吳佰林,尤亮亮,賈曉玲,邵偉平,安保森
青島新希望琴牌乳業(yè)有限公司(青島 266300)
除人類母乳以外,牛奶是一種營(yíng)養(yǎng)成分最齊全、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的液體食品,被稱為白色血液。牛奶營(yíng)養(yǎng)全面,含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類以及多種氨基酸,鈣、磷、鐵等微量元素,其維生素、酶和抗體等也非常豐富,易被人體消化、吸收和利用。然而,牛奶富含乳糖,因此其也是一種易引起過(guò)敏反應(yīng)的食品。過(guò)敏反應(yīng),是指機(jī)體受到同一種抗原再次刺激后所產(chǎn)生的一種組織損傷或生理功能紊亂的特異性免疫反應(yīng)。過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率在不同人群中存在差異,通常情況下兒童的過(guò)敏率要明顯高于成年人。有報(bào)道顯示,我國(guó)兒童過(guò)敏發(fā)生率為5.83%,其在性別上無(wú)明顯差異,但在地域上存在顯著性差異。拉薩市兒童過(guò)敏發(fā)生率最低,僅為2.33%,青島市兒童過(guò)敏發(fā)生率最高,為9.11%,這可能與青島當(dāng)?shù)叵矚g食用海產(chǎn)品有關(guān)[1]。近年來(lái),食品過(guò)敏原研究進(jìn)展的介紹相對(duì)較多,主要集中在農(nóng)副產(chǎn)品上,而有關(guān)牛奶及乳制品過(guò)敏原的綜述較少。通過(guò)歸納牛奶中主要過(guò)敏原的理化性質(zhì)及特點(diǎn),總結(jié)牛奶中主要過(guò)敏原的檢測(cè)技術(shù)及研究進(jìn)展,介紹牛奶過(guò)敏原的消減技術(shù),以期為牛奶過(guò)敏原的消減控制提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。
奶及奶制品是一類易引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的食品。一方面,因?yàn)槟讨破分泻写罅康睦业鞍?、乳白蛋白和乳球蛋白;另一方面,這些蛋白在人乳和牛乳中含量存在差異,此類蛋白能引發(fā)機(jī)體出現(xiàn)皮膚病、胃腸道不適、哮喘等癥狀。人乳和牛乳主要蛋白組成及其含量的差異情況如表1所示。
表1 人乳和牛乳主要蛋白組成 單位:mg/mL
從表1可以看出,牛乳和人乳蛋白在組成成分上具有較大的相似性,但兩者在各組分的含量方面存在較大差異。有報(bào)道顯示牛奶中的主要過(guò)敏蛋白為α-s1-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。
牛乳蛋白中的主要成分為α-s1-酪蛋白,是一種由199個(gè)氨基酸組成的高度磷酸化蛋白,可促進(jìn)金屬離子在人體內(nèi)的吸收。由于該蛋白不存在于母乳中,但廣泛存在于哺乳動(dòng)物的乳汁中,使得部分嬰幼兒在飲用相關(guān)奶制品后出現(xiàn)過(guò)敏癥狀。因此,α-s1-酪蛋白被認(rèn)為是牛乳中一種主要的過(guò)敏原。
作為一種天然的乳清蛋白,α-乳白蛋白屬于小分子蛋白,其是唯一能與鈣結(jié)合的乳清蛋白,廣泛分布于人和哺乳動(dòng)物的乳汁中。α-乳白蛋白的含量為牛奶總?cè)榍宓鞍椎?9%左右,與人乳氨基酸組成相同率達(dá)到74%,亦有6%組成與人乳極為相似,因此α-乳白蛋白的穩(wěn)定性較好,可作為人體必需氨基酸和多種支鏈氨基酸的理想蛋白來(lái)源。
另外,牛奶中的β-乳球蛋白是具有A、B、C三種結(jié)構(gòu)的一類蛋白,三種結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與體系pH具有很大的關(guān)系,其占總蛋白的7%~12%。研究表明在降低膽固醇與抗氧化等生理功能方面,β-乳球蛋白水解的產(chǎn)物和分子修飾物具有重要作用。此外,有報(bào)道顯示β-乳球蛋白還可以發(fā)揮免疫球蛋白的類似功能。然而,該類蛋白不存在于人乳中,且嬰兒的消化系統(tǒng)發(fā)育尚不完全,因此β-乳球蛋白易引起嬰兒的過(guò)敏反應(yīng)。
目前,關(guān)于牛奶蛋白過(guò)敏原檢測(cè)的技術(shù)可以歸納為蛋白水平-免疫學(xué)檢測(cè)和基因水平-分子生物學(xué)檢測(cè)。其中,蛋白水平-免疫學(xué)檢測(cè)主要包括酶聯(lián)免疫吸附法和免疫層析技術(shù),基因水平-分子生物學(xué)檢測(cè)主要為實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。
2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附法
酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一種根據(jù)酶聯(lián)免疫原理,利用抗原抗體特異性結(jié)合的檢測(cè)方法。ELISA技術(shù)通過(guò)連接到抗體上的酶對(duì)結(jié)合的抗原和抗體進(jìn)行檢測(cè);檢測(cè)過(guò)程中無(wú)色底物變成顯色產(chǎn)物,從而指示存在抗原-抗體復(fù)合物[2]。近年來(lái),越來(lái)越多的ELISA檢測(cè)牛乳中蛋白過(guò)敏原的方法被建立,包括α-s1-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白[3-5]。高淑霞[6]分別制備了抗牛乳全蛋白和β-乳球蛋白的兔多克隆抗體和鼠多克隆抗體,通過(guò)優(yōu)化檢測(cè)條件以及抗體校價(jià)和制備標(biāo)曲等,分別建立了針對(duì)牛乳全蛋白和β-乳球蛋白的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。潘麗[7]利用金磁酶聯(lián)免疫法檢測(cè)牛乳過(guò)敏原酪蛋白和α-乳白蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種方法的特異性、精密度和穩(wěn)定性均較好,對(duì)CN和α-LA的回收率分別達(dá)到82%~105%和87.1%~111%,滿足CN/α-LA檢測(cè)的相關(guān)要求,對(duì)于食品安全檢測(cè)具有重要的實(shí)踐意義。ELISA不僅在牛奶過(guò)敏原檢測(cè)中具有實(shí)際應(yīng)用,還用于其他食品過(guò)敏原的檢測(cè)。張潔瓊等[8]利用提取的中國(guó)甜杏仁的過(guò)敏原蛋白、苦杏仁球蛋白分別制備兔和鼠的多克隆抗體,以此建立了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法,結(jié)果表明該方法不僅檢測(cè)限低且特異性良好。隨后利用該方法檢測(cè)法式小面包、餅干和脫脂牛乳中杏仁過(guò)敏原,結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦杏仁球蛋白的添加回收率達(dá)到78.94%~125.15%,并且均得到低于5.81%的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。這些研究表明ELISA方法不僅已經(jīng)較好地應(yīng)用于牛乳蛋白過(guò)敏原和其他食品過(guò)敏原的檢測(cè)當(dāng)中,而且具有高效準(zhǔn)確等特點(diǎn),檢測(cè)效果良好。
2.1.2 免疫層析技術(shù)
免疫層析法(immunochromatography as say,ICA),其原理是把特異抗體先固定在硝酸纖維素膜上的某一區(qū)域,檢測(cè)時(shí)干燥硝酸纖維素的一端浸入待測(cè)樣品后,利用毛細(xì)管作用,樣品會(huì)沿著膜向前移動(dòng),直至移動(dòng)到有抗體固定的區(qū)域,樣品中對(duì)應(yīng)的抗原與抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合,進(jìn)一步用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯色,從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。免疫層析法在乳制品過(guò)敏原檢測(cè)方面的研究相對(duì)較少,但在其他食品過(guò)敏原檢測(cè)的應(yīng)用十分廣泛[9]。李夢(mèng)銀[10]制備及鑒定了小清蛋白單克隆抗體,進(jìn)而制備了金磁復(fù)合納米微粒,最后建立了小清蛋白金磁ICA檢測(cè)方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)小清蛋白金磁ICA試紙條定量檢測(cè)可以通過(guò)建立T/C比值的定量方法提高檢測(cè)靈敏度。吉坤美等[11]報(bào)道了一種用于檢測(cè)食品中花生蛋白成分的簡(jiǎn)易快速膠體金免疫層析法(GICA),通過(guò)自制花生抗原標(biāo)準(zhǔn)品,檢測(cè)GICA方法的靈敏度,并檢測(cè)19種食品花生蛋白含量。結(jié)果表明:GICA測(cè)試條與花生蛋白抗原呈特異性反應(yīng),檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度為50 ng/mL,且檢測(cè)結(jié)果與所檢食品過(guò)敏原標(biāo)識(shí)基本一致。此外,劉悅[12]建立了單一檢測(cè)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、杏仁過(guò)敏原蛋白、花生過(guò)敏原蛋白的GICA試紙條,以此為基礎(chǔ)又建立了能同時(shí)檢測(cè)杏仁、花生兩種堅(jiān)果過(guò)敏原蛋白的GICA試紙條,結(jié)果表明該方法操作便捷、結(jié)果易讀,可應(yīng)用于大量樣品的快速檢測(cè)。
