基于線粒體D-loop的河南省綿羊品種遺傳多態(tài)性和遺傳關系研究

韓浩園，姚麗娟，王惠繪，尹慧茹，王先寧，吳依依，李玉法，趙金艷，賈萬里，李 君，王擁慶,權 凱*

(1.河南牧業(yè)經濟學院動物科技學院，河南 鄭州 450046；2.澠池縣農業(yè)農村局，河南 三門峽 472400；3.沈丘縣農牧科技研發(fā)中心，河南 周口 466300)

【研究意義】線粒體DNA(mtDNA)遵循母系起源，作為研究動物起源進化的有效手段，近期已被廣泛應用于研究遺傳多樣性、親緣關系和遺傳分化[1-5]。目前基于線粒體序列對綿羊遺傳關系和起源進化研究較為廣泛，但中國河南省綿羊品種小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊之間的遺傳關系研究很少，特別是河南大尾羊和豫西脂尾羊群體數(shù)量急劇減少，有必要對其遺傳資源進行評估，并分析河南省3個綿羊品種間的遺傳關系，對于今后3個品種的保護和利用提供遺傳學依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】綿羊線粒體DNA序列為16.616 kb[6]。早期國外學者對線粒體控制區(qū)(D-loop)序列的研究表明綿羊有2個母系起源，其中歐洲的摩佛倫羊(Ovisorientalis)為家養(yǎng)綿羊的母系起源之一，同時排除了羱羊(Caprasibirica)和盤羊(Argali sheep)作為家養(yǎng)綿羊祖先的可能[7]，而隨后發(fā)現(xiàn)家養(yǎng)綿羊可能至少存在3個母系起源[8-10]。中國新疆、內蒙古、西藏、云南、寧夏、山東、甘肅等地區(qū)18個地方綿羊品種存在3個獨立的母系起源，且綿羊的3個支系可能曾經經歷過群體擴張[11-15]。對中國地方綿羊品種mtDNA控制區(qū)(D-loop)序列遺傳多樣性的研究發(fā)現(xiàn)：新疆、內蒙古、西藏、云南、寧夏、山東等地區(qū)7個地方綿羊品種D-loop區(qū)遺傳變異豐富[13-15]。中國甘肅綿羊群體mtDNA D-loop遺傳多樣性均較貧乏，應該對其遺傳資源進行保護[14]。【本研究切入點】河南省綿羊品種包括小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊。小尾寒羊和豫西脂尾羊都屬于我國蒙古羊系統(tǒng)[16]，是我國綿羊良種。豫西脂尾羊是河南古老的地方綿羊品種，分布在豫西、豫南地區(qū),具有產肉性能好、適應性廣、抗病力強、耐粗放飼養(yǎng)等優(yōu)良特性。小尾寒羊為國家級保護品種，以體型大、生長快、繁殖率高而聞名。河南大尾羊目前瀕臨絕種，本研究僅發(fā)現(xiàn)極少數(shù)個體?！緮M解決的關鍵問題】目前對河南省綿羊品種間遺傳關系和母系起源尚無系統(tǒng)研究，因此本研究以河南省3個綿羊品種作為研究對象，通過分析mtDNA D-loop區(qū)全序列研究其遺傳多樣性、遺傳分化和系統(tǒng)進化關系，揭示品種間的遺傳分化及其起源進化，繼而了解它們的遺傳資源狀況，為今后開展河南省綿羊品種的保存、種質特性研究和開發(fā)利用等工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究采集23只小尾寒羊(XW)、40只豫西脂尾羊(YX)和4只河南大尾羊(DW)共67個個體的外周血樣本。小尾寒羊采自河南雨軒農業(yè)科技發(fā)展有限公司，豫西脂尾羊采自河南省三門峽市澠池縣豫西脂尾羊保種群，依據(jù)品種特性和羊場記錄采集純種個體。河南大尾羊采自河南省汝州市汝陽縣山區(qū)養(yǎng)殖戶。利用EDTA抗凝管頸靜脈采血5 mL，采集血樣置于-20 ℃保存。

1.2 DNA提取和D-loop序列擴增及測序

采用小量全血基因組DNA快速提取試劑盒(艾德萊生物)提取3個綿羊品種全血DNA，并利用Nanodrop(Thermo Fisher)測量提取DNA濃度和OD260/280值。將合格DNA稀釋到20 ng/μL。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成綿羊D-loop全序列上游引物F：5′- TCCCTAAGACTCAAGGAAGAAGC-3′和下游引物R：5′- AAGAGTGTGTGCTTGATACCTGC -3′序列[17]。PCR擴增反應體系為25 μL，包括DNA模板(20 ng/μL)1 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Taq PCR Master Mix 12.5 μL(1 U Taq Polymerase、5 μmol/L dNTP、0.2 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L KCl、0.03 mmol/L MgCl2)和ddH2O 10.5 μL。PCR擴增條件為：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，36個循環(huán)；72 ℃延伸9 min，4 ℃保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，確認產物大小與目的片段一致，送往生工生物工程(上海)股份有限公司雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

