黃芪甲苷調(diào)控p62-Nrf2通路對抗小鼠淋巴細胞白血病耐藥株的機制研究*

王曉玲，楊小娟，鄭倩倩，侯夢雪，王旭，汪濤

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 301617）

白血病是一類源于骨髓造血干/祖細胞異?？寺≡鲋承约膊?，其發(fā)病率與病死率均居于惡性腫瘤前列[1]?；熓桥R床首選方法，但常出現(xiàn)耐藥，這已成為臨床難以突破的瓶頸，且是白血病復(fù)發(fā)的主因，尋找具有減毒增效、逆轉(zhuǎn)耐藥作用的藥物有重要意義。當臨床使用順鉑（DDP）長期治療時，腫瘤細胞會激活核因子紅細胞樣2相關(guān)因子2（Nrf2）通路，促進其下游抗氧化基因如醌氧化還原酶1、血紅素氧化酶1（HO-1）及藥物轉(zhuǎn)運體蛋白的表達產(chǎn)生耐藥。腫瘤細胞耐藥過程十分復(fù)雜，常涉及多個通路，包括Nrf2 通路與自噬、核因子 κB（NF-κB）等，而多功能銜接蛋白p62可能是信號通路交互作用的樞紐[2]。

白血病致病因素較多，多因虛致病，因病致虛，邪盛正虛，虛實夾雜，邪毒入髓傷血?！胺稣钚?，固本培元”是抗腫瘤的基本治則。黃芪是抗腫瘤常用扶正配方藥味之一，黃芪甲苷（AST Ⅳ）是其主要藥效成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種功效。AST Ⅳ是否可協(xié)同DDP聯(lián)合抗腫瘤，發(fā)揮減毒增效、逆轉(zhuǎn)耐藥等作用，尚不明確。本實驗旨在基于p62-Nrf2通路探討AST Ⅳ對抗白血病細胞耐藥的干預(yù)機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 小鼠淋巴細胞白血病順鉑耐藥細胞株（L1210/DDP）購自美軒生物技術(shù)有限公司；AST Ⅳ標準品購自甄準生物公司；DDP購自Sigma公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自Gbico公司；熒光探針 2’，7’-二氯二氫熒光素（DCFH-DA）、細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Nrf2通路抑制劑ML-385購自Med Chem Express公司；鹽酸維拉帕米（VER）購自美侖生物技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光適時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（Real time PCR）試劑盒和引物購自寶生物工程有限公司；細胞周期及凋亡檢測試劑盒購自三箭生物技術(shù)有限公司；蛋白定量試劑盒、蛋白裂解液購自索萊寶科技有限公司；p62、Nrf2、HO-1、B 淋巴細胞瘤-2基因（bcl-2）及半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）一抗購自CST公司、bcl-2相關(guān)蛋白X（bax）一抗購自Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 在37℃5%二氧化碳（CO2）條件下，L1210/DDP細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng) 1～2 d，繼而用含 4、6、8 μg/mL DDP的完全培養(yǎng)基先后培養(yǎng)細胞1～2 d，再脫藥培養(yǎng)1～2 d，進行后續(xù)實驗。

將細胞分成空白組（blank，L1210/DDP）、模型組（model，L1210/DDP+8 μg/mL DDP）、黃芪甲苷組（AST Ⅳ，model組+100 μg/mL AST Ⅳ）、鹽酸維拉帕米（VER，model組+70 μg/mL VER）、Nrf2 通路抑制劑（ML385，model組+2 μmol/L ML385）組及抑制劑與黃芪甲苷組（ML385+AST Ⅳ，ML385組+100 μg/mL AST Ⅳ）6組。

1.3 CCK-8法檢測細胞對DDP的敏感性 將L1210/DDP細胞以5×105個/mL種于96孔板，待生長至對數(shù)期，按blank、model、AST Ⅳ及VER實驗組進行藥物干預(yù)48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，搖勻培養(yǎng)3 h后，酶標儀檢測OD值，細胞增殖抑制率=（1-藥物組OD值/對照組OD值）×100%。