2.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)
實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)(quantitative real-time PCR,qPCR)是基于熒光化學(xué)物質(zhì)來(lái)測(cè)定每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法,是用于檢測(cè)食品過(guò)敏原最為廣泛采用的檢測(cè)方法之一[13]。賈敏等[14]報(bào)道,運(yùn)用qPCR檢測(cè)牛奶中β-乳球蛋白質(zhì)的含量,標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值與檢測(cè)模板濃度的線性關(guān)系良好,其相關(guān)系數(shù)為0.997 8,運(yùn)用此方法檢測(cè)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定性好等特性,組內(nèi)和組間的變異系數(shù)均小于5%。檢測(cè)10種食品牛奶過(guò)敏原,結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果與標(biāo)簽描述吻合,說(shuō)明所建立的qPCR方法可用于檢測(cè)食品中牛奶過(guò)敏原β-乳球蛋白質(zhì)含量。qPCR不僅用于牛奶過(guò)敏原的檢測(cè),還廣泛應(yīng)用于其他食品過(guò)敏原的檢測(cè)。尚柯等[15]構(gòu)建了小麥和榛子的過(guò)敏原基因數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢特異性序列并設(shè)計(jì)定量引物,建立了一種快速、便捷、高效的檢測(cè)過(guò)敏原的方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)應(yīng)過(guò)敏原成分鑒定能夠達(dá)到理想效果,檢出限為1%,且重復(fù)性好,準(zhǔn)確率高。此外,張舒亞等[16]將大豆過(guò)敏蛋白P34作為靶標(biāo),利用TaqMan探針qPCR技術(shù)建立了大豆成分過(guò)敏原的檢測(cè)方法。研究顯示建立的檢測(cè)方法檢測(cè)限為10 mg/kg,特異性和靈敏度較好。這些研究表明qPCR方法已經(jīng)較好地應(yīng)用于牛乳蛋白過(guò)敏原和其他食品過(guò)敏原的檢測(cè)當(dāng)中。
2.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)作為一種全新的擴(kuò)增核酸的方法,其可以在等溫條件下短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增[17]。LAMP技術(shù)進(jìn)行基因擴(kuò)增,具有簡(jiǎn)便、快速、精確和低廉等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)檢測(cè)。Kim等[18]將LAMP技術(shù)用于同時(shí)檢測(cè)牛奶和山羊奶的雙重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增測(cè)定法,檢測(cè)時(shí)間縮短至30 min,山羊奶、山牛奶的檢測(cè)限可分別達(dá)到2%,不像普通PCR方法需要進(jìn)行凝膠電泳觀察結(jié)果,LAMP技術(shù)是一種適合現(xiàn)場(chǎng)、基層快速檢測(cè)的方法。LAMP技術(shù)還被廣泛應(yīng)用于其他食品過(guò)敏原的檢測(cè)。張懿翔等[19]利用LAMP方法檢測(cè)食品中的過(guò)敏原牡蠣成分,結(jié)果檢測(cè)出0.01 ng/μL的DNA待測(cè)樣品中含有0.1%的牡蠣成分,大幅縮短檢測(cè)用時(shí)。程晉霞等[20]建立了LAMP檢測(cè)食品過(guò)敏原芥末成分,并與qPCR檢測(cè)方法進(jìn)行比較,結(jié)果表明LAMP的檢測(cè)靈敏度與qPCR相當(dāng),為0.5%。
根據(jù)脫敏機(jī)理進(jìn)行分類,國(guó)內(nèi)外主要將脫敏方法分為3種:物理消減技術(shù)、化學(xué)消減技術(shù)及生物消減技術(shù)。物理消減技術(shù)主要包括熱處理、輻照、超聲等方法;化學(xué)消減技術(shù)主要包括糖基化法;生物消減技術(shù)主要包括酶解法。
