安腸愈瘍湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜屏障的修復(fù)作用及機(jī)制研究*

孫大娟，王晗潞，王帥，遲莉麗

（1．山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院脾胃病科，濟(jì)南 250000；2．山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250000）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種涉及感染、免疫、遺傳等多因素的慢性非特異性炎癥性腸病[1]。近20年來，中國UC的發(fā)病率急劇增加[2]，但其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，目前認(rèn)為腸黏膜屏障功能受損是其重要病理改變，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]，故維護(hù)腸黏膜屏障的完整性和通透性是其治療的關(guān)鍵[4-5]。目前西醫(yī)治療藥物主要以5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等為主[6]，療效確切、起效快，但不良反應(yīng)大、復(fù)發(fā)率高[7]。中藥具有修復(fù)腸黏膜損傷等作用，可長期維持緩解、降低復(fù)發(fā)率，在防治UC方面具有獨(dú)特優(yōu)勢[8-11]。前期臨床實(shí)驗(yàn)[12-15]發(fā)現(xiàn)安腸愈瘍湯具有健脾理氣、化濕助運(yùn)、清熱解毒的作用。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從動物實(shí)驗(yàn)方面觀察安腸愈瘍湯對UC大鼠咬合蛋白（Occludin）、緊密連接蛋白 1（Claudin-1）及白細(xì)胞介素-13（IL-13）/酪氨酸激酶（JAK1）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子6（STAT6）信號通路的調(diào)控作用，探討其修復(fù)腸黏膜屏障的機(jī)制，為中醫(yī)藥治療UC提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 36只SPF級雄性SD大鼠購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司，體質(zhì)量（200±20）g，動物合格證號：SCXK（魯）20190003，動物倫理審查批件號：AWE-2019-002。動物飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心，溫度20～26℃，相對濕度40%～70%，12 h光照和12 h避光循環(huán)交替。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 安腸愈瘍湯是山東省名中醫(yī)遲莉麗教授自擬方，藥物組成：生黃芪30g，敗醬草30g，黃連 9g，黃芩 9g，炒白術(shù) 30g，薏苡仁 30g，木香 9g，檳榔 15 g，地榆炭 15 g，白及 15 g，當(dāng)歸 9 g，炒白芍12 g，防風(fēng)6 g，生甘草9 g。藥材購于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，并在本院制劑室浸泡、煎煮、過濾、濃縮，按照所需配成高、中、低濃度藥液，生藥含量為分別為 0．375、0．75、1．5 g/mL，置于 4 ℃冰箱保存。美沙拉嗪緩釋顆粒（法國Ethypharm公司，批號：190108）。

1.1.3 主要試劑和儀器 葡聚糖硫酸鈉（DSS，MW36000-50000）（美國 MP Biomedicals公司，批號：0216011080）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1120）；兔多克隆IL-13抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-0560R）；兔單克隆STAT6抗體、JAK1抗體（英國Abcam 公司，批號：ab217998、ab133666）；兔單克隆Occludin抗體、Claudin-1抗體（英國Abcam公司，批號：ab167161、ab180158）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：Cat．#ZB-2301）；Claudin-1、Occludin、JAK1、STAT6、IL-13、PCR引物均由寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司設(shè)計合成。全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；冷凍高速離心機(jī)（美國Thermo Scientific公司）；RT-6000自動酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；FluorChem Q蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)（美國Proteinsimple公司）；電泳、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）；PCR儀（德國Roche公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模及分組給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組：空白組（6只），模型組（6只），中藥低、中、高劑量組（各6只，簡稱低、中、高劑量組）和美沙拉嗪對照組（6只）。除空白組外，其余各組均連續(xù)7 d自由飲用4．5%DSS溶液，并于飲用DSS溶液第2天開始進(jìn)行藥物灌胃，依據(jù)《實(shí)驗(yàn)動物和動物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》動物給藥量計算，根據(jù)大鼠與人的體表面積等效劑量比值進(jìn)行折算，中藥低、中、高劑量組分別給予含生藥為 0．375、0．75、1．5 g/mL的中藥灌胃，美沙拉嗪對照組以0．035 g/mL的美沙拉嗪混懸液灌胃，空白組、模型組均以去離子水灌胃，以上各組均每次2 mL，每日1次，連續(xù)2周。

