高溫蒸煮堿法預處理玉米芯酶法制備低聚木糖

張智超，郭彎彎，孫軍濤*

許昌學院（許昌 461000）

低聚木糖是由2～9個木糖單元以β-1, 4糖苷鍵連接而成的低聚糖混合物[1]。低聚木糖具有較高的耐熱和耐酸性能，在pH 2.5～8.0范圍內(nèi)100 ℃加熱1 h幾乎不分解，是雙歧桿菌增殖所需用量最小的低聚糖[2]，具有改善人體腸道、抗齲齒、提高免疫機能、促進鈣的吸收、改善脂質(zhì)代謝等功能[3-6]。

玉米芯是制備低聚木糖的主要原材料之一[7]，2020年我國玉米總產(chǎn)量約2.76億 t，大約有0.88億 t的玉米芯副產(chǎn)物，為低聚木糖的制備提供了豐富的原料資源。目前絕大部分玉米芯作為農(nóng)家燃料被燒掉，以玉米芯為原料制備低聚木糖，不僅可以綜合利用農(nóng)產(chǎn)品資源、保護環(huán)境，同時也可以增加農(nóng)民收入，具有很好的經(jīng)濟效益和社會效益[8-9]。試驗將粉碎后的玉米芯，先經(jīng)過高溫蒸煮堿法預處理，然后用木聚糖酶水解制備低聚木糖，為玉米芯制備功能性低聚木糖生產(chǎn)提供一定的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米芯（河南省濮陽市）；木聚糖酶（江蘇銳陽生物科技有限公司）；3, 5-二硝基水楊酸（上?？曝S化學試劑有限公司）；木糖（上海邁坤化工有限公司）；活性炭（天津科密歐化學試劑有限公司）；無水乙醇（天津大茂化學試劑廠）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

FA2104B分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；LabTech紫外可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）；HZQ-X100A恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；TDL-60B低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；BPG-9200AH電熱鼓風干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；PHS-3C pH計（上海儀佑科儀器儀表有限公司）；FW-100萬能粉碎機（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 測定方法

1.2.1 還原糖的測定

還原糖的測定采用DNS法[10]。

1.2.2 可溶性總糖測定

向待測液中加入終質(zhì)量濃度為72 g/L的濃硫酸，沸水浴2 h，然后用6 mol/L的氫氧化鈉溶液中和至中性，按還原糖的測定方法測定待測液中可溶性總糖的含量。

1.2.3 平均聚合度（DP）的計算

1.3 玉米芯高溫蒸煮堿法預處理

分別選擇料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30和1∶35 g/mL）、堿濃度（0.4，0.7，1.0，1.3和1.6 mol/L）、溫度（90，100，110，120和125 ℃）和時間（20，30，40，50和60 min）為主要因素，通過測定預處理溶液中總糖和還原糖含量，確定玉米芯高溫蒸煮堿法預處理工藝條件。

1.4 木聚糖酶制備玉米芯低聚木糖

分別選擇木聚糖酶添加量（3%，4%，5%，6%和7%）、pH（3.0，4.0，5.0，6.0和7.0）、酶解溫度（40，45，50，55和60 ℃）、酶解時間（10，20，30，40和50 min）為影響因素，以酶解液中還原糖含量、可溶性總糖含量以及平均聚合度為指標，研究各因素對制備低聚木糖的影響。在單因素試驗的基礎上，選取酶添加量、pH、酶解溫度、酶解時間四個因素中的三水平進行L9(34)的正交試驗，以還原糖含量為指標，確定最佳制備工藝。

2 結果與分析

2.1 玉米芯高溫蒸煮堿法預處理

2.1.1 料液比對玉米芯預處理的影響

高溫蒸煮堿法預處理料液比對玉米芯料液中糖含量的影響如圖1所示。隨著料液比的升高，還原糖含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，總糖含量呈現(xiàn)先下降再上升后下降的趨勢。堿液量少時，玉米芯物料無法充分吸水溶脹，導致糖不能充分溶出，因此糖濃度較低。當堿液增加到一定體積時，稀釋作用導致預處理溶液中糖濃度降低[11]。當料液比為1∶25（g/mL）時，預處理的玉米芯料液中的還原糖含量最高，為7.92 mg/L，此時總糖含量為29.47 mg/L。

圖1 料液比對玉米芯預處理的影響

2.1.2 堿濃度對玉米芯預處理的影響

高溫蒸煮堿法預處理堿濃度對玉米芯料液中糖含量的影響如圖2所示。隨著堿濃度的增加，預處理溶液中還原糖和總糖含量呈先升高后降低的趨勢。堿濃度的增加破壞了玉米芯中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素間的結合，使纖維素、半纖維素游離出來，提高了溶液中糖含量[12]；堿濃度過高，可能導致糖的降解，引起糖含量降低。當堿濃度為1.0 mol/L時，預處理料液中總糖含量最高，為64 mg/L，此時還原糖含量為22.40 mg/L。當堿液濃度高于1.0 mol/L時，總糖含量降低。

