CdCl2脅迫對甘蔗幼苗根系細胞壁Cd積累的影響

肖京林，覃 美，楊 曙，易 科，黎曉峰，唐新蓮，凌桂芝

(1.廣西甘蔗生物學(xué)重點實驗室/教育部蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心/廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學(xué)農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，廣西 南寧 530004)

【研究意義】土壤重金屬污染是全球面臨的重大環(huán)境污染之一，鎘(Cd)是我國土壤中的主要污染元素[1]。Cd污染會造成植物葉片失綠發(fā)黃、植株矮化[2]，抑制根系伸長，引起根系萎爛發(fā)黑，甚至導(dǎo)致植物死亡[3]，Cd還會通過食物鏈影響人體健康[4]。甘蔗是我國重要的熱帶作物，也是廣西地區(qū)第一大戰(zhàn)略性經(jīng)濟作物[5]，對Cd具有較強的生理耐性，能在Cd污染地區(qū)種植，但生產(chǎn)上甘蔗幼苗常出現(xiàn)Cd毒害導(dǎo)致的黃化甚至枯死現(xiàn)象，最終導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量降低，而有關(guān)Cd對甘蔗生長影響的研究多集中在甘蔗伸長期和成熟期的Cd吸收、轉(zhuǎn)運和積累特點等方面[6]，對易發(fā)生Cd毒害的甘蔗幼苗在CdCl2脅迫下的Cd吸收積累、分配及細胞壁固定Cd的解毒機制等并未深入探討。因此，探究CdCl2脅迫下甘蔗幼苗根系細胞壁的Cd積累特點及Cd耐性機制，對在土壤Cd超標區(qū)域推廣種植甘蔗新品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】Wang等[7]研究認為，當(dāng)土壤Cd濃度達233.00 mg/kg時甘蔗產(chǎn)量僅相對降低13.6%，因此，甘蔗在Cd污染土壤上種植潛力較大。刀靜梅等[8]研究甘蔗Cd積累特征發(fā)現(xiàn)，Cd在甘蔗地下部富集量較大，在地上部富集量較小，轉(zhuǎn)運系數(shù)均小于1.000。曾巧英等[9]研究表明，耐Cd甘蔗品種能保持較高生長量的原因可能是通過降低Cd向地上部分轉(zhuǎn)移，使更多Cd積累在根系從而緩解Cd毒害。根系是植物最初接觸Cd的部位，其細胞壁中的多糖組分因含帶負電荷的羧基、羥基和氨基等基團而具有重金屬陽離子結(jié)合能力[10]，減少進入細胞的重金屬量，使植物表現(xiàn)對Cd脅迫具有耐受性[11]。朱秀紅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，油菜根部和葉部細胞壁Cd所占比例隨著Cd脅迫濃度的增加而增加。劉仲齊等[13]研究認為，水稻能夠?qū)⒋罅康腃d固定在營養(yǎng)體的細胞壁中，只有極少數(shù)的Cd運輸?shù)剿胼S，從而緩解Cd毒害。張虹等[14]利用FTIR分析小飛蓬根和葉細胞壁上Cd 吸附位點的官能團，發(fā)現(xiàn)在小飛蓬根和葉細胞壁吸附Cd的過程中，羥基、羧基和氨基都是Cd的主要結(jié)合位點，而果膠主要提供羥基官能團與Cd相結(jié)合。進一步研究發(fā)現(xiàn)，果膠的甲酯化程度影響其對Cd的結(jié)合，如Colzi等[15]研究顯示，亞麻下胚軸細胞壁中低甲酯化的果膠是Cd的主要結(jié)合位，甲酯化程度越低的果膠結(jié)合Cd能力越強。郭軍康等[16]對不同年限設(shè)施菜地番茄細胞壁果膠Cd累積的研究發(fā)現(xiàn)，莖和葉片中果膠含量及果膠甲酯酶(PME)活性與細胞壁Cd累積量呈正相關(guān)?？梢姡珻d脅迫植物時其細胞壁能通過吸附固定Cd而減少Cd向胞內(nèi)運輸，提高植株對Cd的耐受性?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對甘蔗幼苗Cd積累、分布和Cd解毒機制的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以新培育的兩個高產(chǎn)甘蔗品種中蔗1號和中蔗6號為試驗材料開展CdCl2脅迫水培試驗，探究其幼苗中Cd的分布特點及其根系細胞壁在CdCl2脅迫下的解毒機制，為高產(chǎn)甘蔗新品種在Cd污染土壤上推廣種植提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中蔗1號(Z1)和中蔗6號(Z6)是由廣西大學(xué)培育提供、具有適應(yīng)性強、生長量大和高產(chǎn)等特點的甘蔗新品種，參照武欣等[17]的方法在溫室中育苗和培育。脅迫所用Cd為CdCl2，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 CdCl2脅迫對甘蔗幼苗根系、葉片和根系細胞壁Cd含量及細胞壁多糖組分的影響 選取15 d日齡、1心4葉的Z1幼苗分別置于含0(對照)、1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2溶液中培養(yǎng)4 d后，以0.5 mmol/L CaCl2溶液浸泡根系30 min，洗脫附著在根系表面的Cd。Z1幼苗經(jīng)去離子水清洗根系后，采集根系和葉片，分別測定其Cd含量；稱取5.0 g鮮樣根系，提取細胞壁后全部烘干并稱重，測定鮮樣根系和烘干根系細胞壁的Cd含量，計算根系中的Cd和細胞壁中的Cd積累量及根系中細胞壁Cd的積累量占比；提取根系細胞壁烘干并分離細胞壁的果膠和半纖維組分[半纖維素I(HCI)和半纖維素II(HCII)]，測定果膠和半纖維素含量及果膠甲脂化程度，計算去甲酯化果膠含量并測定Cd含量。剪取1.0 cm根尖，用于PME活性(nmol H+/min)測定。3次重復(fù)。

