無花果葉提取物對重癥肺炎大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制的初步探討

徐志育，謝曉紅，朱 永，李 娜

0 引言

重癥肺炎(Severe pneumonia，SP)是一種急性呼吸道感染性疾病，也是全球范圍內(nèi)常見的高死亡率疾病之一[1]。研究表明，包括H1N1、H5N1和H7N9在內(nèi)的流感病毒可誘發(fā)SP，此外，還有一些細(xì)菌，如肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌也可引起SP[2-3]。SP病理機(jī)制復(fù)雜，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量，探索有效的治療途徑是治療SP的關(guān)鍵。

細(xì)胞間黏附分子-1(Intercellular adhesion molecule，ICAM-1)主要在支氣管和肺泡的上皮細(xì)胞以及間皮和內(nèi)皮細(xì)胞間表達(dá)，是免疫球蛋白超家族的成員之一。ICAM-1可與細(xì)胞表面的β2整合素特異性結(jié)合，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞與各內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性降低，減少細(xì)胞之間的信號傳導(dǎo)[4]。巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(Macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)是由多種細(xì)胞響應(yīng)感染或損傷而釋放的因子，能夠調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的浸潤和微膿腫的形成[5]。已有研究表明，MIP-2與NF-κB結(jié)合后,與中性粒細(xì)胞發(fā)揮的作用密切相關(guān)，在呼吸道感染過程中參與了肺損傷的發(fā)展[6]。由此可見，消除這些引發(fā)炎癥感染的核心因子對于SP的治療至關(guān)重要。

無花果(FicuscaricaL.)屬于?？茻o花果屬植物，其化學(xué)成分較多，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，此外，無花果葉也具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤以及降血脂血糖等作用[7-8]。而無花果葉對于SP是否也發(fā)揮作用未見報道，本研究觀察了無花果葉提取物對SP大鼠肺組織的影響,并初步探討其作用機(jī)制，以期為SP的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 65只SPF 級雄性 SD 大鼠，體重180～220 g，購于海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 主要試劑 無花果葉提取物購自西安天瑞生物技術(shù)有限公司，肺炎克雷伯菌液由醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室提供，IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α ELISA檢測試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)研究所，HE染色試劑和免疫組化染色試劑購自北京索萊寶科技公司，Trizol試劑購自美國Thermo 公司，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自日本TAKARA公司，PVDF膜與ECL發(fā)光液購自中國碧云天生物技術(shù)研究所，抗體ICAM-1、MIP-2、NF-κB p65、p65、p-IκBα、IκBα購自英國Abcam 公司，抗體辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和GAPDH購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 重癥肺炎大鼠造模 取50只大鼠，術(shù)前12 h禁食不禁水，麻醉后頸部消毒并剃毛，無菌條件下將頸部皮膚切開，暴露上段氣管，用1 ml注射器經(jīng)氣管注入 0.3 ml肺炎克雷伯菌液(生理鹽水稀釋約 3.6×108CFU/只)，將大鼠在固定臺直立保持20 s，以菌液分布均勻，縫合傷口，進(jìn)行消毒。接種后，當(dāng)大鼠出現(xiàn)行動遲緩、呆滯、呼吸急促等現(xiàn)象，且脈搏血氧儀檢測大鼠后足部血氧飽和度(SaO2)小于90 %，則判定重癥肺炎大鼠建模成功。

1.3 給藥處理 將建模成功的 45 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、低劑量無花果葉提取物組(低劑量組)及高劑量無花果葉提取物組(高劑量組)，另將15只未經(jīng)任何處理的大鼠設(shè)為正常組，共4組，每組15只。低劑量組、高劑量組分別給予無花果葉提取物50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)灌胃，對照組和模型組均灌胃等量蒸餾水，連續(xù)8周，觀察期間大鼠自由攝食、飲水。

1.4 ELISA法檢測IL-4、IL-6、IL-10及TNF-α水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠腹主動脈取血，室溫靜置2 h，于4 ℃離心機(jī)中以3 500 r/min 離心 15 min，分離上清液，按照ELISA試劑盒檢測方法，檢測各組大鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10 及TNF-α水平。

1.5 HE染色檢測肺組織病理變化 采血后處死大鼠，摘取肺組織，一部分固定在10%福爾馬林溶液中，一部分保存于-80 ℃冰箱。肺組織固定后取出，脫水透明，浸蠟過夜，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切成厚度為4 μm的切片，脫蠟至水，加入蘇木精染色5 min，滴加鹽酸乙醇分化液分化數(shù)秒，氨水處理5 s，加入伊紅染色3 min，使用二甲苯透明、中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察肺組織病理變化情況并采集圖像。

