基于網絡藥理學和分子對接探討苓甘五味姜辛湯治療哮喘的潛在作用機制

朱鐘妍，陳 楓，王 旋

0 引言

哮喘是一種慢性炎癥性疾病，以氣道阻塞和支氣管高反應性為特征，臨床表現(xiàn)為反復發(fā)作的喘息、咳嗽、胸悶和呼吸急促，其病因尚未完全闡明，可能與基因和環(huán)境相互作用有關[1]。近年發(fā)表在柳葉刀的一項全國性橫斷面調查顯示，中國哮喘的總體患病率為4.2%[2]。目前哮喘的西醫(yī)治療包括糖皮質激素、β2受體激動劑、靶向生物制劑、變應原免疫療法等[3]。但是由于長期使用西藥可能具有不良反應和耐藥性，很多人也選擇口服中藥治療哮喘，亦取得了較好的療效。苓甘五味姜辛湯記載于《金匱要略》，包括茯苓、甘草、五味子、干姜、細辛五味中藥，是治療寒飲伏肺的代表方，臨床上常用于治療哮喘等肺系疾病。

網絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學的理論，融合了計算機科學、生物信息學的新興交叉學科，可用于分析藥物與疾病和靶點之間“多成分、多靶點、多途徑”的協(xié)同作用關系，在闡釋中藥藥理機制、探究中藥的毒性機制、中藥新藥研發(fā)等方面發(fā)揮了重要作用[4]。分子對接是從已知結構的受體及配體出發(fā)，依照幾何、能量、化學環(huán)境三大互補原則，進行分子間的相互作用識別，并預測分子間的最佳結合模式，在中藥有效成分潛在靶點及作用機制探索、中藥復方藥理機制研究等方面具有重要價值和潛在優(yōu)勢[5]。本研究擬通過中藥復方網絡藥理學和分子對接的方法，探討苓甘五味姜辛湯治療哮喘的潛在作用機制，為進一步研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 ①數(shù)據(jù)庫：中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，https∶//tcmspw.com/index.php)[6]、Uniprot數(shù)據(jù)庫(http∶//www.uniprot.org)[7]、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https∶//www.genecards.org)、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(https∶//www.disgenet.org)、TTD數(shù)據(jù)庫(http∶//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https∶//www.drugbank.ca)[8]、String數(shù)據(jù)庫(Version 11.0，https∶//string-db.org)[9]、DAVID數(shù)據(jù)庫(https∶//david.ncifcrf.gov)[10]和PDB數(shù)據(jù)庫(https∶//www.rcsb.org)。②在線繪圖工具：Venny(Version 2.1.0，https∶//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)，Bioinformatics(http∶//www.bioinform atics.com.cn)。③軟件：Cytoscape軟件(version 3.8)、AutoDock軟件(version 4.2.6)、AutoDock Tools軟件(version 1.5.6)和PyMOL軟件(version 2.4.0)。

1.2 苓甘五味姜辛湯成分及靶點篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫分別收集茯苓、甘草、五味子、干姜、細辛的化學成分，按照ADME進行活性成分篩選，滿足口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18兩個條件。同時參考2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的中藥有效成分含量測定對其進行補充。得到各藥物的活性成分后，在TCMSP數(shù)據(jù)庫進行相應靶點的檢索，應用Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點名稱進行規(guī)范。采用Cytoscape軟件繪制苓甘五味姜辛湯活性成分-靶點網絡圖。

1.3 哮喘靶點篩選 以“asthma”(MeSH)為關鍵檢索詞，通過GeneCards、DisGeNET、TTD以及DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索哮喘靶點。其中，Genecards數(shù)據(jù)庫的“Relevance score”和DisGeNET數(shù)據(jù)庫的“Score”均表示該靶點與檢索疾病的關聯(lián)度，若靶點過多則根據(jù)關聯(lián)度的中位數(shù)進行篩選。將以上數(shù)據(jù)庫得到的靶點經行合并，刪除重復值后得到哮喘靶點。