1.2.2 CdCl2脅迫對甘蔗種莖初生根相對伸長率和根系活力的影響 選取3 d日齡、初生根長勢均勻的Z1和Z6種莖，分別置于含0(對照)、1.0、2.0、5.0 μmol/L(低濃度)和10.0、20.0、50.0、100.0 μmol/L(高濃度)CaCl2溶液中培養(yǎng)。每個種莖為1個重復(fù)，設(shè)12個重復(fù)。培養(yǎng)0和24 h后利用直尺分別量取根長，計算根的相對伸長率；剪取1.0 cm根尖，用氯化三苯四唑(TTC)還原量法測定低濃度CdCl2脅迫下的根系活力，計算TTC還原量[μg/(kg·h)]代表根系活力。

1.2.3 CdCl2脅迫對甘蔗幼苗Cd吸收和積累的影響 選取15 d日齡Z1和Z6幼苗分別置于含0(對照)、1.0、2.0和5.0 μmol/L CaCl2溶液中培養(yǎng)，4 d后以0.5 mmol/L CaCl2溶液浸泡幼苗根系30 min，洗脫附著在根系表面的Cd并采集幼苗根系、葉片和葉鞘，擦拭水分后稱量各部分重量，測定各部分的Cd含量，計算地上部(葉片和葉鞘)和地下部(根系)的Cd含量并計算其比值。3次重復(fù)。地上部Cd含量=(葉片Cd含量×葉片重量+葉鞘Cd含量×葉鞘重量)/(葉片重量+葉鞘重量)。

選取3 d日齡、初生根長勢均勻的Z1和Z6種莖，分別置于含0(對照)、1.0、2.0和5.0 μmol/L CaCl2溶液中培養(yǎng)4 d后，剪取1.0 cm根尖，測定Cd含量。剪取根尖提取細胞壁，并分離根尖細胞壁的果膠和半纖維組分，測定其Cd含量。