1.6 免疫組化染色檢測ICAM-1和MIP-2表達(dá) 取制備的大鼠肺組織石蠟切片，脫蠟至水，在微波爐中進(jìn)行高溫修復(fù)，滴加內(nèi)源性過氧化物酶在37 ℃下孵育15 min，再使用5% 山羊血清在室溫下封閉1 h，將切片分別與稀釋的鼠抗ICAM-1(1∶200)、MIP-2抗體(1∶200)放在4 ℃下孵育過夜，次日，PBS洗滌，加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000)，加入 DAB 顯色后，蘇木精復(fù)染后洗滌，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并采集圖像，使用Image J軟件對圖像進(jìn)行測定分析。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR檢測ICAM-1、MIP-2 mRNA表達(dá) 取保存于-80 ℃冰箱的各組大鼠肺組織，剪碎后研磨勻漿，Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測 RNA純度與濃度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，GAPDH 作為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性20 s，60 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸 45 s，循環(huán) 40 次，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。采用2-ΔΔCt 法計(jì)算各基因mRNA相對表達(dá)量。引物由上海吉瑪生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成：ICAM-1 上游引物：5′-CGAATTCGGAGGTGCCCAGACGTC-3′，下游引物：5′-CCGCTCGAGTCAGGGTGTGGT-3′，MIP-2上游引物：5′-CCCAATGTCGCTCACTACTTCC-3′，下游引物：5′-CGTCAGCCCGTATGTCTTCC-3′，GAPDH上游引物：5′-GGCGTGAACCACGAGAA GTATAA-3′，下游引物：5′-CCCTCCACGATGCCAAAGT-3′。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測NF-κB p65、p65、p-IκBα及IκBα 蛋白水平 大鼠肺組織加入預(yù)冷的RIPA 裂解液研磨裂解肺組織，以 12 000 r/min 離心 5 min，獲得上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取25 μg總蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳分離，將分離蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。TBST 洗滌3 次，5%山羊血清進(jìn)行封閉 2 h，洗滌并加入一抗抗體，在4 °C下孵育過夜。次日TBST 洗膜 3 次，加入二抗，室溫孵育2 h。TBST后，滴加ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，采用Image J圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算各蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10 及TNF-α含量比較 模型組大鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α含量較對照組均顯著增加(P<0.05)，IL-4的含量較對照組顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量無花果提取物組IL-6、IL-10、TNF-α的含量均顯著下降(P<0.05)，而IL-4含量顯著增加(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)情況(n=10,pg/ml)

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化 對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)受損，肺泡萎陷，腔內(nèi)有血滲出，肺泡間隔斷裂，可見大量炎性細(xì)胞浸潤；低劑量組、高劑量組大鼠肺泡腔滲血和炎性細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象較模型組減輕，見圖1。

圖1 HE染色檢測各組大鼠肺組織病理學(xué)變化(100×)

2.3 各組大鼠肺組織ICAM-1和MIP-2免疫組化染色結(jié)果比較 對照組大鼠肺組織中染色較少較淺，ICAM-1陽性表達(dá)率低；模型組中ICAM-1陽性表達(dá)率較對照組顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組大鼠肺組織中ICAM-1陽性表達(dá)率顯著下降(P<0.05)，見圖2。

圖2 免疫組化染色檢測大鼠肺組織ICAM-1表達(dá)(100×)

與對照組比較，模型組大鼠肺組織中MIP-2陽性表達(dá)率顯著增加(P<0.05)；低劑量組與模型組之間MIP-2陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而高劑量組大鼠肺組織中MIP-2陽性表達(dá)率較模型組顯著下降(P<0.05)，見圖3。

圖3 免疫組化染色檢測大鼠肺組織MIP-2表達(dá)(100×)

2.4 各組大鼠肺組織ICAM-1和MIP-2 mRNA與蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，模型組與低、高劑量組大鼠肺組織中ICAM-1、MIP-2 的mRNA相對表達(dá)量和蛋白相對表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量組大鼠肺組織中ICAM-1、MIP-2 的mRNA相對表達(dá)量和蛋白相對表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖4、圖5。

