黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的小滴玻璃化法超低溫保存

尹明華，李誠欣，李祥媛，劉凱盈，封 昀，盧 霞，柯維忠*

(1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001；2.上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗室，江西 上饒 334001；3.上饒市薯芋類作物種質(zhì)保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗室，江西 上饒 334001；4.上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，江西 上饒 334001)

【研究意義】黃獨(dú)(DioscoreabulbiferaL.)為薯蕷科薯蕷屬(Dioscorea)植物[1]，廣泛分布于世界各地，其地下塊莖又名黃藥子，是傳統(tǒng)的中藥材，性涼，味苦，能清熱解毒、涼血止血、化痰消癭[2]，具有抗菌、抗炎和抗腫瘤作用，臨床上一般用于治療食道癌、胃癌、直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、膀胱癌、肺癌及肉瘤等[3]。近年來，由于中藥市場對黃藥子的極大需求，黃獨(dú)野生資源遭受亂采濫挖造成野生資源急劇減少；此外，長期的零余子無性繁殖和自然退化等原因促使黃獨(dú)種質(zhì)資源即將面臨大量丟失的危險[4]，無法從根本上解決黃藥子供需矛盾問題。【前人研究進(jìn)展】植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為大量生產(chǎn)藥用次生代謝產(chǎn)物開辟了新途徑[5]，前人通過篩選高產(chǎn)細(xì)胞系、優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)技術(shù)等方法來提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物的合成[6]。黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞具有增殖快，再生強(qiáng)，體胚多等優(yōu)點(diǎn)[7]，并可通過生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)黃獨(dú)藥用成分[8]。黃獨(dú)胚性細(xì)胞懸浮細(xì)胞也是通過生物技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新的基礎(chǔ)。但是黃獨(dú)胚性細(xì)胞懸浮細(xì)胞的建立非常困難，且建立后要定期繼代。頻繁的繼代不僅耗費(fèi)大量的人力和物力，易受細(xì)菌和真菌的污染，還會導(dǎo)致體細(xì)胞變異和植株再生能力下降甚至完全喪失。因此，研究黃獨(dú)胚性細(xì)胞懸浮細(xì)胞的保存方法具有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，約有150～200種不同的植物可采用超低溫保存程序，但到目前為止，每種植物和每種組織類型的超低溫保存程序都需要根據(jù)所調(diào)查物種的脫水能力、外植體大小、外植體類型和含水量進(jìn)行經(jīng)驗調(diào)整[9]。Kartha等[10]開發(fā)的小滴玻璃化法超低溫保存是材料經(jīng)過裝載液及玻璃化液處理后,然后將材料放在含有玻璃化液滴的鋁箔紙再放入冷凍管內(nèi)投入液氮凍存的一種高效超低溫保存法，具有存活率和再生率高，具有廣適性，處理量大，操作簡易等優(yōu)點(diǎn)[11]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究將以黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞為材料，從預(yù)培養(yǎng)、裝載、脫水、化凍、洗滌和凍后培養(yǎng)等方面進(jìn)行單因子試驗，旨在建立和優(yōu)化黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞小滴玻璃化法超低溫保存的技術(shù)體系，為后續(xù)依賴體細(xì)胞胚發(fā)生體系的黃獨(dú)試管苗再生和藥用成分提取提供材料供給平臺。

1 材料與方法

1.1 材料

黃獨(dú)試管苗微型塊莖由上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室提供。

1.2 方法

1.2.1 胚性愈傷組織誘導(dǎo) 參考本課題組的方法[12]對黃獨(dú)試管苗微型塊莖進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。

1.2.2 胚性懸浮細(xì)胞體系建立 將黃獨(dú)試管苗微型塊莖的胚性愈傷組織接種到胚性懸浮細(xì)胞增殖液體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基配方為MS+ 2 mg/L TDZ +1 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L 2,4-D +0.09 mol/L蔗糖，pH 5.8～6.0。接種完后置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，溫度為(25±1)℃，光強(qiáng)2000 lx，光照時間14 h/d。

