西鄂爾多斯自然保護(hù)區(qū)沙冬青根際土壤細(xì)菌的分離培養(yǎng)研究

范明浩 內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)和草原工作總站

沙冬青又稱蒙古黃花木、冬青、蒙古沙冬青，是生長在亞洲中部地區(qū)的超旱生常綠豆科灌木，在我國多分布于內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏等海拔1000～1200米的低山地帶。沙冬青是古老的第三紀(jì)殘遺種，也是荒漠地域稀有的孑遺植物，是國家二級(jí)保護(hù)植物。沙冬青具有很強(qiáng)的耐寒、耐旱、耐高溫、抗逆和耐貧瘠等特性，是荒漠地區(qū)理想的防風(fēng)固沙造林樹種。

沙冬青的研究受到國內(nèi)外生態(tài)學(xué)、地理學(xué)、生理學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科研究學(xué)者的普遍關(guān)注。關(guān)于沙冬青的科學(xué)研究對(duì)揭示其瀕危機(jī)制、制定科學(xué)合理的保護(hù)措施和有效的開發(fā)利用對(duì)策具有重要的科學(xué)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。目前，關(guān)于沙冬青土壤微生物的研究較少。由于其自然生長條件惡劣，且多年來遭受過度采伐，沙冬青分布面積逐年減少，并出現(xiàn)了分布破碎化的情況，急需采取措施減緩其衰退趨勢。土壤細(xì)菌是荒漠土壤微生物系統(tǒng)的重要成分，是沙生植物根際微生物的重要組成之一，研究土壤細(xì)菌對(duì)沙冬青的保護(hù)具有重要意義。

為了探究沙冬青的土壤細(xì)菌群落，本研究采集了沙冬青的根際土壤，并通過梯度稀釋涂布對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)、菌種的純化及革蘭氏染色，并對(duì)菌落的形態(tài)進(jìn)行描述。本研究共獲得13 個(gè)菌種，菌種的菌落形態(tài)差異特征明顯，且以放線菌群為主，可為今后沙冬青的保護(hù)提供微生物資源。

一、實(shí)驗(yàn)地自然概況

西鄂爾多斯國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)是研究我國西北地區(qū)生物多樣性的重點(diǎn)區(qū)域，是一個(gè)以保護(hù)古老孑遺瀕危植物、草原向荒漠過渡的植被帶和多樣的生態(tài)系統(tǒng)為主要目的的綜合性自然保護(hù)區(qū)。該區(qū)地處鄂爾多斯高原西緣至黃河?xùn)|岸，地理范圍大致以賀蘭山—阿爾巴斯山—狼山構(gòu)成的三角核心區(qū)為中心，總面積4719.89 平方公里（包括烏海轄區(qū)168.98 平方公里），其中，核心區(qū)面積1113.12 平方公里，緩沖區(qū)面積534.79 平方公里，實(shí)驗(yàn)區(qū)面積2903 平方公里。海拔1000～2100 米；無霜期129 天，年平均降水量272.3 毫米，年平均蒸發(fā)量2470.4 毫米，年平均風(fēng)速3.2 米/秒，最大風(fēng)速24.2 米/秒。保護(hù)區(qū)內(nèi)現(xiàn)已查明的野生維管植物共有64 科215 屬433 種。其中，沙冬青、四合木、半日花是在西鄂爾多斯國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)生長的古地中海孑遺植物，研究價(jià)值極大。

二、材料與方法

1.樣品采集

2019年7月，筆者在西鄂爾多斯國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)沙冬青分布比較集中的區(qū)域選擇3 個(gè)樣地，每個(gè)樣地相距1～2 公里。采集沙冬青根際土壤，裝入塑料袋中，并進(jìn)行編號(hào)。樣地1 采集樣品19 份，樣地2 采集樣品11 份，樣地3 采集樣品13 份。將采集的根際土壤當(dāng)天帶回內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)和草原工作總站實(shí)驗(yàn)室，放置于冰箱內(nèi)4℃條件下保存，并在一周內(nèi)進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)。

2.菌種的分離培養(yǎng)

從實(shí)驗(yàn)樣地共取到43 個(gè)土樣，對(duì)每個(gè)土樣菌種進(jìn)行分離培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用梯度稀釋涂布和平板劃線的方法進(jìn)行細(xì)菌分離，培養(yǎng)基為0.5 克琥珀酸鈉、0.4 克磷酸二氫鉀、0.1 克氯化鈉、0.002 克鉬酸鈉晶體、0.2 克氯化鈣、0.1 克磷酸氫二鉀、0.1 克氯化鐵、5 毫升BTB 溶液（5 克/升）和0.2 克七水硫酸鎂，加蒸餾水定容至1 升，加 8～16 克無氮瓊脂。