1.4 共同靶點PPI網絡構建及核心靶點獲取 通過Venny將藥物靶點與疾病靶點取交集，獲得苓甘五味姜辛湯與哮喘的共同靶點，并繪制韋恩圖。將得到的共同靶點導入String數(shù)據(jù)庫構建PPI網絡，模式選擇“Multiple Protein”，物種選擇“Homo sapiens”，最低相互作用值設置為“Highest confidence(0.900)”，并隱藏游離節(jié)點，其他參數(shù)不變。將得到的node1、node2、combined score導入Cytoscape軟件進行可視化分析。通過該軟件的Network analyzer功能進行拓撲分析，并根據(jù)degree值調整節(jié)點的大小、顏色深淺和透明度。同時采用該軟件內置的cytoHubba插件對PPI網絡進行MCC算法。將degree前10位靶點與MCC算法前10位靶點取交集，得到苓甘五味姜辛湯治療哮喘的核心靶點。

1.5 GO富集及KEGG通路分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對苓甘五味姜辛湯與哮喘的共同靶點進行GO富集及KEGG通路分析。格式選擇“OFFICIAL GENE SYMBOL”，物種及背景均選擇“Homo sapiens”，分別進行細胞組分(CC)、分子功能(MF)、生物過程(BP)以及KEGG通路分析。將數(shù)據(jù)導出后按P值進行排序，每項均選取P值最小的20個采用Bioinformatics繪制高級氣泡圖。

1.6 “苓甘五味姜辛湯成分-哮喘靶點-通路”網絡構建 將共同靶點對應的活性成分、共同靶點、前20條KEGG通路導入Cytoscape軟件，構建“苓甘五味姜辛湯成分-哮喘靶點-通路”網絡。通過該軟件的Network analyzer功能進行拓撲分析，根據(jù)degree值篩選出苓甘五味姜辛湯治療哮喘的核心成分。

1.7 分子對接 將篩選出的核心成分與核心靶點進行AutoDock分子對接。從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載核心成分的mol2格式文件，導入PyMOL轉化為pdb格式，之后導入AutoDock Tools保存為pdbqt 格式。從PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點的pdb格式文件(選擇分辨率<3A且具有配體的蛋白復合物)，通過PyMOL進行去水、加氫、去除原配體等處理，原子類型設定為Assign AD4 type，之后導入AutoDock Tools保存為pdbqt 格式。將蛋白復合物原配體所在的空間位置定義為活性口袋，選擇Lamarckian遺傳算法，運行AutoDock進行分子對接，以結合自由能為參考進行篩選，最后利用PyMOL將最佳對接結果進行可視化。

2 結果

2.1 苓甘五味姜辛湯成分及靶點獲取 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查找藥物成分，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18進行篩選，同時參考2015版《中華人民共和國藥典》，補充了甘草的成分甘草酸、五味子的成分五味子醇甲、干姜的成分6-姜辣素、細辛的成分細辛脂素。剔除無靶點成分并去除重復后，共獲得114個活性成分。其中，茯苓獨有成分6個、甘草獨有成分86個、五味子獨有成分8個、干姜獨有成分4個、細辛獨有成分7個、甘草和干姜共有成分1個、甘草和細辛共有成分1個、干姜和細辛共有成分1個。將114個活性成分按OB值由大到小排列，排名前20的成分見表1。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索，并應用Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點名稱進行規(guī)范，共搜索到茯苓靶點22個、甘草靶點228個、五味子靶點20個、干姜靶點57個、細辛靶點108個，去重后共得到苓甘五味姜辛湯靶點250個。利用Cytoscape軟件繪制苓甘五味姜辛湯活性成分—靶點網絡圖，見圖1。

表1 苓甘五味姜辛湯活性成分前20位

圖1 苓甘五味姜辛湯活性成分-靶點網絡圖

2.2 哮喘靶點獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取哮喘靶點7 533個，由于靶點過多，將“Relevance score”由大到小排列，經過2次選取大于中位數(shù)的靶點后，得到1 957個靶點。通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取哮喘靶點2096個，將“Score”由大到小排列，經過2次選取大于中位數(shù)的靶點后，得到663個靶點。補充TTD數(shù)據(jù)庫靶點177個、DrugBank數(shù)據(jù)庫靶點103個。將4個數(shù)據(jù)庫獲得的靶點合并，刪除重復值后，共獲得哮喘靶點2 393個。

