同的ALI模型中被不同的刺激因素激活，可以使pro-caspase-1通過自身酶解形成具有活性的caspase-1，一旦其被激活，caspase-1可以通過剪切的方式活化pro-IL-1β和pro-IL-18，從而使大量成熟的IL-1β和IL-18得以釋放， 炎癥反應(yīng)迅速擴(kuò)大，肺泡上皮通透性增加。 NLRP3是一種重要的炎性小體，NLRP3炎性小體的激活是如何參與ALI的發(fā)生，NLRP3多蛋白復(fù)合物是否會(huì)受到基因等因素的調(diào)控，還需進(jìn)一步研究。未來的研究重點(diǎn)可能在于對(duì)NLRP3炎性小體上游分子的探索和對(duì)NLRP3炎性小體組裝的特異性干預(yù)。隨著多種針對(duì)NLRP3炎性小體的研究被發(fā)現(xiàn)，靶向藥物抑制NLRP3炎癥通路或?qū)⒊蔀榉乐畏尾考膊〉闹匾较颉?/p>