從NCBI上下載五條綿羊序列作為對照：摩佛倫羊(Ovismusimon)，登錄號為AY091487；羱羊(Ovisammon),登錄號為AJ238300；盤羊(Ovisvignei)，登錄號為AY091490；亞洲型A型和歐洲型B型，登錄號為AF039578和AF039577。

利用Lasergene軟件包SeqMan軟件拼接雙向序列。利用MEGA6.0軟件比對67只綿羊的D-loop序列(Align by ClustalW)并截齊序列[18]，基于Kimura 2-parameter模型構建ML系統(tǒng)進化樹，計算3個品種間的遺傳距離[19]。利用DnaSP V5軟件[20]分析3個綿羊品種D-loop序列的DNA多態(tài)性(單倍型多樣度Hd、核苷酸多樣度Pi等)、基因流和遺傳分化(種群間核苷酸平均差異數(shù)Kxy、核苷酸歧義度Dxy、固定系數(shù)Fst等遺傳學參數(shù))、Tajima’s檢驗和單倍型鑒定?；趩伪缎蛿?shù)據(jù)，利用NETWORK 10.2.0.0軟件(Fluxus Technology Ltd.,Kiel,Germany)構建67只小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊D-loop單倍型網(wǎng)絡圖。

2 結果與分析

2.1 河南3個綿羊品種的D-loop序列變異及遺傳多樣性分析

本研究發(fā)現(xiàn)61只綿羊D-loop序列為1376 bp，而2個小尾寒羊(XW15和XW21)存在75 bp插入，長度為1451 bp；4個豫西脂尾羊(YX1、YX14、YX15和YX31)存在75 bp缺失，長度為1301 bp。小尾寒羊多態(tài)位點數(shù)為132個，核苷酸多樣度為0.0230，共定義23個單倍型，單倍型多樣度為0.975。豫西脂尾羊多態(tài)位點數(shù)為129，核苷酸多樣度為0.0129，共定義25個單倍型，單倍型多樣度為0.936。河南大尾羊多態(tài)位點數(shù)為55個，核苷酸多樣度為0.0270，共定義3個單倍型，單倍型多樣度為0.667(表1)。小尾寒羊和豫西脂尾羊單倍型多樣度較高，河南大尾羊單倍型多樣度最低，可能與河南大尾羊數(shù)量稀少有關。3個品種無共享單倍型。

2.2 系統(tǒng)進化樹與遺傳距離分析

基于3個綿羊品種D-loop序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，ML樹結果表明，小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊聚為三大支(lineage A～C)，lineage A大部分為豫西脂尾羊，為亞洲A型；lineage B大部分為小尾寒羊，為歐洲B型，與摩弗倫羊聚為1支；lineage C大部分為小尾寒羊，為中國綿羊特有分支(圖1)。羱羊和盤羊為外群。河南大尾羊穿插于小尾寒羊和豫西脂尾羊中，說明河南大尾羊血統(tǒng)不純。遺傳距離分析表明3個品種間遺傳距離均大于0.02(表2)，達到亞種間遺傳距離，其中，小尾寒羊和豫西脂尾羊間遺傳距離最遠，河南大尾羊與小尾寒羊遺傳距離最近。

2.3 遺傳分化和中性檢驗

應用DnaSP 5.0軟件計算反映小尾寒羊和豫西脂尾羊種群間基因差異程度的遺傳學參數(shù)。結果顯示，3個品種間固定系數(shù)(Fst)范圍為0.0253～0.4465，遺傳分化系數(shù)(Gst)范圍為0.0226～0.0706(表3)。3個品種間核苷酸差異數(shù)(Kxy)范圍為30.239～42.934，核苷酸歧義度(Dxy)范圍為0.0241～0.0342(表3)。河南大尾羊和豫西脂尾羊間Kxy和Dxy最高，小尾寒羊和河南大尾羊間最低，說明3個品種間小尾寒羊和豫西脂尾羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊間極度分化，核苷酸差異大；小尾寒羊和河南大尾羊間分化很弱，核苷酸差異最小，與遺傳距離結果一致。采用Tajima’s D方法進行中性檢驗，小尾寒羊和豫西脂尾羊Tajima’s D中性檢測為不顯著(P> 0.10)。河南大尾羊顯著偏離中性(P< 0.05)，且Tajima’s D 值為正(表1)，說明河南大尾羊近年來經歷過瓶頸效應。

2.4 構建單倍型網(wǎng)絡圖

基于線粒體D-loop序列，對小尾寒羊和豫西脂尾羊進行單倍型網(wǎng)絡圖構建，共發(fā)現(xiàn)50個單倍型和3個單倍群(A、B、C)，對應系統(tǒng)發(fā)育樹lineage A～C，Network圖結果表明河南省綿羊存在3個母系起源(圖2)。

