瑞士乳桿菌的篩選與應用

王昊乾，馬玉珠，趙景娜，劉文俊，陳永福，孫天松

（內蒙古農業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室農業(yè)農村部奶制品加工重點實驗室內蒙古自治區(qū)乳品生物技術與工程重點實驗室，呼和浩特 010018）

0 引言

活性乳酸菌飲料中的乳酸菌必須具有良好的發(fā)酵及益生特性并賦予產品良好感官品質[1]。瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus，L.helveticus）具有公認的安全性和益生特性[2-3]，被應用于多種發(fā)酵乳制品當中[4-6]。L.helveticus獨特的蛋白水解體系能夠對乳酪蛋白進行分解，從而釋放生物活性肽，如抗高血壓肽（Val-Pro-Pro（VPP）、Ile-Pro-Pro（IPP））和具有抑制血管緊張素轉換酶（ACE）活性的肽，從而達到降血壓的功效[7-8]。ZHOU[9]等研究表明L.helveticus H 9具有較強的產酸能力及蛋白水解能力，并能顯著抑制發(fā)酵乳血管緊張素轉化酶（ACE）的活性。大多L.helveticus具有調節(jié)腸道菌群結構和促進宿主健康的作用[10-13]。

本文以自然發(fā)酵乳制品來源的194株L.helveticus為研究對象，通過對其發(fā)酵特性、胃腸液耐受性以及貯藏穩(wěn)定性等方面進行篩選，得到一株適用于活性乳酸菌飲料生產的優(yōu)良L.helveticus菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究所用的194株L.helveticus均由內蒙古農業(yè)大學乳酸菌菌種資源庫提供，分離自青海（10株）、西藏（15株）、蒙古國（56株）、甘肅（14株）、新疆（37株）、四川（13株）、內蒙古（33株）以及云南（16株）地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品中。對照菌株為L.paracasei Lc-01，購自丹麥科漢森公司。

1.2 主要試劑與設備

脫脂乳粉，新西蘭恒天然；胃蛋白酶（Pepsin 3800 U/mg），Chembase公司；膽鹽（Oxgall），Dehydrated Fresh Bile，BD公司；M RS培養(yǎng)基：植物蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、Tween80、磷酸二氫鉀、無水乙酸鈉、檸檬酸三胺、硫酸鎂、硫酸錳，瓊脂（固體培養(yǎng)基需加），均來自來自國產試劑公司。

顯微鏡（BX 50），OLYMPUS；高速冷凍離心機（GL-20B型）、紫外分光光度計（U-170，日本島津；全自動高壓滅菌鍋（HA-300MⅢ型），RAYAMA；全自動干熱滅菌鍋（SP-650型），DVANTEC；p H計（雷磁p HSJ-3F），上海精密科學儀器有限公司；無菌工作臺（ZHJH-C1112）；恒溫培養(yǎng)箱（STAC-S45F）；恒溫水浴鍋（95-013）日本；高壓均質機（SRH 60-70），上海申鹿均質機有限公司。

1.3 方法

1.3.1 L.helveticus的初步篩選

將194株L.helveticus在脫脂乳培養(yǎng)基中活化至第2代，以2%接種于10%的脫脂乳中，于37℃培養(yǎng)24 h。

p H值的測定：使用p H計直接測定發(fā)酵乳的p H值。

滴定酸度的測定：根據(jù)GB5009.239，取10 g發(fā)酵乳，加20 mL的蒸餾水，2滴酚酞指示劑，混勻，用0.1 mol/L標準NaOH溶液滴定；滴定酸度（吉爾涅爾度，°T）為100 g發(fā)酵乳樣品消耗0.1 mol/L NaOH溶液的毫升數(shù)，消耗1 mL，0.1 mol/L NaOH即為1°T。

1.3.2 復篩菌株對人工胃腸液及膽鹽的耐受性

1.3.2.1 菌株對人工胃腸液的耐受性

人工胃液：將PBS滅菌后，用HCL（1mol/L）調節(jié)p H值至2.5，加入質量濃度為3.5 g/L胃蛋白酶，用已滅菌的0.22μm濾膜過濾除菌，制成模擬人工胃液，備用。