1.2.3 小滴玻璃化法超低溫保存 上述培養(yǎng)10 d后，取胚性懸浮細(xì)胞用于小滴玻璃化法超低溫保存試驗。0.2 g黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞在(25±1)℃下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)進(jìn)行2次單因子試驗：①預(yù)培養(yǎng)時間：將黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入MS+ 2 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA + 0.5 mg/L 2,4-D +0.8 mol/L蔗糖的液體培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)設(shè)置為0～5 d；②蔗糖濃度：將黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入MS+ 2 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA + 0.5 mg/L 2,4-D +0～1.2 mol/L蔗糖的液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)4 d。預(yù)培養(yǎng)條件：溫度為(25±1)℃，光強(qiáng)2000 lx，光照時間14 h/d。以僅未投入液氮保存(其他處理步驟與投入液氮保存一致)的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞為對照。

預(yù)培養(yǎng)完畢的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞在(25±1)℃和0 ℃下進(jìn)行裝載。裝載液為MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖(pH 5.8)，裝載時間設(shè)置為0～90 min。以僅未投入液氮保存(其他處理步驟與投入液氮保存一致)的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞為對照；裝載完畢的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞用100%PVS2(300 g/L甘油+150 g/L乙二醇+150 g/L二甲基亞砜+0.4 mol/L蔗糖，pH 5.8)進(jìn)行脫水。脫水溫度設(shè)置為0 ℃和(25±1)℃，脫水時間設(shè)置為0～120 min。以僅未投入液氮保存(其他處理步驟與投入液氮保存一致)的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞為對照；用移液槍吸取20 μL PVS2滴于鋁箔條上，將脫水完畢的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入鋁箔條PVS2液滴中，鋁箔條在液氮罐口停留數(shù)秒使鋁箔條PVS2凍凝，然后迅速將鋁箔條(附有黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞PVS2凍凝珠)放入裝滿液氮的冷凍管中，最后將冷凍管投入液氮保存，保存時間設(shè)置為1 d。以僅未投入液氮保存(其他處理步驟與投入液氮保存一致)的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞為對照；液氮保存1～180 d后，取出冷凍管鋁箔條，浸入恒溫預(yù)熱過的培養(yǎng)液(MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖，pH 5.8)進(jìn)行化凍?；瘍鰷囟仍O(shè)置為0、25、32、37和42 ℃。以僅未投入液氮保存(其他處理步驟與投入液氮保存一致)的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞為對照；化凍完畢的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞在(25±1)℃下用洗滌液(MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+0～1.6 mol/L蔗糖的液體培養(yǎng)基，pH 5.8)進(jìn)行洗滌，洗滌3次，每次洗滌時間為10 min。以僅未投入液氮保存(其他處理步驟與投入液氮保存一致)的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞為對照；化凍完畢的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基(MS+ 2 mg/L TDZ +1 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L 2,4-D +蔗糖30 g/L+7.5 g/L瓊脂粉，pH 5.8～6.0)上進(jìn)行凍后黑暗培養(yǎng)。凍后黑暗培養(yǎng)方式設(shè)置為：①直接置于光周期(光照14 h/d；光照強(qiáng)度2000 lx；溫度[(25±1)℃]下培養(yǎng)；②先黑暗[(25±1)℃]條件下培養(yǎng)5 d，然后轉(zhuǎn)至光周期(光照14 h/d；光照強(qiáng)度2000 lx；溫度[(25±1)℃]下培養(yǎng)。以僅未投入液氮保存(其他處理步驟與投入液氮保存一致)的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞為對照；凍后培養(yǎng)完畢的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞按Towill等[13]方法用TTC(氯化三苯基四氮唑還原法)法檢測其生活力。細(xì)胞相對存活率=(超低溫保存后細(xì)胞的TTC值/超低溫保存前細(xì)胞的TTC值)×100。其中TTC值測量方法如下：稱取洗滌后的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞20 mg，放入具刻度的10 d 試管中，加入5 mL TTC試劑，在黑暗、22～25 ℃下靜止培養(yǎng)18～20 h，吸去TTC溶液，用蒸餾水洗滌 2～3 次，然后加入5 mL 95%乙醇，將試管放入60 ℃水浴中加熱20～30 min，提取氯化三苯基四氮唑被脫氫酶還原后生成的紅色的三苯基甲(TTF)。最后用型分光光度計在485 nm波長處測試提取液的吸收值。用這種吸收值(TTC值)表示各處理的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞在超低溫保存后的細(xì)胞存活力。