表1 河南綿羊品種遺傳多樣度

表2 3個河南省綿羊品種間遺傳距離

圖1 河南省綿羊品種ML系統(tǒng)進化樹Fig.1 The ML phylogenetic tree of Henan sheep breeds

3 討 論

3.1 河南省綿羊品種遺傳多樣性

本研究以3個河南省綿羊品種小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊為研究對象，研究了河南省3個綿羊品種遺傳多態(tài)性和遺傳關系。遺傳多態(tài)性結果顯示綿羊線粒體D-loop區(qū)的變異除少量的插入/缺失外，6個個體出現(xiàn)了75 bp串聯(lián)重復序列的重復次數(shù)不同，與之前的研究一致[21]。小尾寒羊群體變異位點132個，占9.59%；豫西脂尾羊群體變異位點129個，占9.38%。且2個綿羊品種單倍型較多，分別存在23和25個單倍型，單倍型多樣性豐富，核苷酸多樣性豐富，屬于高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性的遺傳多樣性模式。這與牛華鋒等[22]的研究結果一致。小尾寒羊和豫西脂尾羊的遺傳變異必定受到養(yǎng)殖和選育的影響，在群體連續(xù)繁殖過程中，群體內積累了較多的遺傳變異，說明選育過程中的基礎群體種質較優(yōu)，遺傳多樣性較高，遺傳改良育種保留了具有優(yōu)良性狀的個體，發(fā)揮種質優(yōu)勢[23]，證明小尾寒羊和豫西脂尾羊具有較高的進化潛力和環(huán)境適應力，是優(yōu)質的河南省綿羊品種，且沒有出現(xiàn)種質衰退的現(xiàn)象[24-25]。河南大尾羊多態(tài)位點數(shù)為55個，較小尾寒羊與豫西脂尾羊少，河南大尾羊單倍型多樣度及定義單倍型數(shù)目(n=2)為3個品種中最低的，可能與河南大尾羊樣品數(shù)量少有關。目前河南大尾羊和豫西脂尾羊個體數(shù)很少，因此開展河南大尾羊及豫西脂尾羊的遺傳多樣性研究及品種種質資源保護是非常必要的。

3.2 河南省綿羊品種間的遺傳關系

本研究基于ML法構建小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊D-loop序列的系統(tǒng)進化樹，可見河南大尾羊穿插在小尾寒羊與豫西脂尾羊之間。本次采樣僅采到4只河南大尾羊樣本，證明該品種數(shù)量少，且血統(tǒng)摻雜了小尾寒羊和豫西脂尾羊血統(tǒng)，純種河南大尾羊幾乎絕種。

遺傳距離遺傳距離分析表明3個品種間達到亞種間遺傳距離，其中，小尾寒羊和豫西脂尾羊間遺傳距離最遠，河南大尾羊與小尾寒羊遺傳距離最近，與遺傳分化系數(shù)、核苷酸歧異度、核苷酸差異度及系統(tǒng)發(fā)育樹結果一致。該結果揭示了小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊間的遺傳距離遠近。

系統(tǒng)發(fā)育樹及Network結果表明豫西脂尾羊和小尾寒羊有少數(shù)個體互相摻雜，說明3個品種間存在一定的基因交流。20世紀90年代，河南省多地利用小尾寒羊體型大、生長速度快、繁殖率高的品種優(yōu)勢，對當?shù)氐脑ノ髦惭蜻M行改良，以提高豫西脂尾羊綜合生產性能[26-27]，因此造成小尾寒羊和豫西脂尾羊間的基因交流，與本研究的基因流結果一致。

3.3 種群進化與種群擴張歷史

關于綿羊的野生祖先，目前還沒有一個統(tǒng)一的看法。本研究所測定的河南省家養(yǎng)綿羊3個品種分為3大支系：支系A占所有個體的55.23%，支系B占31.34%，支系C占13.43%，并且亞洲A型和歐洲B型分別與支系A和B聚為一類，有研究表明中國綿羊至少存在三個母系起源[8,14]。且認為第三個分支C數(shù)量不多[28]，本研究驗證了中國綿羊存在有3個獨立的母系起源。聚類圖顯示，摩佛倫羊與其中分支B聚為一類，而羱羊和盤羊單獨聚為一類這說明摩佛倫羊對中國家養(yǎng)綿羊的貢獻較大，而沒有發(fā)現(xiàn)羱羊和盤羊對中國綿羊的起源有貢獻，這與國內外學者的研究結果一致[6]。

本研究中性檢驗結果顯示，小尾寒羊和豫西脂尾羊的Tajima’s D檢驗結果不顯著，表明該序列在進化上遵循中性模型，這2個綿羊品種在較近的歷史上未經歷群體擴張及瓶頸效應[29]，保持相對穩(wěn)定的群體規(guī)模。但河南大尾羊Tajima’s D檢驗結果顯著，說明河南大尾羊近期經歷瓶頸效應，與近期河南大尾羊數(shù)量急劇減少現(xiàn)狀一致，因此有必要加速對河南大尾羊遺傳資源的研究及保護。

4 結 論

本研究基于線粒體D-loop序列，對小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊遺傳多樣性及起源進化進行了研究，得出以下結論：河南省小尾寒羊、豫西脂尾羊品種遺傳多樣性較豐富；小尾寒羊與河南大尾羊遺傳關系最近，與豫西脂尾羊關系最遠；河南省綿羊品種有3個母系起源，且摩佛倫羊對河南省綿羊起源與進化有更大的貢獻。