1.4 流式細胞儀檢測細胞的ROS水平 將L1210/DDP細胞以1×106個/mL種于6孔板，待生長至對數(shù)期，按blank、model、AST Ⅳ及VER實驗組進行藥物干預(yù)48 h，收集細胞后磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌 2 次，1 000 r/min，離心 5 min，離心半徑 10 cm，棄上清，用含 DCFH-DA 探針的培養(yǎng)基（1∶1 000）懸浮細胞，37℃孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻一下，PBS洗滌3次后懸浮細胞，上機檢測。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期、凋亡率的變化 將L1210/DDP細胞以1×106個/mL種于6孔板，依實驗6個分組培養(yǎng)48 h后，PBS洗滌2次，1 000 r/min，離心5min，離心半徑10cm，棄上清液。取1×105個/mL細胞分別加入 500 μL Binding Buffer、5 μL 膜聯(lián)蛋白 Annexin V-FITC、5 μL 碘化丙錠（PI）混勻，室溫避光反應(yīng)15 min后，上機檢測凋亡率變化，并設(shè)空白對照與單染組。其余細胞逐滴加入70%預(yù)冷乙醇固定，4℃過夜保存，100 μL RNaseA溶液重懸細胞，37℃水浴30 min后加入400 μL PI混勻，4℃避光孵育30 min后上機檢測細胞周期變化。

1.6 Real time PCR檢測實驗各組細胞p62-Nrf2通路節(jié)點基因的表達變化 從GenBank中查找到小鼠的 β-actin、p62、Nrf2、HO-1、bcl-2、bax 及 Caspase-3基因序列，用Primer5．0軟件設(shè)計引物。依試劑盒操作說明提取實驗6組細胞的總RNA，并將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA產(chǎn)物用作定量PCR擴增的模板，進行PCR擴增反應(yīng)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT相對定量法分析。見表1。

表1 各檢測基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of each detected gene

1.7 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測實驗各組細胞p62-Nrf2通路節(jié)點基因的蛋白表達變化 收集實驗6個組細胞后，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA試劑盒檢測細胞蛋白濃度。每組分別取20 μg蛋白，12%SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉室溫封閉，4℃過夜，緩沖液洗去未結(jié)合一抗，加入二抗室溫封閉2 h，滴加顯色液，凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，Image J軟件對顯影條帶進行定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥細胞L1210/DDP對DDP敏感性的變化 與model組相比，AST Ⅳ、VER組L1210/DDP細胞增殖抑制率明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），而AST Ⅳ組與VER組細胞增殖抑制率比較無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 耐藥細胞增殖抑制率及ROS的變化（±s）Tab.2 Changes of proliferation inhibition rate and ROS in drug-resistant cells（±s）

表2 耐藥細胞增殖抑制率及ROS的變化（±s）Tab.2 Changes of proliferation inhibition rate and ROS in drug-resistant cells（±s）

注：與 blank 組相比，*P＜0．05；與 model組相比，#P＜0．05；與 AST Ⅳ組相比，△P＜0．05。

組別 n A值 增殖抑制率（%） ROS（%）blank 組 6 1．302±0．046#△ 0 96．340±1．431 model組 6 1．187±0．060*△ 8．83 96．917±0．174 AST Ⅳ組 6 1．084±0．029*# 16．74 93．563±0．566 VER 組 6 1．076±0．031*# 17．36 95．513±0．110#

2.2 耐藥細胞L1210/DDP ROS水平的變化 與model組相比，AST Ⅳ、VER組ROS水平呈下降趨勢，以VER 組下降顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。見表2。

2.3 耐藥細胞L1210/DDP細胞周期的變化 與model組相比，除blank組，實驗各組G0/G1期細胞百分比呈減少趨勢，AST Ⅳ、VER組S期細胞百分比呈增加趨勢，出現(xiàn)S期阻滯，同時AST Ⅳ組G2/M期細胞百分比也呈增加趨勢，表現(xiàn)為G2/M期阻滯；與AST Ⅳ組相比，實驗各組G0/G1期細胞百分比有增加趨勢，S期細胞百分比則均有減少趨勢，但除VER組外，而G2/M期細胞百分比以ML385及AST Ⅳ+ML385 組明顯減少，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）。見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率的變化（±s）Fig.1 Changes of cell cycle and apoptosis rate were detected by flow cytometry（±s）

2.4 耐藥細胞L1210/DDP凋亡率的變化 與model組相比，AST Ⅳ、VER組凋亡率呈升高趨勢，ML385組細胞凋亡率明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。與AST Ⅳ組相比，ML385組凋亡率顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），而 AST Ⅳ+ML385 組的細胞凋亡率較ML385組有所上升，見圖1。