上述Cd培養(yǎng)液的pH均為5.5，采用通氣泵通氣補氧，每1 h通氣15 min。

1.3 測定指標及方法

根系活力參照張志勇等[18]的TTC還原量法(方法一中的熱提法)進行測定；細胞壁及其多糖組分的提取和分離、果膠甲酯酶活性、果膠甲酯化程度及細胞汁液和殘渣的分離均參照Yang等[19]的方法進行操作或測定；Cd含量參照GB 5009.15—2014《食品安全國家標準食品中Cd的測定》[20]的方法進行測定。

根的相對伸長率(%)=不同濃度Cd處理24 h后的根長/對照24 h后的根長×100

Cd處理24 h后的根長=Cd處理24 h后測量的根長-Cd處理0 h測量的根長

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016進行整理，以Duncan’s新復(fù)極差法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗幼苗的Cd積累特征

從表1可看出，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理15 d日齡幼苗4 d后，其葉片的Cd含量分別為0.79、1.09和1.25 mg/kgFW，均顯著高于對照(P<0.05，下同)，根系的Cd含量分別為107.20、134.90和145.20 mg/kgFW，顯著高于對照，分別約為葉片Cd含量的136、124和116倍?？梢?，甘蔗幼苗根系對進入其體內(nèi)的Cd具有很強的截留能力。

CdCl2處理15 d日齡Z1幼苗4 d后，隨著脅迫濃度的提高，其根系細胞壁的Cd在根系中占比也顯著增加，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理幼苗根系細胞壁的Cd占比分別為35.80%、44.10%和57.50%?？梢?，隨著CdCl2脅迫濃度的提高，更多的Cd被根系細胞壁所固定積累。

1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理15 d日齡Z1幼苗4 d后，其根系細胞壁中的Cd均有95.00%以上累積在果膠和半纖維素組分中。其中，半纖維素組分中的Cd含量占比隨著CdCl2濃度的提高而顯著降低，但CdCl2濃度為5.0 μmol/L時半纖維素組分中的Cd含量占比仍達60.27%，而果膠組分中的Cd含量占比(分別為18.71%、28.52%和36.28%)隨著CdCl2濃度的提高而顯著升高?？梢姡收岣导毎谥械墓z和半纖維素均為積累Cd的主要組分，且隨著CdCl2脅迫濃度的提高，果膠中的Cd含量占比顯著增加。

2.2 CdCl2脅迫對甘蔗幼苗根系細胞壁及其多糖組分的影響

為了解甘蔗幼苗根系細胞壁固定Cd的機制，需對CdCl2脅迫1心4葉甘蔗幼苗4 d后的根系細胞壁果膠和半纖維素含量、果膠PME活性和果膠甲酯化程度進行分析。由表2可知，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理Z1幼苗根系細胞壁的半纖維素I(HCI)和半纖維素II(HCII)含量間無顯著差異，但其果膠含量和PME活性均顯著高于對照，果膠的甲酯化程度均顯著低于對照，而去甲酯化果膠含量均顯著高于對照。可見，CdCl2脅迫下Z1幼苗根系細胞壁中的果膠組分含量增加及PME催化的果膠甲酯化程度降低，導(dǎo)致Cd在果膠中積累增加，根系細胞壁對Cd的積累量相應(yīng)增加，減少了Cd向胞內(nèi)運輸，最終使得更多的Cd被截留在根系中從而減少向地上部轉(zhuǎn)運。