人工腸液：將PBS滅菌后，用NaOH調節(jié)p H值至8.0，加入0.1%胰蛋白酶和1.8%牛膽鹽，用已滅菌的0.22μm濾膜過濾除菌，制成模擬人工腸液，備用。

將初篩獲得的菌株于MRS培養(yǎng)基中活化，傳代2次，用pbs（p H 7.0）洗菌2次后，取0.5 mL菌液加入到4.5 mL模擬人工胃液中，37℃水浴3 h，分別于0 h和3 h用MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注法計活菌數(shù)。取0.5 mL已消化3 h的人工含菌胃液加入到4.5 mL的人工腸液中，繼續(xù)于37℃水浴培養(yǎng)，分別于0、4 h和8 h計活菌數(shù)，每個樣品做3個平行[14]。菌株存活率的計算方法為

存活率=Log N1/Log N0

式中：N1為菌株經人工胃腸液處理后的活菌數(shù),N0為菌株初始活菌數(shù)。

1.3.2.2 菌株對膽鹽的耐受性

將活化好的菌株按1%接種量分別接種于含0.3%膽鹽和不含膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，每小時取樣于620 nm處測定吸光值，直到加膽鹽和不加膽鹽菌液的OD 620值增加0.3個單位以上為止，并計算菌株在不含膽鹽和含膽鹽培養(yǎng)基中OD620增加0.3個單位所需時間的差值，即為延滯時間（LT，LagTime）。

1.3.3 活性乳酸菌飲料的貯藏穩(wěn)定性及感官評價

復篩得到的L.helveticus與對照菌株L.casei Lc-01（Lc-01）共同制備活性乳酸菌飲料，并對其貯藏穩(wěn)定性，風味物質以及感官品質進行研究。

1.3.3.1 活性乳酸菌飲料的貯藏穩(wěn)定性

菌株按5×106mL-1的接種量接種于褐變脫脂乳中，37℃發(fā)酵至滴定酸度（TA）為200°T，取出后急冷，將白砂糖溶解于蒸餾水中，95℃滅菌5 min，冷卻至20℃后，按照發(fā)酵乳、白砂糖和蒸餾水25∶13∶62的比例混合配制成蛋白質質量分數(shù)不低于1%的活性乳酸菌飲料。在4℃貯藏下，分別于0，7，14，21和28 d取樣測定p H值、滴定酸度、活菌數(shù)，并進行感官評價。

p H值和滴定酸度的測定方法參照1.3.1。

活菌數(shù)的測定：將活性乳酸菌飲料梯度稀釋至合適梯度，采用MRS瓊脂培養(yǎng)基平板傾注法，待凝固后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，計菌落總數(shù)。

感官評價：選擇具有乳清飲料品嘗經驗的25名研究人員對益生菌發(fā)酵乳飲料的口感、滋味、香氣和狀態(tài)進行品評，并按照評定標準表1進行打分，評定結果取平均值。

表1 感官評定標準

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析

試驗中各指標均為3個平行，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差表示。使用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，使用GraphPad prism 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 L.helveticus的初篩結果

菌株的產酸特性是篩選發(fā)酵劑菌種最重要的指標之一，菌株在一定時間內使發(fā)酵乳p H值下降的程度不僅體現(xiàn)了菌株的生長和產酸特性，還影響著工業(yè)化生產成本[15]。194株L.helveticus中有96株菌的發(fā)酵乳在發(fā)酵24 h后的p H值小于4.0，產酸能力較強。如圖1所示，96株L.helveticus發(fā)酵乳的p H值在3.27～5.64之間，滴定酸度在121.57～278.9°T之間，其中IMAU 20111發(fā)酵乳的 p H 值最低，為 3.27；IMAU 20280發(fā)酵乳的滴定酸度最低，為278.9°T。鮑志寧等[16]在對L.helveticus（Lh134）和干酪乳桿菌（Lc134）的發(fā)酵特性進行研究時結果表明，L.helveticus（Lh134）在脫脂乳中的發(fā)酵速度比干酪乳桿菌（Lc134）更快，具備較強的產酸能力。此外，有98株L.helveticus發(fā)酵乳p H值在發(fā)酵24 h后仍在4.0以上。由此可見，自然發(fā)酵乳制品來源的L.helveticus在產酸能力方面體現(xiàn)出很大程度上的菌株依賴性。