2.5 耐藥細胞 L1210/DDP p62、Nrf2、HO-1、bcl-2、bax及Caspase-3等基因mRNA表達變化 與model組相比，實驗各組細胞p62 mRNA相對表達量均有下調(diào)趨勢，ML385 組作用效果顯著（P＜0．05）；HO-1 mRNA 表達均顯著減少（P＜0．05）；bcl-2/bax mRNA表達量除AST Ⅳ+ML385組外均顯著下調(diào)（P＜0．05）；AST Ⅳ組、VER 組 Caspase-3 mRNA 表達均上調(diào)，AST Ⅳ組更明顯（P＜0．05），而 ML385 組、AST Ⅳ+ML385組的Caspase-3 mRNA表達有下調(diào)趨勢。與AST Ⅳ組相比，AST Ⅳ+ML385組的HO-1 mRNA表達顯著減少（P＜0．05）；ML385 組、AST Ⅳ+ML385 組的Caspase-3 mRNA表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），見表3。

表3 p62-Nrf2通路各關(guān)鍵基因mRNA表達情況（±s）Tab.3 The mRNA expression of the key genes in p62-Nrf2 pathway（±s）

表3 p62-Nrf2通路各關(guān)鍵基因mRNA表達情況（±s）Tab.3 The mRNA expression of the key genes in p62-Nrf2 pathway（±s）

注：與 model組比較，*P＜0．05；與 AST Ⅳ組比較，#P＜0．05。

組別 n p62 Nrf2 HO-1 bcl-2/bax Caspase3 model組 6 1．00±0．00 1．00±0．00 1．00±0．00 1．00±0．0# 1．00±0．0 AST Ⅳ組 6 0．70±0．14 1．10±0．06 0．63±0．14*0．36±0．29*1．81±0．53*VER 組 6 0．84±0．18 1．29±0．36 0．50±0．07*0．32±0．19*1．43±0．24 ML385 組 6 0．59±0．20*1．05±0．23 0．52±0．12*0．31±0．27*0．66±0．10#AST Ⅳ+ML385 組 6 0．76±0．24 0．98±0．26 0．40±0．13*#0．61±0．49 0．77±0．45#

2.6 耐藥細胞 L1210/DDP p62、Nrf2、HO-1、bcl-2、bax及Caspase-3等蛋白表達變化 與model組相比，其他各組p62蛋白表達量均有減少趨勢；Nrf2蛋白表達量均有上調(diào)趨勢，且VER、AST Ⅳ+ML385組顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；HO-1、bcl-2/bax蛋白的表達均呈下調(diào)趨勢；除ML385組外，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達均有上升趨勢。與AST Ⅳ組相比，Nrf2蛋白表達量VER組、AST Ⅳ+ML385 組均明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），見圖2。

圖2 p62-Nrf2通路各關(guān)鍵蛋白表達變化Fig.2 Changes of the key protein expression in p62-Nrf2 pathway

3 討論

白血病屬中醫(yī)“血癥”“虛勞”“癥瘕”等范疇。扶正祛邪是其基本治則，補氣養(yǎng)血、益氣養(yǎng)陰以扶正，清熱解毒、活血祛瘀、化痰散結(jié)以祛邪。黃芪因具有補氣升陽，益氣固表等功效，常被醫(yī)家用于治療白血病氣血兩虛證，黃芪在體內(nèi)外均有抗腫瘤作用，這與其主要藥效成分AST Ⅳ密切相關(guān)，AST Ⅳ通過抑制腫瘤細胞侵襲遷移、增殖分化并誘導(dǎo)其凋亡，逆轉(zhuǎn)耐藥及增強機體免疫對抗腫瘤[3-4]，并因腫瘤細胞種類不同效果存在差異性。本實驗也驗證了AST Ⅳ通過干擾細胞周期，造成S、G2/M期阻滯，抑制L1210/DDP細胞增殖，還通過上調(diào)Caspase-3基因表達及下調(diào)bcl-2/bax的表達比促進其凋亡，逆轉(zhuǎn)了腫瘤細胞化療耐藥，療效可與經(jīng)典的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑鹽酸維拉帕米（verapamil）相媲美。