2.3 共同靶點PPI網絡構建及核心靶點獲取 通過Venny將苓甘五味姜辛湯靶點與哮喘靶點取交集，獲得共同靶點136個，見圖2。將136個共同靶點導入String數(shù)據(jù)庫構建PPI網絡，見圖3(已隱藏13個游離節(jié)點)。將得到的node1、node2、combined score導入Cytoscape軟件進行可視化分析。通過Network analyzer功能對PPI網絡進行拓撲分析，節(jié)點的大小、顏色、透明度根據(jù)degree值變化，degree越大，則節(jié)點越大、顏色越深、越不透明，見圖4。Degree值最小的前10位靶點依次為STAT3、JUN、TNF、AKT1、TP53、HSP90AA1、IL6、MAPK1、MAPK3、EGFR。利用內置的cytoHubba插件對PPI網絡進行MCC算法分析，見圖5。MCC算法得到的前10位靶點為STAT3、TNF、IL1B、IL6、CXCL8、CCL2、IL4、JUN、IL10、MAPK3。將degree前10位靶點與MCC算法前10位靶點取交集，得到苓甘五味姜辛湯治療哮喘的核心靶點為STAT3、JUN、TNF、IL6、MAPK3。

圖2 苓甘五味姜辛湯-哮喘靶點韋恩圖

圖3 PPI網絡

圖4 PPI網絡拓撲分析漸變圖

圖5 MCC算法前10位

2.4 GO富集及KEGG通路分析 將136個共同靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO富集及KEGG通路分析，共得到61個細胞組分(CC)、119個分子功能(MF)、606個生物過程(BP)以及126個KEGG通路。將數(shù)據(jù)導出后按P值進行排序，每項均選取P值最小的20個通過Bioinformatics繪制高級氣泡圖。氣泡越紅表明P值越小，氣泡越大說明富集的基因數(shù)量越多。

GO-CC前20個富集結果為：細胞外隙、小凹、細胞質膜、胞外區(qū)、膜筏、細胞質、細胞表面、質膜組成部分、細胞外泌體、突觸后膜、質膜外側、線粒體、細胞器膜、投射神經元、細胞外基質、頂端質膜、受體復合物、突觸、內質網、內質網膜。見圖6。

圖6 GO-CC氣泡圖

GO-MF前20個富集結果為：酶結合、蛋白同源二聚化活性、相同蛋白結合、藥物結合、血紅素結合、細胞因子活性、蛋白異源二聚化活性、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、蛋白質結合、受體信號蛋白酪氨酸激酶活性、類固醇結合、蛋白磷酸酶2A結合、轉錄因子結合、氧化還原酶活性、輔酶Ⅱ結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性、蛋白磷酸酶結合、蛋白酶結合、NO合成酶活性調節(jié)和芳香化酶活性。見圖7。

圖7 GO-MF氣泡圖

GO-BP前20個富集結果：對藥物的反應、對乙醇的反應、衰老、對缺氧的反應、對雌二醇的反應、正向調節(jié)NO生物合成過程、負向調節(jié)凋亡過程、對脂多糖的反應、正向調節(jié)基因表達、正向調節(jié)RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄、細胞對有機環(huán)狀化合物的反應、脂多糖介導的信號通路、血管生成、對有毒物質的反應、正向調節(jié)血管生成、正向調節(jié)ERK1和ERK2級聯(lián)、正向調節(jié)細胞增殖、正向調節(jié)DNA模板轉錄、炎癥反應和正向調節(jié)平滑肌細胞增殖。見圖8。

圖8 GO-BP氣泡圖

KEGG前20個富集結果：乙型肝炎、癌癥信號通路、TNF信號通路、南美(美洲)錐蟲病、HIF-1信號通路、弓形體病、癌癥中的蛋白聚糖、膀胱癌、Toll樣受體信號通路、胰腺癌、利什曼病、結直腸癌、NOD樣受體信號通路、FoxO信號通路、甲型流感、PI3K-Akt信號通路、前列腺癌、百日咳、瘧疾和鈣信號通路。見圖9。TNF信號通路見圖10。

圖9 KEGG氣泡圖

圖10 TNF信號通路

2.5 “苓甘五味姜辛湯成分-哮喘靶點-通路”網絡構建 運用Cytoscape軟件構建“苓甘五味姜辛湯成分-哮喘靶點-通路”網絡，見圖11。通過Network analyzer功能進行拓撲分析，根據(jù)degree值篩選出苓甘五味姜辛湯治療哮喘的核心成分，前5位依次為檞皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)、美迪紫檀素(Medicarpin)。