1.2.2 標(biāo)本的采集與處理 干預(yù)結(jié)束后，將大鼠麻醉后取距肛門1 cm以上的結(jié)腸組織，沖洗干凈后，肉眼觀察炎癥、潰瘍情況，取病變最明顯的組織，一部分結(jié)腸組織固定、包埋、切片后，HE染色，由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師顯微鏡下觀察，并參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行組織病理學(xué)評分。另一部分結(jié)腸組織于-80℃冰箱凍存，分別用于Occludin、Claudin-1蛋白、基因表達(dá)及IL-13、JAK1、STAT6的基因表達(dá)。

1.2.3 Western Blot法檢測 Occludin、Claudin-1 蛋白的表達(dá) 先于液氮中研磨、裂解結(jié)腸組織，離心收集上清液，提取總蛋白，采用蛋白濃度測定（BCA）測定其濃度。取含有40 μg的蛋白溶液為上樣量，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入結(jié)合一抗、二抗，再分別洗膜后，避光顯色2 min，再置于全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行掃描。量化標(biāo)準(zhǔn)為目標(biāo)蛋白灰度值與標(biāo)準(zhǔn)蛋白灰度值的比。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測結(jié)腸組織 Occludin、Claudin-1、IL-13、JAK1、STAT6 的表達(dá) 參照RNAiso Plus說明書采用RNAiso Plus提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA、熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以GADPH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算，引物序列見表1。擴(kuò)增引物見表1。

表1 目的基因與內(nèi)參基因引物序列信息表Tab.1 Primer sequence information of target genes and internal reference genes

1.3 相關(guān)性分析 除空白組外，將各組中檢測的Occludin和Claudin-1基因表達(dá)量逐一與 JAK1、STAT6、IL-13的基因表達(dá)量使用Spearman相關(guān)分析，計算出相關(guān)系數(shù)（γ），測定P值，從而分析各指標(biāo)之間的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 24．0統(tǒng)計軟件，計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson線性相關(guān)，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化

2.1.1 病理學(xué)觀察結(jié)果 模型組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)不完整，局部可見隱窩消失及隱窩炎，大量淋巴漿細(xì)胞浸潤，炎癥累及黏膜下層?？瞻捉M結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，隱窩結(jié)構(gòu)存在，密集排列，固有層少量淋巴漿細(xì)胞浸潤。低劑量組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)較模型組好轉(zhuǎn)，隱窩結(jié)構(gòu)輕度改建，固有層大量炎性細(xì)胞浸潤。高劑量組、美沙拉嗪組結(jié)腸組織趨于正常，隱窩結(jié)構(gòu)改建，少量炎細(xì)胞浸潤。中劑量組結(jié)腸組織病理變化程度介于低劑量組和高劑量組之間。見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理改變（HE，×200）Fig.1 Pathological changes of colon tissue in rats of each group(HE，×200)

2.1.2 病理學(xué)評分結(jié)果 與空白組比較，模型組結(jié)腸組織病理學(xué)（HPS）評分升高（P＜0．01）；與模型組比較，各用藥組 HPS 評分均下降（P＜0．01），其中高劑量組低于低、中劑量組（P＜0．01 或 P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；高劑量組與美沙拉嗪組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)評分（±s）Tab.2 Colon mucosal histopathology score of rats in each group（±s） 分

表2 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)評分（±s）Tab.2 Colon mucosal histopathology score of rats in each group（±s） 分

注：與空白組比較，**P＜0．01；與模型組比較，##P＜0．01；與美沙拉嗪組比較，△△P＜0．01。

組別 動物數(shù) HPS評分空白組 6 2．50±2．07模型組 6 15．33±1．51**低劑量組 6 9．50±2．51##△△中劑量組 6 5．33±1．16##△△高劑量組 6 1．83±1．60##美沙拉嗪組 6 2．83±1．17##

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織Occludin、Claudin-1的蛋白及基因相對表達(dá)水平比較