表1 CdCl2脅迫對Z1幼苗Cd含量的影響

表2 Cd對甘蔗根系細胞壁組分含量及果膠PME活性、去甲酯化程度和去甲酯化果膠含量的影響

2.3 CdCl2脅迫對蔗種初生根相對伸長率和根系活力的影響

從圖1-A可看出，CdCl2處理24 h后，Z1和Z6種莖的初生根伸長率均隨著脅迫濃度的提高而顯著下降，1.0、2.0和5.0 μmol/L低濃度CdCl2處理種莖初生根的伸長率分別為對照的90.7%和85.1%、87.2%和77.16%及67.6%和64.7%，其中，5.0 μmol/L CdCl2處理種莖初生根的伸長受抑制程度最重；Z1和Z6種莖初生根的相對伸長率間無顯著差異(P>0.05，下同)，說明Z1和Z6種莖的初生根對低濃度CdCl2的耐受性相似。10.0、20.0、50.0 μmol/L高濃度CdCl2處理種莖初生根的伸長率分別為對照的41.1%和43.7%、33.6%和30.8%及19.2%和18.1%，且差異顯著，而50.0和100.0 μmol/L CdCl2處理種莖的初生根伸長率差異不顯著，但二者均顯著低于10.0和20.0 μmol/L CdCl2處理。可見，不同濃度CdCl2脅迫均顯著抑制甘蔗種莖根的伸長，其中，低CdCl2濃度中的5.0 μmol/L脅迫時根伸長的受抑制程度最高重，高CdCl2濃度中的50.0 μmol/L脅迫時根系幾乎已停止伸長。

從圖1-B可看出，低濃度CdCl2處理24 h后，Z1和Z6種莖初生根的根尖活力均隨著脅迫濃度的提高而下降，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理種莖初生根的根尖活力分別為對照的83.5%和86.1%、77.5%和80.0%及42.4%和42.7%。其中，5.0 μmol/L CdCl2處理Z1和Z6種莖的根尖活力僅分別為283.3和279.6 μg/(kg·h)，且均顯著低于對照及1.0和2.0 μmol/L CdCl2處理?？梢?，低濃度CdCl2脅迫可顯著抑制甘蔗種莖的根尖活力。

在同一小圖中，圖柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)In the same small graph，different lowercase letters on the bar represented significant difference(P<0.05)圖1 不同濃度CdCl2脅迫對甘蔗種莖初生根相對伸長率(A)和根系活力(B)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of CdCl2 stress on relative elongation of primary root(A) and root activity of sugarcane seed stems(B)

表3 CdCl2脅迫下的甘蔗幼苗Cd含量比較

綜上所述，甘蔗種莖的初生根對CdCl2脅迫十分敏感，低濃度的CdCl2脅迫即可顯著抑制其伸長和降低其根尖活力。

2.4 CdCl2脅迫對甘蔗幼苗Cd吸收和積累的影響

由表3可知，2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理Z1根系的Cd含量分別為135.20和145.40 mg/kgFW，葉片的Cd含量分別為1.12和1.54 mg/kgFW，葉鞘的Cd含量分別為1.79和3.48 mg/kg FW，均顯著高于Z6。可見，CdCl2脅迫下Z1植株較Z6更容易累積Cd。

分析地下部Cd含量與地上部Cd含量的比值可反映植株體內(nèi)Cd向地上部轉(zhuǎn)運的差異。從表3可看出，2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理Z1和Z6幼苗地下部Cd含量與地上部Cd含量的比值均相近，相互間無顯著差異，而5.0 μmol/L CdCl2處理Z1和Z6幼苗地下部與地上部Cd含量的比值均顯著小于2.0 μmol/L CdCl2處理。可見，雖然Z1和Z6幼苗根系和葉片的Cd含量存在顯著差異，但其體內(nèi)Cd向地上部轉(zhuǎn)運并無顯著差異，因此甘蔗幼苗吸收Cd的差異不是由Cd向地上部運輸?shù)牟町愃隆?/p>

從表4可看出，不同濃度CdCl2處理3 d日齡Z1和Z6種莖4 d后，其根尖的Cd含量隨著CdCl2脅迫濃度的提高而升高，且1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理Z1種莖根尖的Cd含量均顯著高于Z6；種莖根尖細胞壁的Cd含量和果膠中Cd的積累量均隨著CdCl2脅迫濃度的提高而升高，但1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理Z1和Z6種莖根尖細胞壁的Cd含量間和果膠中Cd的積累量間均無顯著差異?？梢?，在CdCl2脅迫下Z1種莖根尖中的Cd含量與Z6存在顯著差異，但該差異不是細胞壁對Cd的結(jié)合能力不同所導(dǎo)致。

