仙芪眩寧顆粒對豚鼠耳蝸膜迷路積水AQP2表達的影響

武學潤，楊東，王銘歆，趙樹君，葉艷

（1．天津中醫(yī)藥大學實訓教學部，天津 301617；2．天津醫(yī)科大學總醫(yī)院耳鼻喉科，天津 300050；3．天津醫(yī)科大學朱憲彝紀念醫(yī)院內(nèi)分泌研究所，衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點實驗室，天津 300134）

梅尼爾病（MD）是以膜迷路積水為主要病理特征的內(nèi)耳疾病，表現(xiàn)為反復發(fā)作性眩暈，感音神經(jīng)性耳聾，耳鳴、耳悶脹感。膜迷路積水也稱內(nèi)淋巴積水，病理表現(xiàn)為誘因所導致的內(nèi)耳缺氧、變態(tài)反應使毛細血管壁通透性增高，內(nèi)淋巴產(chǎn)生過多或內(nèi)淋巴囊吸收障礙[1]。研究已證實與水通透性相關的轉運蛋白-水通道蛋白（AQPs）之一的內(nèi)耳水通道蛋白2（AQP2）表達增加參與膜迷路積水發(fā)生的病理過程[2-3]。臨床發(fā)現(xiàn)以仙鶴草、黃芪、白術、澤瀉為主的仙芪眩寧顆粒對于痰濕中阻型MD具有一定輔助治療作用。本研究在構建醋酸去氨加壓素誘導的豚鼠膜迷路積水模型的基礎上，觀察仙芪眩寧顆粒治療后的豚鼠內(nèi)耳AQP2的表達變化，進而從分子水平探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與分組 由北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心提供[許可證號：SCXK（京）2019-0006]SPF級健康白化豚鼠50只，體質量300 g左右，耳廓Preyer反射靈敏，耳鏡檢查無中耳疾病。按隨機數(shù)字表法分為5組，每組10只：正常對照組（Control組）、模型組（Model組）、低劑量治療組（LT組）、中劑量治療組（MT組）、高劑量治療組（HT組）。

1.1.2 構建模型及干預治療 Model組與各治療組豚鼠均參照文獻[3-4]方法，腹腔注射醋酸去氨加壓素 4 μg/kg，連續(xù) 7 d，第 8 天以 6 μg/kg 再注射 3 d，建立膜迷路積水模型，Control組予1 mL生理鹽水腹腔注射。仙芪眩寧顆粒溶解于雙蒸水，自第11天開始分組喂飼，LT組、MT組、HT組劑量分別為6．1、12．2、24．4 g/kg，連續(xù)治療 7 d，Control組、Model組以雙蒸水替代。

1.1.3 主要試劑及設備 醋酸去氨加壓素（海南中和制藥股份有限公司，批號：20181202）、抗AQP2多克隆抗體（Biorbyt公司，orb10123）、抗 β-actin抗體（武漢愛博泰克，AC028）、兔SP試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，SP-9001）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，ZLI-9019）、辣根酶標記羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，ZB-2301）；國際聽力客觀聽覺測試平臺（丹麥，EclipseEP25型）、數(shù)字掃描電鏡（HITACHI公司，Regulus 8100型）、多樣品組織研磨機（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，Tissuelyser-48型）、全波長掃描酶標儀（BioTek公司，SynergyMx型）、化學發(fā)光成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，MiniChemi 610型）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 聽性腦干反應（ABR）閾值檢測 隔音電屏蔽室內(nèi)操作，10%水合氯醛按250 mg/kg劑量將豚鼠進行腹腔注射麻醉，麻醉后將豚鼠俯臥位放置于固定臺上，記錄電極分別插入雙側耳后皮下，參考電極插于額部正中皮下，接地電極置于臀背部皮下。刺激聲為短聲，插入式耳機給聲，刺激頻率19．1 Hz，低通濾波1 500 Hz，高通濾波150Hz。給聲強度從80dB nHL開始以10dB nHL遞減，疊加次數(shù)2000次，接近閾值時以5 dB nHL遞減，以能分辨出可重復的Ⅲ波的最低刺激強度為ABR閾值。

1.2.2 耳蝸取材及切片制取 豚鼠麻醉方法同上，腹主動脈取血處死后快速斷頭取聽泡，打開聽泡暴露耳蝸，將耳蝸置于4%多聚甲醛固定48 h，10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液（pH 7．2）在 4℃下脫鈣3周，梯度乙醇逐級脫水，石蠟包埋，平行蝸軸連續(xù)制取4 μm厚切片。用于蛋白定量的豚鼠耳蝸組織直接凍存于液氮中待用。