3.1.1 熱處理
蛋白質(zhì)的功能主要由其結(jié)構(gòu)特性決定,因此蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象一旦發(fā)生改變,就意味著其功能的變化。熱處理會(huì)使得蛋白質(zhì)變性,且變性程度隨著加熱溫度不同進(jìn)而發(fā)生變化,中等溫度的熱變性會(huì)不同程度降低蛋白質(zhì)的生物活性,較高溫度的熱變性會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物活性完全喪失[21]。Bu等[22]研究不同溫度下熱處理對(duì)牛乳過(guò)敏原β-乳球蛋白的致敏性變化,結(jié)果表明加熱至90 ℃時(shí)會(huì)促進(jìn)β-乳球蛋白分子展開,使構(gòu)象表位暴露面積增大,對(duì)蛋白水解的敏感性增強(qiáng),從而導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)的增加。但當(dāng)加熱溫度升高至100℃和120 ℃時(shí),其可掩飾或者破壞構(gòu)象表位并降低變應(yīng)原性。吳序櫟[23]將熱處理應(yīng)用于β-乳球蛋白消減技術(shù)的研究,并對(duì)比了β-乳球蛋白在單一預(yù)熱處理和預(yù)熱處理后與結(jié)合沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的免疫反應(yīng)情況,結(jié)果表明預(yù)熱處理后β-乳球蛋白與EGCG結(jié)合,并且結(jié)合能力增強(qiáng)。此外,蛋白免疫反應(yīng)性的降低程度大于單一的熱處理蛋白。史曉霞等[24]報(bào)道了蛋清卵類粘蛋白在熱處理下過(guò)敏原性和構(gòu)象的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵類粘蛋白熱處理后降低了過(guò)敏原性,且隨溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng),過(guò)敏原性不斷降低。
3.1.2 輻照
研究顯示輻照可以造成蛋白質(zhì)氨基酸間的斷裂、交聯(lián)以及分子構(gòu)象變化,引起過(guò)敏原表位發(fā)生破壞,進(jìn)而影響過(guò)敏原與相應(yīng)抗體的結(jié)合能力,改變過(guò)敏原的致敏性,因此,輻照有可能成為降低或消除食物過(guò)敏反應(yīng)的重要技術(shù)[25]。孫軒夷[26]選取牛乳α-乳白蛋白為模式蛋白,利用輻照加工處理α-乳白蛋白,評(píng)估α-乳白蛋白加工前后致敏性的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)輻照使α-乳白蛋白的致敏性明顯降低。白雨鑫等[27]利用輻照對(duì)牛乳β-乳球蛋白進(jìn)行處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)輻照加工后β-乳球蛋白可以形成聚合物,同時(shí)蛋白變?yōu)闊o(wú)序結(jié)構(gòu),表面的疏水性和色氨酸熒光強(qiáng)度均發(fā)生明顯變化,認(rèn)為其主要破壞了β-乳球蛋白的構(gòu)象性表位,從而顯著降低其抗原性和過(guò)敏原性。
3.1.3 超聲處理
超聲波是一種彈性波,其在媒質(zhì)中可以形成介質(zhì)粒子的機(jī)械振動(dòng),這種超聲波振動(dòng)具有能量所引起的與媒質(zhì)的相互作用,能夠產(chǎn)生機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)等多種效應(yīng),進(jìn)而造成物質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化,因此近些年在食品過(guò)敏原消解領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,然而牛奶過(guò)敏原消減中應(yīng)用的研究報(bào)道少[28]。鄧涵等[29]利用超聲波對(duì)大豆7S蛋白進(jìn)行改性處理,并評(píng)估超聲處理產(chǎn)物體外消化性及消化產(chǎn)物抗原性和潛在致敏性的變化,研究發(fā)現(xiàn)80 min的超聲處理大豆7S蛋白的潛在致敏性明顯下降。劉妍妘等[30]報(bào)道,以大黃魚魚卵為檢測(cè)原料,比較多種加工方式包括美拉德反應(yīng)、紫外照射、超聲聯(lián)合加熱和高溫高壓等對(duì)大黃魚魚卵過(guò)敏原和其消化產(chǎn)物免疫反應(yīng)性的影響,結(jié)果表明超聲聯(lián)合加熱處理使得過(guò)敏原消化產(chǎn)物的IgE結(jié)合活性明顯減弱。