3 討 論

Cd不是植物生長的必需營養(yǎng)元素，Cd脅迫會直接影響植物根系生長，對植物產(chǎn)生毒害效應(yīng)[21]。大量研究表明，植物根系對Cd脅迫十分敏感，Cd脅迫會抑制水稻根系生長，低濃度的Cd即可致使水稻根系生物量下降22.95%[22]；Cd脅迫會抑制煙草根系伸長和側(cè)根萌發(fā)，并使根尖細胞老化死亡[23]。本研究中，甘蔗種莖的初生根對CdCl2脅迫十分敏感，低濃度(1.0～5.0 μmol/L)CdCl2脅迫僅處理1 d即可顯著抑制Z1和Z6幼苗根的伸長，其中CdCl2濃度為5.0 μmol/L時根的伸長受抑制程度最重；低濃度(1.0～5.0 μmol/L)CdCl2脅迫也會顯著抑制甘蔗種莖的根尖活力；Z1幼苗的Cd含量顯著高于Z6。因此推測，Z1對其體內(nèi)Cd毒害的忍耐能力較強，Z1相對于Z6更適合在Cd污染地區(qū)推廣種植。

細胞壁是植物體內(nèi)積累Cd的主要部位[24]。董萌等[25]研究表明，蔞蒿根系吸收的Cd有59%被細胞壁所固定，從而減少向細胞內(nèi)運輸，減輕毒害作用。本研究發(fā)現(xiàn)，1.0 μmol/L CdCl2脅迫時，甘蔗幼苗根系中35.80%的Cd積累在細胞壁組分中，隨著CdCl2處理濃度的提高根系細胞壁中的Cd含量占比增加，CdCl2脅迫濃度為5.0 μmol/L時根系中的Cd有57.50%被細胞壁所吸附積累。因此推測，CdCl2脅迫下甘蔗幼苗根系細胞壁通過吸附和固定大量的Cd從而減少Cd向胞內(nèi)運輸，使得更多的Cd被截留在根系中，減少向地上部轉(zhuǎn)運，可緩解Cd對甘蔗幼苗的毒害程度。

表4 甘蔗種莖根尖及其細胞壁果膠中Cd的積累量比較

果膠和半纖維素是細胞壁上Cd的主要結(jié)合位點。在本研究中，甘蔗幼苗根系細胞壁中有超過60.00%的Cd位于半纖維素組分中，與雷麗萍等[26]研究發(fā)現(xiàn)植物中的Cd主要結(jié)合在半纖維素上的結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理后，甘蔗幼苗根系細胞壁中的Cd僅18.71%～36.28%結(jié)合在果膠上，隨著CdCl2脅迫濃度的提高，Cd在果膠中的積累量顯著升高，說明果膠對抵御Cd進入細胞也具有重要作用；在CdCl2脅迫下，根系細胞壁果膠的PME活性提高，果膠的甲酯化程度降低，并促進果膠組分含量增加，增加果膠對Cd的積累量，提高根系細胞壁對Cd的結(jié)合能力，最終使得根系的Cd積累增加，與代晶晶[27]對油菜、徐劼和保積慶[28]對芹菜、Colzi等[29]對石竹的研究結(jié)果相似?？梢?，植物細胞壁中果膠的積累及其去甲酯化修飾可能有利于增加甘蔗細胞壁對Cd的結(jié)合能力。

4 結(jié) 論

在CdCl2脅迫下，甘蔗幼苗根系的細胞壁是Cd積累的主要部位；CdCl2脅迫會使甘蔗根系細胞壁果膠組分含量增加，PME活性升高，果膠甲酯化程度降低，細胞壁對Cd的結(jié)合能力提高，使得更多的Cd被根系細胞壁所固定，從而減少Cd向胞內(nèi)運輸和地上部轉(zhuǎn)運。