1.2.3 膜迷路積水評價 耳蝸石蠟切片常規(guī)HE染色，采集圖像運用Image J圖像處理軟件測定耳蝸切片各回中階和前庭階橫截面積，計算R值=中階面積/中階+前庭階面積和，取平均值評價各組豚鼠膜迷路積水程度的差異[5]。

1.2.4 耳蝸Corti器超微結構觀察 豚鼠耳蝸以2%戊二醛固定，10%EDTA脫鈣，1%鋨酸固定1 h，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）漂洗后剝除耳蝸骨殼揭除前庭膜，暴露內(nèi)外毛細胞，以30%～100%梯度乙醇脫水，100%丙酮液中過夜。二氧化碳臨界點干燥、粘托，真空噴金，日立數(shù)字掃描電鏡觀察耳蝸Corti器區(qū)域。

1.2.5 免疫組化方法檢測豚鼠耳蝸AQP2表達 耳蝸切片常規(guī)梯度脫蠟，按照SP免疫組化試劑盒說明書操作，AQP2抗體工作液（1∶200），DAB 顯色、蘇木素復染、脫水、透明、封片，圖像采集。Image J圖像處理軟件測定AQP2積分光密度（IOD）。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法測定豚鼠耳蝸AQP2表達 耳蝸組織于蛋白裂解液，經(jīng)超聲粉碎、離心取上清蛋白提取液，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、5%BSA 封閉，AQP2 抗體工作液（1∶2 000），β-actin 抗體工作液（1∶5 000），二抗工作液（1∶3 000），ECL發(fā)光液避光孵膜、曝光，采集圖像，Image J圖像處理軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24．0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 聽力ABR閾值比較 Model組ABR閾值高于Control組（P＜0．05），差異有統(tǒng)計學意義，提示 Model組豚鼠聽力受損；LT組、MT組、HT組各治療組均可使聽力受損得以恢復，表現(xiàn)為3個治療組ABR閾值與 Control組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。見表1。

表1 各組豚鼠ABR反應閾值比較（±s）Tab.1 Comparison of ABR threshold in each group（±s）dB nHL

表1 各組豚鼠ABR反應閾值比較（±s）Tab.1 Comparison of ABR threshold in each group（±s）dB nHL

注：與 Control組比較，*P＜0．05。

組別 動物數(shù) ABR閾值Control組 10 17．00±4．22 Model組 10 23．50±6．69*LT 組 10 18．50±4．74 MT 組 10 17．50±4．86 HT 組 10 18．00±3．50

2.2 膜迷路積水程度比較 Control組豚鼠耳蝸前庭階、中階、鼓階等組織結構正常，R值中階面積約占中階、前庭階面積和的30%左右；Model組豚鼠耳蝸切片HE染色顯示前庭膜向前庭階膨隆，表現(xiàn)為不同程度的膜迷路積水，提示膜迷路積水模型成功，各治療組R值均低于Model組，與Control組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。Model組豚鼠耳蝸前庭膜向前庭階膨隆，中階面積與中階及前庭階面積和的比值R增高，與Control組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。見圖1。

圖1 各組豚鼠耳蝸形態(tài)學改變（×100）Fig.1 Morphological changes of the cochleas of guinea pigs in each group detected with HE staining(×100)

2.3 豚鼠耳蝸Corti器區(qū)域掃描電鏡結果 Control組豚鼠耳蝸Corti器外毛細胞的靜纖毛呈V形排列整齊，Model組外毛細胞靜纖毛有明顯融合、倒伏，缺失，排列紊亂甚至消失，LT組、MT組、HT組組外毛細胞靜纖毛呈V字形排列整齊，僵直度趨于正常。見圖2。

圖2 各組豚鼠耳蝸Corti器掃描電鏡（×1 000）Fig.2 Morphological changes of the cochlear organ of Corti in guinea pig by scanning electron micrograph(×1 000)

2.4 免疫組化染色結果 與Control組相比，Model組血管紋、螺旋韌帶、Corti器、基底膜AQP2均有較高表達（P＜0．01），而仙芪眩寧顆粒 LT 組、MT 組、HT組治療組AQP2表達水平較Model組有所降低，并趨于正常表達水平，Control組與各治療組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。見圖3。

圖3 各組豚鼠耳蝸AQP2表達（DAB染色，×100）Fig.3 Expression of AQP2 in cochleas of guinea pigs in each group detected by DAB staining(×100)

2.5 Western Blot法蛋白定量結果 與Control組相比，Model組、LT組AQP2蛋白表達增高，而HT組其表達減低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），各治療組AQP2表達水平低于Model組，并隨治療劑量的增高而減少。見圖4。

圖4 Western-blot法測定各組豚鼠耳蝸AQP2表達水平Fig.4 The expression level of AQP2 in cochlea of guinea pigs in each group detected by Western blot