1.2.4 凍后植株遺傳穩(wěn)定性檢測 將在上述增殖培養(yǎng)基上形成胚性愈傷組織后，30 d后將胚性愈傷組織塊接入分化培養(yǎng)基(MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂粉)上，50 d后將胚性愈傷組織分化的胚狀體再次轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂粉)上，60～70 d后黃獨(dú)胚狀體形成完整黃獨(dú)試管苗。采用本課題組的方法[14]對黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞凍后再生苗進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的RAPD分子標(biāo)記檢測[CTAB 法提取樣品基因組 DNA；PCR 擴(kuò)增體系(20 μL)為 DNA模板 2 μL，引物 1 μL，藍(lán)色 Mix 10 μL，去離子水 7 μL。PCR 擴(kuò)增程序為 94 ℃預(yù)變性 3 min，然后進(jìn)行40 個循環(huán)：94 ℃變性 30 s，36 ℃復(fù)性 50 s，72 ℃延伸 1.5 min；循環(huán)結(jié)束后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存；PCR 產(chǎn)物在 2.0%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測。 XZJ-17(3’-5’：ACGGATCCTG)、XZJ-18(3’-5’：GGCTGCAGAA)和XZJ-19(3’-5’：ACGCGCATGT)]。對照組設(shè)置為2個：一是以僅未投入液氮保存(其他處理步驟與投入液氮保存一致)的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞再生苗；二是常溫繼代培養(yǎng)的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞再生苗。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 以上實(shí)驗均重復(fù)3次，本實(shí)驗所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。以上實(shí)驗數(shù)據(jù)均用SPSS19.0軟件進(jìn)行One-Way ANOVA分析，再進(jìn)行LSD法檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)培養(yǎng)對胚性懸浮細(xì)胞凍后存活率的影響

從圖1可知，未經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率均處于最低值；經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)后，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率顯著增加，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時間繼續(xù)提高到4 d時，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率達(dá)到最高值。預(yù)培養(yǎng)液蔗糖濃度為0 mol/L，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率均較低；當(dāng)預(yù)培養(yǎng)液蔗糖濃度逐漸增加時，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率均顯著增加，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)液蔗糖濃度為0.8 mol/L時，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率均處于最高值。因此，黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞小滴玻璃化法超低溫保存的較佳預(yù)培養(yǎng)方式為(25±1)℃下在MS+ 2 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA + 0.5 mg/L 2,4-D +0.8 mol/L蔗糖的液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)4 d。

2.2 裝載對胚性懸浮細(xì)胞凍后存活率的影響

從圖2可知，未經(jīng)過裝載，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率均處于最低值；經(jīng)過裝載后，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率顯著增加，裝載時間為70 min時，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率均達(dá)到最高值。與0 ℃下裝載相比較，(25±1)℃下裝載可以顯著提高液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率。因此，黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞小滴玻璃化法超低溫保存的較佳裝載方式為(25±1)℃下在裝載液(MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖，pH 5.8)中裝載70 min。

圖1 預(yù)培養(yǎng)時間和蔗糖濃度對黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞相對存活率的影響Fig.1 The effect of preculture time and sucrose concentration on the relative survival rate of D.bulbifera L.suspension cells

圖2 裝載時間和裝載溫度對黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞相對存活率的影響Fig.2 The effect of loading time and loading temperature on the relative survival rate of D.bulbifera L.suspension cells

2.3 PVS2脫水對胚性懸浮細(xì)胞凍后存活率的影響

從圖3可知，未經(jīng)過裝載，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率均處于最低值；經(jīng)過PVS2脫水后，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率顯著增加，PVS2 100 min脫水后，未液氮凍存和液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率均均達(dá)到最高值。與(25±1)℃下PVS2脫水相比較，0 ℃下PVS2脫水可以顯著提高液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率。因此，黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞小滴玻璃化法超低溫保存的較佳PVS2脫水方式為0 ℃下在PVS2(300 g/L甘油+150 g/L乙二醇+150 g/L二甲基亞砜+0.4 mol/L蔗糖，pH 5.8)中脫水100 min。