圖2 堿濃度對玉米芯預處理的影響

2.1.3 溫度對玉米芯預處理的影響

高溫蒸煮堿法預處理溫度對玉米芯料液中糖含量的影響如圖3所示。隨著溫度的升高，料液中總糖濃度和還原糖濃度均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。溫度過高可能導致提取液中部分糖發(fā)生焦糖化反應，使提取液的顏色變深，影響木聚糖的提取率。當預處理溫度為110 ℃時，料液中總糖含量和還原糖含量均達到最高，分別為70.29和19.53 mg/L。

圖3 溫度對玉米芯預處理的影響

2.1.4 時間對玉米芯預處理的影響

高溫蒸煮堿法預處理時間對玉米芯料液中糖含量的影響如圖4所示。隨著高溫蒸煮時間的延長，料液中還原糖含量和總糖含量基本處于緩慢升高并趨于穩(wěn)定狀態(tài)。當預處理時間為40 min時，總糖含量和還原糖含量基本達到最高，分別為70.04和16.98 mg/L。

圖4 時間對玉米芯預處理的影響

玉米芯高溫蒸煮堿法預處理工藝：玉米芯與NaOH的料液比1∶25（g/mL），堿濃度1 mol/L，高溫蒸煮溫度110 ℃，高溫蒸煮時間40 min。

2.2 木聚糖酶制備玉米芯低聚木糖

2.2.1 木聚糖酶制備玉米芯低聚木糖單因素試驗

2.2.1.1 木聚糖酶添加量對酶解影響

木聚糖酶添加量對酶解的影響如圖5所示。隨著酶添加量的增加，總糖含量先減少再增加最后減少，還原糖濃度變化基本不大，聚合度先下降后上升最后趨于平衡。酶用量較高時水解液中酶分子數(shù)量較高，酶分子與反應底物結合的概率增加，有效提高了酶解生成低聚木糖的量[13]。當酶添加量為6%時，酶解液中總糖的含量最高，為794.80 mg/L，此時還原糖含量為194.27 mg/L。

圖5 木聚糖酶添加量對酶解的影響

2.2.1.2 pH對酶解影響

木聚糖酶酶解pH對酶解的影響如圖6所示。pH可以通過改變木聚糖酶的構象進而影響酶的活性位點與底物的結合[14]。pH 5.0時，木聚糖酶的活性最高，酶解液中總糖和還原糖含量最高，分別為1 046.55和275.42 mg/L，此時聚合度達到最低；pH高于或低于5.0均會降低木聚糖酶的活性，導致酶解液中總糖和還原糖含量降低。

圖6 pH對酶解的影響

2.2.1.3 溫度對酶解影響

溫度對木聚糖酶水解的影響如圖7所示。在一定溫度范圍內(nèi)，升高溫度可以加快酶解反應速度，當溫度超過一定范圍后，過高的溫度使酶失活，導致酶解反應速度降低[15]。酶解液中總糖含量、還原糖含量和聚合度均是隨著酶解溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低，當酶解溫度為50 ℃時，酶解液中還原糖含量達到最高，為282.74 mg/L，此時總糖含量為983.05 mg/L。

圖7 溫度對酶解的影響

2.2.1.4 酶解時間對酶解影響

酶解時間對木聚糖酶水解的影響如圖8所示。隨著酶解時間的延長，酶解液中還原糖和總糖含量緩慢升高并趨于穩(wěn)定，而聚合度呈現(xiàn)逐漸降低趨勢。當酶解時間高于40 min時，酶解液中還原糖含量和總糖含量隨著酶解時間的延長趨于穩(wěn)定。

圖8 酶解時間對酶解的影響

2.2.2 木聚糖酶制備玉米芯低聚木糖正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，選擇酶添加量、pH、酶解溫度和時間四因素進行L9(34)正交試驗，正交試驗因素水平表和正交試驗結果見表1和表2。

表1 因素水平表

由表2可知，各因素對酶法制備低聚木糖的影響程度依次為B＞A＞D＞C，即pH＞酶添加量＞酶解時間＞溫度，最佳配方組合為A2B2C3D3，即木聚糖酶的添加量6%、pH 5.0、木聚糖酶水解溫度55 ℃、酶解時間50 min。玉米芯高溫蒸煮堿法預處理后，在最佳酶解條件下水解，玉米芯酶解液中還原糖含量為287.36 mg/L，酶解產(chǎn)物經(jīng)過進一步的脫色、醇沉和干燥工藝，制備的低聚木糖粗品得率為16%。

表2 正交試驗結果

3 結論

玉米芯高溫蒸煮堿法預處理工藝條件為玉米芯與NaOH的料液比1∶25（g/mL），堿濃度1 mol/L，高溫蒸煮溫度110 ℃，高溫蒸煮時間40 min。木聚糖酶制備低聚木糖的工藝條件為木聚糖酶添加量6%，pH 5.0，酶解溫度55 ℃，酶解時間50 min。在此條件下，玉米芯酶解液中還原糖含量為287.36 mg/L，酶解液經(jīng)脫色、醇沉和干燥后低聚木糖粗得率為16%。