化學(xué)法主要利用糖基化方法來(lái)使致敏原活性降低,糖基化方法是運(yùn)用蛋白質(zhì)與糖類之間的美拉德反應(yīng)對(duì)乳清蛋白進(jìn)行改性,生成糖基化產(chǎn)物,實(shí)現(xiàn)抗原活性部位的改變,這種化學(xué)改性已經(jīng)應(yīng)用于降低牛乳蛋白抗原性的實(shí)踐[31]。Li等[32]通過(guò)美拉德反應(yīng)實(shí)現(xiàn)麥芽五糖和乳清分離蛋白(whey isolate protein,WPI)的糖基化,探究了乳清蛋白多糖復(fù)合物的免疫原性。Kobayash等[33]對(duì)β-LG與羧甲基葡聚糖進(jìn)行接枝改性,生成的β-LG-羧甲基葡聚糖可以保持維生素E結(jié)合活性,其熱穩(wěn)定性高且無(wú)過(guò)敏性。糖基化反應(yīng)還在降低其他食品致敏性具有廣泛的應(yīng)用,朱婷偉[34]報(bào)道大豆蛋白過(guò)敏原糖基化修飾后抗原性變化,結(jié)果表明糖基化反應(yīng)影響了抗原性,其關(guān)鍵作用是蛋白與糖結(jié)合部位影響了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。此外,阮韋偉[35]報(bào)道糖基修飾改性可明顯影響擬穴青蟹主要過(guò)敏原精氨酸激酶與原肌球蛋白的致敏性。
生物消減技術(shù)主要采用酶法對(duì)乳及乳制品進(jìn)行相應(yīng)處理。石徑等[36]利用6種乳酸桿菌粗提酶液于37 ℃對(duì)脫脂乳進(jìn)行酶解,并采用ELISA方法測(cè)定α-LA、β-LG、α-CN和β-酪蛋白(β-CN)共4種乳蛋白在酶解脫脂乳中的抗原性和過(guò)敏原性,結(jié)果表明雖然不同菌種所產(chǎn)酶液均能一定程度地消減不同乳蛋白抗原性與過(guò)敏原性,但其影響程度存在差異。路雪蕊等[37]采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶法對(duì)小麥粉的致敏性,研究顯示酶活比為2∶5的菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶,6.64%的復(fù)配料液比,在pH 6.53和溫度47.7 ℃條件下酶解,酶解2.47 h,加酶量為0.395 g/100 g蛋白質(zhì),此條件下過(guò)敏原含量為0.593 μg/g蛋白質(zhì),檢測(cè)結(jié)果與理論值相差7.8%,致敏性降低至原來(lái)的63.9%,實(shí)現(xiàn)小麥粉致敏性顯著降低。
牛奶及奶制品過(guò)敏原仍然是當(dāng)今世界上一大熱點(diǎn)議題,對(duì)個(gè)人的生命安全帶來(lái)巨大的隱患、對(duì)家庭的財(cái)產(chǎn)安全帶來(lái)巨大的負(fù)擔(dān),因此找到有效的過(guò)敏原檢測(cè)技術(shù)及消減技術(shù)迫在眉睫。
牛奶及乳制品過(guò)敏原的檢測(cè)技術(shù)主要包括蛋白水分和基因水平兩大類,目前許多學(xué)者將該兩類檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用到相關(guān)食品進(jìn)行研究并進(jìn)行效果驗(yàn)證,研究結(jié)果證實(shí)這兩類檢測(cè)方法準(zhǔn)確有效,因此已經(jīng)被應(yīng)用于牛奶及奶制品過(guò)敏原的檢測(cè)。與牛奶及奶制品過(guò)敏原檢測(cè)技術(shù)相比,消減技術(shù)則顯得更為復(fù)雜。一方面,過(guò)敏原消減技術(shù)是對(duì)整批產(chǎn)品采用相應(yīng)的物理、化學(xué)或微生物方法進(jìn)行處理,若操作不當(dāng),則可能造成整批產(chǎn)品報(bào)廢,帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失;另一方面,實(shí)際生產(chǎn)受生產(chǎn)條件、產(chǎn)量、參數(shù)及設(shè)備等因素的交互影響,這些消減技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中能否取得實(shí)際應(yīng)用,還有待進(jìn)一步實(shí)踐和驗(yàn)證;最后,國(guó)內(nèi)相當(dāng)一部分工廠的財(cái)力有限,無(wú)法支撐相應(yīng)設(shè)備的購(gòu)置及維護(hù)費(fèi)用。
牛奶及奶制品過(guò)敏原的檢測(cè)技術(shù)和消減技術(shù)目前處于一個(gè)快速成長(zhǎng)的階段,因此還存在著一定的不確定性,需要通過(guò)進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證,使得這些技術(shù)在運(yùn)行成本及產(chǎn)品質(zhì)量方面均得到有效的控制。