2.2 復篩菌株對人工胃腸液及膽鹽的耐受性

2.2.1 L.helveticus對人工胃腸液的耐受性

益生菌能夠在人體內發(fā)揮益生作用的前提是其能夠在胃腸液以及膽鹽的環(huán)境下保持活性，因此對L.helveticus進行人工胃腸液耐受性試驗是益生菌篩選的必要條件[17-18]。

復篩的菌株根據(jù)其分離地及分離源的不同選擇24株進行人工胃腸液及膽鹽耐受性試驗，試驗結果如表2所示。L.helveticus IMAU 10049對人工胃液和腸液的耐受性最好，分別為（98.93±1.07）%和（96.93±0.39）%；L.helveticus IMAU 30040耐受性次之，達到（95.67±1.39）%和（95.00±0.43）%；L.helveticus IMAU 40086也表現(xiàn)出較高的胃腸液耐受性，分別為（99.17±0.83）%和（70.53±1.66）%。陳明等[19]對L.casei IMAU 60149進行模擬胃腸液耐受性的試驗結果表明，在p H=2.5的人工胃液中處理3 h的存活率為90.60%，在p H=8.0的人工腸液中處理8 h后的存活率為71.35%，耐受能力低于本試驗中的L.helveticus IMAU 10049、IMAU 30040和IMAU 40086。

表2 L.helveticus對人工胃腸液的耐受性%

2.2.2 L.helveticus對膽鹽的耐受性

24株L.helveticus對膽鹽耐受性的結果如表3所示，僅有10株菌在膽鹽耐受性試驗中的延滯時間少于7 h，其中IMAU 80322延滯時間最短，為0.22±0.04 h，表現(xiàn)出最強的膽鹽耐受性。周靖等[20]對應用于褐色活性乳飲料中的L.casei篩選時進行膽鹽耐受性試驗，結果表明L.casei IM AU 60143、IMAU 70020和IMAU 10510的延滯時間分別為0.34±0.07 h，0.60±0.04 h，0.54±0.06 h，均低于L.helveticus IMAU 80322。菌株IMAU 40086、IMAU 80872的延滯時間小于1 h，分別為0.55±0.02 h和0.93±0.09 h，具有較強胃腸液耐受性的菌株IMAU 30040的膽鹽耐受性也較好，延滯時間為2.44±0.28 h。膽鹽難受性是菌種在小腸中是否具有代謝活性以及能否定植的重要指標[21]。綜合考慮24株L.helveticus對人工胃腸液和膽鹽的耐受性結果，選擇L.helveticus IMAU 40086和IMAU 30040進入下一步試驗。

表3 L.helveticus對膽鹽的耐受性h

2.3 活性乳酸菌飲料的貯藏穩(wěn)定性

2.3.1 發(fā)酵時間

發(fā)酵時間是發(fā)酵劑篩選的重要指標，較短的發(fā)酵時間可避免微生物感染風險，還能夠降低工業(yè)化生產成本[22]。L.helveticus IMAU 30040、IMAU 40086和對照菌株L.paracasei Lc-01均按5×106mL-1的接種量接種于褐變脫脂乳中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，發(fā)酵至滴定酸度為200°T，發(fā)酵時間見表4。L.helveticus IMAU 30040、IMAU 40086的發(fā)酵活性乳飲料發(fā)酵時間分別為34 h和17 h，發(fā)酵時間遠少于對照菌株Lc-01的68 h，CHEN等[8]篩選具有降血壓功效的L.helveticus時結果表明，249株自然發(fā)酵乳制品來源的L.helveticus的平均發(fā)酵時間為20.1±7.8 h，本研究中菌株IMAU 40086時間低于平均值，在工業(yè)化應用中可以顯著縮短發(fā)酵時間，具有較好的應用潛力。

表4 發(fā)酵時間

2.3.2 貯藏期間的后酸化程度及活菌數(shù)的變化

采用L.helveticus IMAU 30040、IMAU 40086與對照菌株Lc-01制備的活性乳酸菌飲料在貯藏期間的p H值、滴定酸度和活菌數(shù)變化情況反映了菌株的后酸化程度和菌株存活情況，對于發(fā)酵乳制品在貯藏期間的穩(wěn)定性具有重要的參考意義，結果如圖2和圖3所示。