圖4 qRT-PCR檢測大鼠肺組織中ICAM-1、MIP-2 mRNA表達(dá)水平

圖5 Western blot檢測大鼠肺組織中ICAM-1、MIP-2 蛋白表達(dá)水平

2.5 各組大鼠肺組織NF-κB p65、p65、p-IκBα 及IκBα蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織中NF-κB p65、p-IκBα蛋白相對表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量組大鼠肺組織中NF-κB p65、p-IκBα蛋白相對表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，見圖6和表2。

表2 各組大鼠肺組織中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)情況(n=6)

圖6 Western blot檢測大鼠肺組織中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

重癥肺炎是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，是各種傳染病中死亡的主要原因，如不進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹委?，可在?shù)日內(nèi)迅速引起呼吸衰竭、感染性休克甚至死亡。肺炎的嚴(yán)重程度取決于兩個過程，即免疫抵抗和組織適應(yīng)力。免疫抵抗是指宿主通過減少、殺死或清除導(dǎo)致感染的活菌的能力。組織適應(yīng)力是指病原微生物侵入機(jī)體時，宿主對病原微生物的承受或耐受能力。其中，抵御途徑是通過限制病原體或免疫抵抗途徑引起的損害來減少病理生理過程[9]。肺炎克雷伯桿菌是一種革蘭陰性致病菌，是肺炎常見的病原體之一，其進(jìn)入下呼吸道后會引起肺泡毛細(xì)血管充血水腫，炎性細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象[10]。本研究通過大鼠經(jīng)氣管注入肺炎克雷伯菌液后發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)受損，肺泡萎陷，腔內(nèi)有血滲出，肺泡間隔斷裂，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，這表明本研究中SP大鼠模型構(gòu)建成功。

在本研究中，SP大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇，表現(xiàn)為血清中促炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α的含量升高，以及抗炎癥因子IL-4的含量減少。炎癥反應(yīng)在SP的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[11]。有報道，無花果葉具有抗炎作用。Che-Ahmad Tantowi等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，無花果葉提取物通過抑制炎癥和軟骨降解酶來減輕絕經(jīng)后骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)破壞。Zakaria等[13]的研究指出，無花果葉提取物通過抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中的促炎細(xì)胞因子而發(fā)揮抗炎的特性。此外，Joerin 等[14]通過構(gòu)建高脂血癥大鼠模型，發(fā)現(xiàn)花果葉提取物干預(yù)6周后，可以明顯下調(diào)血清三酰甘油和 IL-6 水平，從而起到降低血脂的作用。本研究結(jié)果顯示，給予無花果葉提取物的大鼠，其肺組織中炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象減輕，血清中IL-6、IL-10、TNF-α的含量均下降，IL-4的含量增加，表明無花果葉提取物能夠抑制SP大鼠的炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)肺組織的作用。

NF-κB是慢性炎性疾病中的重要轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)多種炎癥反應(yīng)，微生物產(chǎn)物和促炎細(xì)胞因子都可能觸發(fā)NF-κB途徑，并形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[15]。本研究結(jié)果顯示，在注入肺炎克雷伯菌液后，大鼠肺組織內(nèi)NF-κB p65、p-IκBα蛋白相對表達(dá)量均升高，同時通路相關(guān)因子ICAM-1和MIP-2表達(dá)增加，但經(jīng)過一定劑量的無花果葉提取物治療后，肺組織內(nèi)NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達(dá)受到明顯抑制，并且下調(diào)了ICAM-1和MIP-2的表達(dá)。ICAM-1是免疫球蛋白樣黏附分子超家族的成員，該家族介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附，并參與多種心血管疾病，包括缺血-再灌注損傷、心肌梗死、動脈粥樣硬化以及其他一些疾病的發(fā)生與發(fā)展過程[16-17]。當(dāng)呼吸道受到刺激或損害時，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞可合成并分泌MIP-2，其進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥因子發(fā)生浸潤，同時，在NF-κB激活后，可促進(jìn)MIP-2的產(chǎn)生[18]。結(jié)果表明，無花果葉提取物對SP大鼠肺組織的保護(hù)作用可能與抑制NF-κB信號通路的激活相關(guān)。

綜上所述，無花果葉提取物能夠改善SP大鼠的肺損傷程度，抑制炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與下調(diào)ICAM-1和MIP-2的表達(dá)和抑制NF-κB信號通路激活相關(guān)，為研究無花果葉提取物在SP中的抗炎作用提供了新的思路。