2.2.1 Occludin、Claudin-1的蛋白表達(dá) 1）Occludin表達(dá)：模型組較空白組明顯下調(diào)（P＜0．01），各用藥組較模型組均明顯上調(diào)（P＜0．01）；美沙拉嗪組不同程度優(yōu)于低、中劑量組（P＜0．01 或 P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。與高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。2）Claudin-1 表達(dá)：模型組較空白組下調(diào)（P＜0．01），各用藥組較模型組均上調(diào)（P＜0．01），美沙拉嗪組優(yōu)于低、中劑量組（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。與高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。見表3、圖2。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織Occludin、Claudin-1蛋白表達(dá)（±s）Tab.3 Expression of Occludin and Claudin-1 protein in rat colon of each group（±s）

表3 各組大鼠結(jié)腸組織Occludin、Claudin-1蛋白表達(dá)（±s）Tab.3 Expression of Occludin and Claudin-1 protein in rat colon of each group（±s）

注：與空白組比較，**P＜0．01；與模型組比較，##P＜0．01；與美沙拉嗪組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。

組別 動物數(shù) Occludin Claudin-1空白組 6 1．00±0．00 1．00±0．00模型組 6 0．45±0．12** 0．66±0．03**低劑量組 6 0．71±0．13##△△ 0．83±0．02##△△中劑量組 6 0．96±0．12##△ 0．98±0．04##△△高劑量組 6 1．05±0．14## 1．25±0．13##美沙拉嗪組 6 1．11±0．03## 1．42±0．20##

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織Occludin、Claudin-1蛋白變化Fig.2 Changes of Occludin and Claudin-1 protein in colonic tissues of rats in each group

2.2.2 Occludin、Claudin-1的基因表達(dá) 1）Occludin基因表達(dá)：模型組較空白組下調(diào)（P＜0．05），各用藥組較模型組均上調(diào)（P＜0．01），美沙拉嗪組不同程度優(yōu)于低、中劑量治療組（P＜0．01 或 P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。與高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。2）Claudin-1 基因表達(dá)：模型組較空白組下調(diào)（P＜0．01），各用藥組較模型組均上調(diào)（P＜0．01），美沙拉嗪組優(yōu)于低、中劑量組（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。與高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。見表4。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織Occludin、Claudin-1基因表達(dá)（±s）Tab.4 Expression of Occludin，Claudin-1 gene in colon of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠結(jié)腸組織Occludin、Claudin-1基因表達(dá)（±s）Tab.4 Expression of Occludin，Claudin-1 gene in colon of rats in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，##P＜0．01；與美沙拉嗪組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。

組別 動物數(shù) 0ccludin Claudin-1空白組 6 1．00±0．00 1．00±0．00模型組 6 0．60±0．10* 0．58±0．08**低劑量組 6 0．79±0．15##△△ 0．84±0．15##△△中劑量組 6 1．02±0．18##△ 1．01±0．15##△△高劑量組 6 1．18±0．21## 1．31±0．22##美沙拉嗪組 6 1．30±0．20## 1．51±0．21##

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織IL-13、JAK1、STAT6基因轉(zhuǎn)錄水平變化

2.3.1 IL-13基因表達(dá) 模型組較空白組下調(diào)（P＜0．01），中、高劑量組及美沙拉嗪組較模型組均上調(diào)（P＜0．01），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；美沙拉嗪組優(yōu)于中、低劑量組（P＜0．01），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。見圖3。

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織IL-13基因變化Fig.3 Changes of IL-13 gene in colon tissue of rats in each group

2.3.2 JAK1基因表達(dá) 模型組與空白組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），中、高劑量組及美沙拉嗪組較模型組均不同程度下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05 或 P＜0．01），低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；美沙拉嗪組優(yōu)于低劑量組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），與高劑量組、中劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。見圖4。

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織JAK1基因變化Fig.4 Changes of JAK1 gene in colonic tissues of rats in each group

2.3.3 STAT6基因表達(dá) 模型組與空白組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），各用藥組與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；美沙拉嗪優(yōu)于低、中劑量組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），與高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），見圖5。

圖5 各組大鼠結(jié)腸組織STAT6基因變化Fig.5 Changes of STAT6 gene in colon tissue of rats in each group