2.4 液氮保存時間對胚性懸浮細(xì)胞凍后存活率的影響

從圖4可知，液氮保存時間為1、30、60、90、120、150和180 d時，黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞凍后存活率基本維持在89%～95%之間，相互之間無顯著性差異。因此，小滴玻璃化法超低溫保存可以保證黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的凍后存活率。

2.5 化凍對胚性懸浮細(xì)胞凍后存活率的影響

從圖5可知，隨著化凍溫度升高，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率也顯著提高，當(dāng)化凍溫度至37 ℃時，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率達(dá)到最高值。因此，黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞小滴玻璃化法超低溫保存的較佳化凍方式為凍后鋁箔條浸入37 ℃恒溫預(yù)熱過的培養(yǎng)液(MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖，pH 5.8)中化凍。

圖3 PVS2脫水時間和脫水溫度對黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞相對存活率的影響Fig.3 The effect of PVS2 dehydration time and dehydration temperature on the relative survival rate of D.bulbifera L.suspension cells

圖4 液氮保存時間對黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞相對存活率的影響Fig.4 The effect of conservation time in LN on the relative survival rate of D.bulbifera L.suspension cells

2.6 洗滌對胚性懸浮細(xì)胞凍后存活率的影響

從圖6可知，洗滌液蔗糖濃度為0時，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率均處于最低值；隨著洗滌液蔗糖濃度逐漸升高，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率顯著提高，洗滌液蔗糖濃度為1.2 mol/L時，液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率均達(dá)到最高值。因此，黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞小滴玻璃化法超低溫保存的較佳洗滌方式為在(25±1)℃下用洗滌液(MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+1.2 mol/L蔗糖的液體培養(yǎng)基，pH 5.8)進(jìn)行洗滌，洗滌3次，每次洗滌時間為10 min。

2.7 凍后培養(yǎng)對胚性懸浮細(xì)胞凍后存活率的影響

從圖7可知，凍后直接置于光周期下培養(yǎng)，液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率較低；凍后先黑暗培養(yǎng)5 d再置于光周期下培養(yǎng)，液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的相對存活率顯著增加。而對于未液氮凍存的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞，凍后直接置于光周期下培養(yǎng)以及凍后先黑暗培養(yǎng)5 d再置于光周期下培養(yǎng)均不會顯著影響其凍后存活率。因此，黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞小滴玻璃化法超低溫保存的較佳凍后培養(yǎng)條件為先黑暗培養(yǎng)5 d再置于光周期下培養(yǎng)。

圖5 化凍溫度對黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞相對存活率的影響Fig.5 The effect of thawing temperature on the relative survival rate of D.bulbifera L.suspension cells

圖6 洗滌液蔗糖濃度對黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞相對存活率的影響Fig.6 The effect of sucrose concentration of washing solution on the relative survival rate of D.bulbifera L.suspension cells

2.8 黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞小滴玻璃化法超低溫保存程序的驗證

為了驗證黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞小滴玻璃化法超低溫保存程序的可靠性，黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞(25±1)℃下在MS+ 2 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA + 0.5 mg/L 2,4-D +0.8 mol/L蔗糖的液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)4 d；(25±1)℃下在裝載液(MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖，pH 5.8)中裝載70 min；0 ℃下在PVS2(300 g/L甘油+150 g/L乙二醇+150 g/L二甲基亞砜+0.4 mol/L蔗糖，pH 5.8)中脫水100 min；凍后鋁箔條浸入37 ℃恒溫預(yù)熱過的培養(yǎng)液(MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖，pH 5.8)中化凍；(25±1)℃下用洗滌液(MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+1.2 mol/L蔗糖的液體培養(yǎng)基，pH 5.8)進(jìn)行洗滌，洗滌3次，每次洗滌時間為10 min；洗滌后先黑暗培養(yǎng)5 d再置于光周期下培養(yǎng)。結(jié)果表明：黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞凍后相對存活率為90.5%±4.4%。因此，黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞小滴玻璃化法超低溫保存程序較為可靠。