具體步驟：（1）取部分土樣研磨成粉末狀，置于10 毫升的生理鹽水中用搖床震蕩30 分鐘，培養(yǎng)溫度為37℃，靜置使之澄清。（2）取上清液用無菌水稀釋為10-1、10-2和10-3三個(gè)梯度。（3）將稀釋液置于80℃水中，10 分鐘后立即取出。（4）吸取200微升各個(gè)濃度稀釋液涂平板于LB固體培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度3 個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)18 小時(shí)。（5）挑取培養(yǎng)皿中的單菌落置于新的LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同步驟四。（6）仔細(xì)觀察后挑取形態(tài)大小不同的單菌落置于20 毫升液體LB 培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)18 小時(shí)，采用平板劃線分離法純化，一直到獲得純培養(yǎng)為止。

對(duì)43 個(gè)土樣都進(jìn)行上述細(xì)菌分離培養(yǎng)，經(jīng)過一周的培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿中都長了許多不同形態(tài)的菌落，從中挑取長勢良好的菌落進(jìn)行下一步純化培養(yǎng)。

3.菌種的純化

經(jīng)過分離培養(yǎng)后，挑取長勢良好的細(xì)菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，得到13 個(gè)菌種，在超凈工作臺(tái)對(duì)這13 個(gè)菌種進(jìn)行二次純化培養(yǎng)，純化培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)基相同，同時(shí)觀察菌落的形態(tài)特征并記錄。

4.革蘭氏染色

革蘭氏染色步驟參照微生物學(xué)的方法。

三、結(jié)果

1.菌種純化結(jié)果

經(jīng)過一周的培養(yǎng)獲得13 個(gè)菌種，不同菌種的菌落形態(tài)見表1，大致分為三類。第一類菌落都呈現(xiàn)出圓形或近圓形的白色匍匐狀的菌絲，中央伴有黑色的點(diǎn)狀小突起，在電子顯微鏡下可以觀察到菌絲和孢子（圖1）；第二類菌落為近圓形，白色，中間有黃色的膿狀物，在顯微鏡下可以觀察到菌絲和孢子（圖2）；第三類菌落呈現(xiàn)黃色的膿狀物，圓形，較小，有色澤，較光滑，并且易調(diào)?。▓D3）。

表1 不同菌種的菌落形態(tài)

圖1 第一類菌種菌落特征

圖2 第二類菌種菌落特征

圖3 第三類菌種菌落特征

2.革蘭氏染色結(jié)果

經(jīng)過革蘭氏染色后，編號(hào)為1～11 的菌種，可以看到藍(lán)紫色的菌絲和孢子，可確定為放線菌，如圖4。編號(hào)為12 的菌種可以觀察到藍(lán)色的菌絲、孢子，也為放線菌，如圖5。編號(hào)為13 的菌種，為革蘭氏陰性細(xì)菌，如圖6。

圖4 1～11 號(hào)菌種染色后的形態(tài)

圖5 12 號(hào)菌種染色后的形態(tài)

圖6 13 號(hào)菌種染色后的形態(tài)

四、討論

沙冬青生長的沙地環(huán)境十分特殊，特殊生境的土壤微生物資源具有很強(qiáng)的適應(yīng)性。在沙冬青保護(hù)地的土壤中分離鑒定土壤細(xì)菌、深入探究其多樣性具有極其重要的意義和巨大的應(yīng)用潛力。

本研究從43 個(gè)沙冬青根際土樣中分離純化共獲得13 個(gè)菌種，菌落形態(tài)有明顯差異，總體上可分為三大類，分別是圓形或近圓形的白色匍匐狀的菌絲，中央伴有黑色的點(diǎn)狀小突起；近圓形，白色，中間有黃色的膿狀物；呈現(xiàn)黃色的膿狀物，圓形，較小，有色澤，較光滑。

革蘭氏染色的結(jié)果表明分離獲得的菌種以放線菌為主，這可能與放線菌更適合在本研究采用的培養(yǎng)基中生長有關(guān)。王文曉等運(yùn)用高通量測序技術(shù)揭示了蒙古沙冬青根際土壤細(xì)菌群落，隸屬于15 門43綱68 目123 科185 屬；主要優(yōu)勢細(xì)菌群為藍(lán)菌門占65.74%、變形菌門占21.72%、放線菌門占6.28%；優(yōu)勢菌綱為α-變形菌綱、放線菌綱和γ-變形菌綱。與高通量測序的結(jié)果相比較，本研究獲得的菌種非常少，主要是因?yàn)楹芏辔⑸锊蝗菀妆环蛛x培養(yǎng)，并且與采樣時(shí)間、采樣地點(diǎn)、沙冬青的生長狀況以及氣象和土壤因子都有關(guān)系。盡管數(shù)量有限，但這些菌種可以通過后期與沙冬青進(jìn)行回接，探究不同菌種對(duì)沙冬青生長的影響，對(duì)沙冬青的原地保護(hù)具有借鑒意義。