圖11 “苓甘五味姜辛湯成分-哮喘靶點-通路”網絡

2.6 分子對接結果 將核心成分檞皮素、山柰酚、β-谷甾醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、美迪紫檀素分別與核心靶點STAT3、JUN、TNF、IL6、MAPK3進行分子對接。配體與受體的結合自由能越低，構象越穩(wěn)定，表明兩者的親和力越強[11]。一般情況，結合自由能小于0則表明配體與受體可自發(fā)結合[12]。本研究分子對接得到的結合自由能均為負值，說明親和力較好，結果見表2。其中β-谷甾醇與TNF的結合自由能最低(-13.5 kcal/mol)，應用PyMOL對其分子對接結果進行可視化，見圖12。

圖12 β-谷甾醇與TNF對接模式

表2 分子對接結果

3 討論

3.1 苓甘五味姜辛湯組方分析 哮喘屬中醫(yī)“哮病”、“喘證”等范疇。中醫(yī)學強調“痰”在哮病中的作用，認為本病發(fā)生與肺脾腎虛、宿痰內伏有關，因外感、飲食、情志、勞倦等誘因而引觸[13]?！安√碉嬚撸斠詼厮幒椭?，故溫肺化飲為哮喘的常用治法，經方可選用苓甘五味姜辛湯。方中干姜為君，入肺、脾經，既溫肺化飲，又溫脾化濕。細辛為方中臣藥，溫肺散寒化飲，助干姜溫散凝聚之寒飲。茯苓健脾滲濕，既可化已聚之痰，又能杜生痰之源，亦為臣藥?？却站茫睾纳⒎螝?，方中諸藥又是以辛散溫燥之藥為主，恐更傷肺氣，故佐以五味子斂肺止咳，與干姜、細辛為伍，一散一收，開闔相濟，散不傷正，收不留邪，既防辛散耗傷肺氣，又使肺臟宣降有權。使以甘草和中，調和藥性。全方配伍，共奏溫肺化飲之功[14]。臨床研究表明，苓甘五味姜辛湯治療哮喘效果顯著，可以更好地控制哮喘發(fā)作，改善肺功能，使臨床癥狀好轉[15]。

3.2 苓甘五味姜辛湯治療哮喘核心成分分析 本研究通過中藥復方網絡藥理學和分子對接的方法,初步篩選出苓甘五味姜辛湯治療哮喘的核心成分為檞皮素、山柰酚、β-谷甾醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、美迪紫檀素等。槲皮素是一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、止咳、平喘、抗過敏等作用，可預防過敏原及血小板活化因子誘導的支氣管阻塞以及支氣管高反應性。動物實驗表明,槲皮素保護支氣管哮喘小鼠的作用與下調白細胞介素(IL)-4、IL-5等有關，對氣道炎癥具有抑制作用，可緩解哮喘反應[16]。山柰酚可抑制肥大細胞脫顆粒，還可以通過阻止Akt激活來降低Th2細胞因子和TNF-α水平，對細胞外調節(jié)蛋白激酶也有抑制作用，起到抑制氣道上皮細胞和平滑肌細胞增生肥大的作用，有利于減輕氣道狹窄[17]。β-谷甾醇具有抗炎及免疫調節(jié)作用，可抑制巨噬細胞IL-6活性，減少腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性因子分泌[18]。研究表明,β-谷固醇具有抗哮喘作用，可顯著增加潮氣量并減少呼吸頻率，降低嗜酸性粒細胞和中性粒細胞水平，抑制Th2細胞因子的合成和釋放[19]。美迪紫檀素等黃酮類化合物可以通過抑制Ⅳ型變態(tài)反應起到抗哮喘的作用[20]。關于7-甲氧基-2-甲基異黃酮對于哮喘的作用目前暫無研究，可能是新的發(fā)現(xiàn)，尚有待實驗研究進一步驗證。