圖7 凍后培養(yǎng)條件對黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞相對存活率的影響Fig.7 The effect of culture conditions after cryopreservation on the relative survival rate of D.bulbifera L.suspension cells

2.9 凍后植株遺傳穩(wěn)定性的RAPD檢測

將液氮凍存和未液氮凍存黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上形成胚性愈傷組織(圖8)后，30 d后將胚性愈傷組織塊接入分化培養(yǎng)基(MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂粉)上，50 d后將胚性愈傷組織分化的胚狀體再次轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂粉)上，60 d后黃獨(dú)胚狀體形成完整黃獨(dú)試管苗(圖9)。以僅未液氮凍存(其他處理步驟與投入液氮保存一致)的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞再生苗以及黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞常溫繼代培養(yǎng)再生苗為對照，對黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞液氮凍存再生苗進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的RAPD分子標(biāo)記檢測(圖10)。結(jié)果表明黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞液氮凍存再生苗、黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞未液氮凍存再生苗和黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞常溫繼代培養(yǎng)再生苗的條帶數(shù)一致(圖11)，說明黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的小滴玻璃化法超低溫保存可以保證其遺傳穩(wěn)定性。

3 討 論

超低溫保存的細(xì)胞自由水含量顯著影響冷凍細(xì)胞的存活率[15]。使用高濃度的蔗糖進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)可以增強(qiáng)細(xì)胞分裂與分化的同步化，減少胞內(nèi)自由水含量，減少超低溫保存的冰晶生長對細(xì)胞膜的傷害[16]。山藥[17]、ByrsonimaintermediaA.Juss[18]、百合[19]、月季[20]、白芨[21]和野生馬鈴薯[22]小滴玻璃化法超低溫保存實(shí)驗結(jié)果表明，預(yù)培養(yǎng)蔗糖濃度取決于基因型，蔗糖預(yù)培養(yǎng)濃度在0.3～1.0 mol/L之間，蔗糖預(yù)培養(yǎng)時間數(shù)小時到十幾天不等。本試驗中，黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞(25±1)℃下在MS+ 2 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA + 0.5 mg/L 2,4-D +0.8 mol/L蔗糖的液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)4 d，小滴玻璃化法凍后存活率可達(dá)90%以上。

A.液氮凍存；B.未液氮凍存A.Cryopreservation with liquid nitrogen;B.Cryopreservation without liquid nitrogen 圖8 黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的增殖Fig.8 Proliferation from D.bulbifera L.suspension cells

A.液氮凍存；B.未液氮凍存A.Cryopreservation with liquid nitrogen;B.Cryopreservation without liquid nitrogen 圖9 黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞再生Fig.9 Regeneration from D.bulbifera L.suspension cells

A.常溫繼代；B.未液氮凍存；C.液氮凍存A.Subculture in normal temperature;B.Cryopreservation without liquid nitrogen ;C.Cryopreservation with liquid nitrogen圖10 黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞再生植株Fig.10 Plantlets regenerated from D.bulbifera L.suspension cells

左1：常溫繼代；左2：未液氮凍存；左3：液氮凍存；左4：Marker;上：引物XZJ-17；中：引物XZJ-18；下：引物XZJ-19Left No.1:Subculture in normal temperatur;Left No.2:Cryopreservation without liquid nitrogen;Left No.4:Cryopreservation with liquid nitrogen;Left No.4:Marker Upper:Primer XZJ-17;Middle:Primer XZJ-18;Lower:Primer XZJ-19圖11 黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞再生植株P(guān)CR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果Fig.11 PCR amplification product detection results of plantlets regenerated from D.bulbifera L.suspension cells