發(fā)酵乳制品在貯藏、運輸和銷售的一系列過程中，活菌繼續(xù)發(fā)酵導致發(fā)酵乳酸度下降現(xiàn)象稱為后酸化，較好的發(fā)酵劑菌株應具備弱后酸化能力[23]，如圖2（a）所示L.helveticus IMAU 40086和IMAU 30040在4℃貯藏過程中酸度上升，L.helveticus IMAU 40086、IMAU 30040及對照菌株的滴定酸度在貯藏期間變化均顯著（P＜0.05）。如圖2（b）所示添加L.helveticus IMAU 30040和IMAU 40086和對照菌株L.paracasei Lc-01活性乳酸菌飲料的p H值在貯藏期間呈降低趨勢，但在28 d貯藏過程中的差異并不顯著，因此不會使飲料有的嚴重后酸化和過酸口感。

3組活性乳酸菌飲料貯藏期間活菌數(shù)的變化見圖3所示。L.helveticus IMAU 30040和對照菌株的活菌數(shù)在7 d時達到最大，活菌數(shù)分別為（6.67±0.31）×108m L-1和（3.84±0.08）×108mL-1，7 d后逐漸降低，L.helveticus IMAU 40086的活菌數(shù)在貯藏期間內持續(xù)下降。貯藏28 d后，L.helveticus IMAU 30040，IMAU 40086和對照菌株活菌數(shù)均在108mL-1以上，分別為（1.72±0.11）×108m L-1，（1.24±0.14）×108mL-1和（4.49±0.01）×108mL-1，對照菌株的活菌數(shù)高于2株L.helveticus。張興昌、耿鐵柱等[24-25]對市售活性乳酸菌飲料的貨架期穩(wěn)定性進行研究時的結果也表明其活菌數(shù)均出現(xiàn)不同程度下降，但均在106mL-1以上，與本實驗結果相近。歐盟規(guī)定，益生菌產品的活菌數(shù)在其貨架期內必須至少保持在106mL-1以上[26]，本文研究的兩株L.helveticus制備的活性乳酸菌飲料在貯藏期28 d內的活菌數(shù)均在108mL-1以上，且L.helveticus IMAU 30040的活菌數(shù)降低程度更為平緩且均高于菌株L.helveticus IMAU 40086，這說明IMAU 30040在活性乳酸菌飲料的應用上更具潛力。

圖3 貯藏期間活性乳飲料活菌數(shù)的變化

2.3.3 貯藏期間活性乳酸菌飲料的感官評價

能否賦予產品優(yōu)良的感官品質也是篩選發(fā)酵劑菌株重要的指標之一，對3組活性乳酸菌飲料在貯藏28 d內的感官品質進行評分，得分情況如圖4所示。

感官品質的各項得分隨著貯藏時間的延長逐漸降低，尤其是在貯藏21～28 d期間，3組乳飲料的感官各項評分均有較大程度的降低。這是由于活性乳酸菌飲料在貯藏過程中，發(fā)酵劑菌種持續(xù)發(fā)酵導致口感變酸、狀態(tài)變差和出現(xiàn)分層現(xiàn)象有關。從圖4可以看出，L.helveticus IMAU 30040，IMAU 40086的活性乳飲料得分均低于對照組，但3組活性乳酸菌飲料在同一貯藏時間，口感、滋味、香氣、狀態(tài)得分差異均不顯著（P＞0.05），這表明L.helveticus IMAU 30040和IMAU 40086有應用于活性乳飲料中的潛力。

3 結論

本研究在194株傳統(tǒng)發(fā)酵乳和制品來源的L.helveticus中篩選得到一株具有良好的生產特性和益生特性的L.helveticus IMAU 30040，該菌株具有較強的胃腸液及膽鹽耐受性，發(fā)酵活性乳酸菌飲料時表現(xiàn)出發(fā)酵速度快、后酸化程度弱，且在貯藏期結束時仍保持108mL-1以上活菌數(shù)等優(yōu)良發(fā)酵特性，感官評價得分與對照組無顯著差異（P＞0.05）。因此，L.helveticus IMAU 30040具有作為活性乳酸菌飲料發(fā)酵菌種的潛力。