2.4 相關(guān)性分析結(jié)果 對Occludin和Claudin-1基因表達(dá)量逐一與JAK1、STAT6、IL-13的基因表達(dá)量使用Spearman相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Occludin和Claudin-1與 JAK1、STAT6表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，Occludin和Claudin-1與IL-13表達(dá)水平呈正相關(guān)，Occludin、Claudin-1 與 JAK1、STAT6、IL-13 的基因表達(dá)量具有相關(guān)性，具體數(shù)值見表5。

表5 Occludin、Claudin-1 與 JAK1、STAT6、IL-13的相關(guān)性分析Tab.5 Correlation analysis of Occludin，Claudin-1 and JAK1，STAT6，IL-13

3 討論

UC的治療目標(biāo)逐漸由誘導(dǎo)并維持臨床緩解、黏膜愈合、防治并發(fā)癥轉(zhuǎn)變?yōu)榭焖僬T導(dǎo)緩解、長期維持緩解、完全的黏膜愈合等[17]。最近更提出了深度緩解和達(dá)標(biāo)治療的新策略[18-20]，即經(jīng)過治療后，達(dá)到和緩解，這是治療UC的終極目標(biāo)。因此治療的關(guān)鍵是修復(fù)受損的腸黏膜屏障。Claudin-1蛋白作為腸黏膜機(jī)械屏障中緊密連接蛋白Claudins家族的一員，主要維護(hù)腸黏膜機(jī)械屏障的完整性和通透性[21]。Occludin蛋白是緊密連接中最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，參與緊密連接形成的信號調(diào)節(jié)[22-23]，研究表明，Occludin、Claudin-1表達(dá)下調(diào)，腸道通透性增加，導(dǎo)致腸腔內(nèi)的細(xì)菌、抗原物質(zhì)移位激活免疫細(xì)胞反應(yīng)，是UC發(fā)生的重要機(jī)制之一[24]。因此，上調(diào)Occludin、Claudin-1表達(dá)水平可以修復(fù)腸黏膜屏障，可能是治療UC的重要靶點(diǎn)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)[25]，針對JAK/STAT通路的靶向治療是修復(fù)腸黏膜屏障功能的重要突破點(diǎn)。STAT家庭共有7個成員，其中STAT6被證明在UC發(fā)病過程中可能發(fā)揮著重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用[26-28]。研究表明[29-30]，IL-13主要的信號通路為JAK/STAT途徑，在UC中，抗炎細(xì)胞因子IL-13與IL-13RA結(jié)合，通過JAK/STAT途徑，磷酸化STAT6，啟動轉(zhuǎn)錄以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)，參與腸上皮細(xì)胞的緊密連接、抗凋亡和黏膜修復(fù)過程。所以，通過激活I(lǐng)L-13/JAK/STAT6信號通路，加速腸道屏障功能的修復(fù)，是治療UC的核心環(huán)節(jié)。

Kim等[31]研究發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)中STAT3核轉(zhuǎn)位增多，Occludin等多種腸屏障結(jié)構(gòu)的蛋白基因表達(dá)降低。衛(wèi)江鵬等[32]研究亦顯示，UC患者腸黏膜Occludin和Claudin-1蛋白表達(dá)低于正常腸黏膜，而STAT3蛋白高于正常腸黏膜，兩者間呈負(fù)相關(guān)，且病情越嚴(yán)重，相關(guān)性越明顯。本研究結(jié)果也顯示，安腸愈瘍湯各用藥組Occludin、Claudin-1基因、蛋白表達(dá)水平較模型組均不同程度上調(diào)，且高劑量組效果較好。除低劑量組外其余用藥組不同程度激活I(lǐng)L-13/JAK1/STAT6通路的基因表達(dá)，高劑量組、美沙拉嗪組效果最好。Occludin和Claudin-1與JAK1、STAT6表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與IL-13表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示Occludin、Claudin-1基因表達(dá)可能與IL-13/JAK/STAT信號通路有相關(guān)性，中藥安腸愈瘍湯可能通過激活I(lǐng)L-13/JAK1/STAT6信號通路，上調(diào)Occludin和Claudin-1的表達(dá)水平，促進(jìn)UC大鼠腸黏膜修復(fù)。通過激活I(lǐng)L-13/JAK1/STAT6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路修復(fù)腸黏膜屏障，可能是治療UC的一個新靶點(diǎn)。