超低溫保存脫水一般有2步，一是裝載，二是植物玻璃化液脫水。3個百合品種[19]、4種月季離體植株[20]、白芨3 d萌發(fā)的種子和6 d生原球莖[21]以及天竺葵[23]小滴玻璃化法裝載時間分別為20～40、20、15和20 min。在本試驗中，(25±1)℃下在裝載液(MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖，pH 5.8)中裝載70 min，可顯著提高黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞的凍后存活率。究其原因，可能是凍存的植物材料不一樣所致。

在進(jìn)行小滴玻璃化法超低溫保存脫水時，植物玻璃化液的處理時間和處理溫度是細(xì)胞小滴玻璃化法超低溫保存的關(guān)鍵[24]。植物玻璃化液的處理溫度一般采用0 ℃，因為在0 ℃時植物玻璃化液對細(xì)胞的毒害較輕[25]。4種月季離體植株莖尖在0 ℃下用植物玻璃化液2(PVS2)處理20或30 min，小滴玻璃化法凍后存活率在78.3%～95.1%之間[20]。采用小滴玻璃化冷凍技術(shù)，木薩屬和合歡屬離體莖尖在0 ℃下PVS2處理的最佳時間為30～50 min，與常規(guī)冷凍方案相比，這個環(huán)節(jié)的PVS2處理可增加凍后存活率23%～46%[26]。亞太地區(qū)國家芋種質(zhì)莖尖在0 ℃下暴露20～40 min的PVS2，這種新的小滴玻璃化法將解凍后的平均再生率從先前的玻璃化法的21%～30%提高到73%～100%[27]。3個百合品種不定芽頂端分生組織在0 ℃下在PVS2溶液中浸泡90～120 min，小滴玻璃化法凍后存活率最高[19]。白芨3 d萌發(fā)的種子和6 d生原球莖在25 ℃下暴露于PVS2溶液中60 min，小滴玻璃化法凍后種子發(fā)芽率最高，小滴玻璃化法凍后6 d生球莖存活率最高[21]。天竺葵莖尖用植物玻璃化液2(PVS2)裝載20 min，成活率在55.6%～96.2%之間，再生率在9.1%～70.6%之間[23]。在本試驗中，黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞0 ℃下在PVS2(300 g/L甘油+150 g/L乙二醇+150 g/L二甲基亞砜+0.4 mol/L蔗糖，pH 5.8)中脫水100 min，可獲得較高的凍后細(xì)胞存活率。究其原因，可能還是凍存的植物材料不一樣所致。

在小滴玻璃化法超低溫保存中，冰凍保護(hù)劑中的二甲基亞砜(DMSO)對植物材料有毒害作用，會引起材料遺傳穩(wěn)定性的改變[28]。4種月季離體植株莖尖小滴玻璃化法凍后再生植株沒有表現(xiàn)出形態(tài)變化[20]。海島棉XH33胚性細(xì)胞小滴玻璃化法凍存的細(xì)胞和正常細(xì)胞在基因組倍性和核酸組成上沒有明顯差異，未造成遺傳變異[29]。牛大力腋芽小滴玻璃化法再生植株與對照的ISSR 和 SSR 兩種分子標(biāo)記無差異性條帶[30]。馬鈴薯莖尖小滴玻璃化法超低溫保存再生植株的SSR 穩(wěn)定性分析也表明無變異[31]。在本試驗中，以僅未液氮凍存(其他處理步驟與投入液氮保存一致)的黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞再生苗以及黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞常溫繼代培養(yǎng)再生苗為對照，對黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞液氮凍存再生苗進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的RAPD分子標(biāo)記檢測。結(jié)果表明黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞液氮凍存再生苗、黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞未液氮凍存再生苗和黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞常溫繼代培養(yǎng)再生苗的條帶數(shù)一致。

4 結(jié) 論

在玻璃化冷凍技術(shù)中，小滴玻璃化法超低溫保存具有較高的凍后存活率率。本試驗提出了一套利用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行黃獨(dú)胚性懸浮細(xì)胞小滴玻璃化的處理方法，對其各個關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，并對其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了RAPD檢測，取得了不錯的凍存效果，可為其他藥用植物胚性懸浮細(xì)胞的小滴玻璃化法超低溫保存提供借鑒和參考。