DDP屬金屬鉑類絡(luò)合物，具有親核親電子特性，易與核酸堿基中的鳥嘌呤、腺嘌呤等的殘基形成共價鍵，也可與細胞的多種結(jié)構(gòu)如核糖體、剪接體、端粒酶中的RNA及蛋白質(zhì)中蛋氨酸，組氨酸和半胱氨酸等親核殘基相互作用，常在線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核及胞漿中積累，誘發(fā)細胞應(yīng)激反應(yīng)[5]。DDP既能激活腫瘤細胞死亡通路，也可誘發(fā)癌細胞的適應(yīng)性反應(yīng)如自噬、未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)和其他利于生存的信號如NF-κB、Nrf2[2]。細胞的最終命運是信號網(wǎng)絡(luò)串話的結(jié)果，而p62作為信號樞紐，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、Nrf2等關(guān)鍵分子的泛素化過程，連接自噬和凋亡信號，參與細胞生死之間的微妙平衡，此調(diào)控的分子基礎(chǔ)與p62的多個功能結(jié)構(gòu)域有關(guān)，如與非典型激酶結(jié)合并介導(dǎo)p62自異構(gòu)化的PB1區(qū)、促進NF-κB通路激活的ZZ區(qū)、與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6結(jié)合的TB區(qū)、與Keap1相互作用的KIR區(qū)、通過自噬或泛素-蛋白酶體系統(tǒng)募集泛素連接蛋白促其降解的UBA區(qū)及與LC3相互作用的LIR區(qū)。當DDP進入細胞與線粒體結(jié)合時，導(dǎo)致細胞色素C釋放、鈣依賴性線粒體腫脹和ROS產(chǎn)生，誘發(fā)氧化應(yīng)激，降低細胞基因組的穩(wěn)定性[6]。此時，腫瘤細胞內(nèi)Nrf2與其錨定蛋白氧化應(yīng)激感受器Keap1發(fā)生解聚，轉(zhuǎn)位入核與抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合，啟動下游靶基因表達，如Ⅱ相解毒酶、抗氧化反應(yīng)酶及ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白等，來抵抗化療藥物損傷，參與化療耐藥過程[2]。研究發(fā)現(xiàn)，p62可介導(dǎo)Keap1經(jīng)自噬途徑降解，通過非經(jīng)典通路激活Nrf2，且p62表達也受Nrf2調(diào)控，并形成一個抗氧化反應(yīng)的p62-Nrf2-p62正反饋循環(huán)[7]。

前期實驗發(fā)現(xiàn)，與親本株相比，耐藥細胞株L1210/DDP存在Nrf2通路異常激活，而本實驗發(fā)現(xiàn)與模型組相比，AST Ⅳ可協(xié)同DDP作用于耐藥株，下調(diào)p62-Nrf2通路的關(guān)鍵基因p62的表達，使Keap1蛋白降解減少，在一定程度上抑制了Nrf2非經(jīng)典通路激活，降低了腫瘤細胞HO-1的表達，減弱了細胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的能力，對DDP的敏感性增強。另外有研究顯示Keap1還可結(jié)合破壞NF-κB通路的正調(diào)節(jié)因子IKKB，抑制NF-κB的促瘤作用，且抗凋亡的bcl-2蛋白也為Keap1-泛素連接酶復(fù)合體的底物，Keap1可減少bcl-2-bax異二聚體形成，促進腫瘤細胞凋亡[6]。并且有研究報道，對SKOV3/DDP卵巢癌細胞進行p62 RNAi后，顯著抑制p65核易位，下調(diào)NF-κB調(diào)控的促存活信號，進而逆轉(zhuǎn)癌細胞的DDP耐藥性[8]，因NF-κB信號調(diào)控著至少400個參與增殖、凋亡和炎癥相關(guān)的編碼基因，包括凋亡相關(guān)bcl-2家族及Caspase家族的基因，這提示在逆轉(zhuǎn)L1210/DDP化療耐藥過程中也可能存在著AST Ⅳ抑制NF-κB通路的靶向作用，但仍需進一步探討。bcl-2蛋白通過抑制細胞色素C的釋放，阻止胞質(zhì)內(nèi)細胞色素C對Caspase的激活來抑制細胞凋亡[9]。本實驗顯示，AST Ⅳ可通過降低bcl-2/bax蛋白表達比增加耐藥癌細胞的凋亡率，與Nrf2通路抑制劑ML385聯(lián)用效果更佳。這些研究結(jié)果或可輔證AST Ⅳ減毒增效的機制。ML385通過直接與Nrf2蛋白相互作用，阻止Nrf2-MAFG復(fù)合體與啟動子ARE序列的結(jié)合、減少Nrf2轉(zhuǎn)錄活性，抑制其下游靶基因p62、HO-1的表達。但本實驗中p62-Nrf2通路個別的節(jié)點、靶基因在基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯水平的調(diào)控?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異，如與AST Ⅳ組相比，AST Ⅳ+ML385組p62、HO-1蛋白表達呈上調(diào)趨勢，這可能與實驗樣本量較少有關(guān)造成分析誤差，或存在其他通路如NF-κB交互調(diào)控有關(guān)，尚待進一步研究。本研究說明就癌細胞耐藥p62調(diào)控機制、AST Ⅳ的具體減毒增效的機制而言，還有許多研究的空白亟需深入探討，相關(guān)的研究成果或可為對抗白血病化療耐藥的中藥藥物篩選及臨床應(yīng)用提供啟示。