3 討論

MD在中醫(yī)納入“眩暈”范疇，強調(diào)頭眩之證多因于痰，有“無痰不作?！崩碚摗，F(xiàn)代醫(yī)家結合膜迷路積水的病理本質，認為痰飲內(nèi)停為MD發(fā)病的關鍵[6]。MD病理基礎是內(nèi)淋巴液穩(wěn)態(tài)失衡造成的膜迷路積水，作為一種與水代謝相關的內(nèi)耳疾病與AQPs緊密相關。AQPs對維持生物體的液體平衡和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要的作用，分布于各組織器官AQPs的表達失衡或功能障礙會導致多種疾病，現(xiàn)代中醫(yī)也提出AQPs調(diào)控異常與痰飲的形成有關[7]。人體AQPs的11種亞型中AQP1-5表達于內(nèi)耳，其中特異性AQP2與MD緊密相關[8]。韓紅蕾等[9]研究發(fā)現(xiàn)廣泛分布于豚鼠內(nèi)耳的AQP1表達較穩(wěn)定，而特異性AQP2主要分布于內(nèi)耳的血管紋、Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和內(nèi)淋巴囊中，在膜迷路積水的豚鼠模型中AQP2的表達上調(diào)。冷輝等[10]也提出AQP2高表達與AQP5低表達可能協(xié)同參與了豚鼠膜迷路積水的形成。

Takeda等[11]發(fā)現(xiàn)MD患者血漿中血管加壓素（AVP）水平明顯增高，將AVP持續(xù)小劑量微泵注射豚鼠皮下后，豚鼠耳蝸出現(xiàn)輕－中度內(nèi)淋巴積水，由此推測膜迷路積水與血漿AVP異常分泌有關。值得關注的是AQP2是AQPs中唯一對AVP敏感的蛋白通道，內(nèi)耳AVP-AQP2通路異常已成為MD膜迷路積水的重要機制之一[12]。天然AVP的長效衍生物去氨加壓素為AVP的V2受體激動劑，特異性作用于V2受體，可啟動AVP-AQP2通路誘導AQP2表達上調(diào)，由此采用腹腔注射去氨加壓素法可簡單易行誘發(fā)豚鼠膜迷路積水模型，形態(tài)學可見耳蝸前庭膜向前庭階膨隆[3，13]。

傳統(tǒng)中醫(yī)在MD治療中獨具特色，基礎研究也逐漸深入，蔣麗元等[6]通過艾灸聽宮穴可下調(diào)AQP2的表達進而減輕大鼠膜迷路積水程度。羅熾瓊等[7]研究發(fā)現(xiàn)苓桂術甘湯合澤瀉湯對前庭膜上AQP2的表達有下調(diào)作用，從而減輕膜迷路積水豚鼠模型的積水程度。臨床實踐證實中成藥仙芪眩寧顆粒治療MD具有一定療效，其中仙鶴草不但具有收斂止血，補脾益氣的功效，也可用于利水消腫的治療；黃芪則有補氣固表、利水消腫作用；白術、澤瀉為治療痰飲眩暈的傳統(tǒng)藥物，其配伍具有健脾燥濕，升清降濁和利水除痰的功效。然而仙芪眩寧顆粒在治療MD中的機制尚未明確，本研究在構建豚鼠內(nèi)耳膜迷路積水模型的基礎上予以治療，模型組豚鼠聽力受損ABR閾值升高，而仙芪眩寧顆粒LT組、MT組、HT組均可有效緩解豚鼠膜迷路積水程度，表現(xiàn)為聽力ABR閾值下降，與Control相比均未見統(tǒng)計學差異（P＞0．05）。通過形態(tài)學觀察到治療組豚鼠膜迷路積水明顯緩解，前庭膜膨出得以恢復。掃描電鏡結果也表現(xiàn)在超微結構上，Model組較Control組外毛細胞靜纖毛融合、倒伏、缺失、排列紊亂，而LT、MT、HT組外毛細胞的靜纖毛均排列整齊，僵直度趨于正常。針對內(nèi)耳特異性AQP2的表達，免疫組組織化學法觀察到Model組 AQP2 表達高于 Control組（P＜0．01），而各治療組趨于正常表達水平，組間也未見統(tǒng)計學差異（P＞0．05）。Western Blot法驗證 Model組 AQP2 的高表達，LT組、MT組、HT組可明顯降低AQP2的表達水平，并隨治療劑量的增高而減少，其中HT組AQP2表達水平低于 Control組（P＜0．01）。本研究表明仙芪眩寧顆粒可通過抑制AVP-AQP2通路糾正內(nèi)耳膜迷路積水，從而達到治療MD的目的。本研究較為深入地對仙芪眩寧顆粒治療MD的分子機制進行探討，進而為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。