3.3 苓甘五味姜辛湯治療哮喘核心靶點分析 本研究根據(jù)PPI網絡得到核心靶點STAT3、JUN、TNF、IL6、MAPK3。STAT3是一種細胞信號轉導與轉錄激活因子，哮喘患者支氣管黏膜組織信號傳導及轉錄激活因子(STAT)3水平顯著升高。干擾STAT3基因可減輕哮喘氣道損傷，其作用機制與抑制JAK/STAT信號通路激活、炎癥細胞因子的分泌、細胞內氧化應激反應有關[21]。研究表明，STAT3能有效誘導IL-6的免疫反應，可調節(jié)哮喘氣道炎癥，而STAT3 mRNA的表達與肺功能指標呈負相關[22]。轉錄激活因子AP-1是由JUN參與編碼的轉錄因子，AP-1家族成員在激活免疫系統(tǒng)及控制細胞反應中起重要作用，可調節(jié)IL-4的表達，此外AP-1過度活化是哮喘糖皮質激素抵抗的機制[23]。TNF-α在哮喘患者體內存在高表達現(xiàn)象，TNF-α是單核巨噬細胞產生的多肽，和機體炎癥、免疫反應密切相關，可激活T淋巴細胞分泌NO等介質，參與氣道炎性反應和肺上皮細胞損傷過程，從而導致哮喘發(fā)生[24]。IL-6在哮喘發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，能活化B淋巴細胞和T淋巴細胞，在哮喘急性期調節(jié)前列腺素等炎性遞質的合成與分泌，還能誘導血清中抗體水平的升高[25]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)參與核因子κB(NF-κB)跨膜轉錄活性的調節(jié)，而NF-κB信號轉導通路和哮喘氣道重塑關系密切[26]，此外，芯片實驗與熒光定量驗證結果表明，MAPK3與哮喘炎癥發(fā)展密切相關[27]。

3.4 苓甘五味姜辛湯治療哮喘信號通路分析 富集分析得到的TNF信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路等均與哮喘關系密切，主要與氣道炎癥、免疫、氣道平滑肌相關。JUN、TNF、IL6、MAPK3等核心靶點均位于TNF信號通路上，TNF在減輕、維持和增強炎癥反應過程中起到調節(jié)作用，在哮喘發(fā)病機制中具有重要作用[28]。哮喘急性發(fā)作時，TNF-α通路激活，引起細胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-8和Caspase-3水平升高，使細胞凋亡發(fā)生，最終誘發(fā)哮喘[29]。特異性阻斷TNF-α的藥物可延緩疾病進程，控制并緩解炎癥[30]。缺氧誘導因子(HIF)是適應缺氧的關鍵介質，可增強各種靶基因的轉錄，通過調節(jié)代謝來降低氧依賴性途徑[31]。研究表明，HIF-1α可與下游靶蛋白血管內皮生長因子(VEGF)協(xié)同作用，促使嗜酸粒細胞等炎癥細胞浸潤，并參與氣道重塑，在哮喘的發(fā)生中具有重要作用[32]。Toll樣受體對于哮喘具有雙重作用，能加劇或改善氣道炎癥反應，Toll樣受體信號可以通過干擾B細胞的免疫球蛋白同種型轉換或通過干擾參與過敏性炎癥的細胞，從而影響早發(fā)型哮喘反應和晚發(fā)型哮喘反應[33]。體內及體外試驗表明，NOD1和NOD2介導的免疫機制是通過調節(jié)人體嗜酸性粒細胞和支氣管上皮細胞的相互作用，調節(jié)表面黏附分子及細胞內IL-4Ra表達，刺激過敏性哮喘趨化因子和細胞因子釋放[34]。PI3K-Akt信號通路在支氣管哮喘中起著重要作用，特異性PI3K抑制劑可以顯著下調小鼠肺組織Akt的磷酸化，抑制Th2細胞因子產生、嗜酸性粒細胞浸潤、黏液產生以及氣道高反應性?？赡嫘詺獾雷枞窍闹匾卣鳎渲饕獧C制是氣道平滑肌的功能異常，而鈣信號是調節(jié)氣道平滑肌細胞功能的重要機制，鈣通道在哮喘氣道高反應性和氣道重塑中具有重要作用[35]。

4 小結

本研究通過網絡藥理學的方法，初步發(fā)現(xiàn)苓甘五味姜辛湯中的檞皮素、山柰酚、β-谷甾醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、美迪紫檀素等成分，可能通過TNF信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路等多種途徑，作用于STAT3、JUN、TNF、IL6、MAPK3等哮喘靶點，從而發(fā)揮緩解氣道炎癥、調節(jié)免疫和氣道平滑肌等作用。本研究通過AutoDock分子對接對研究結果進行驗證，對接結果的結合自由能均為負，靶蛋白與配體分子的親和力較強。綜上所述，本研究通過網絡藥理學和分子對接的方法，初步探討了苓甘五味姜辛湯治療哮喘的潛在作用機制，為進一步實驗研究提供了理論基礎和依據(jù)。