ALDH1 在乳腺癌及乳腺癌癌旁組織中的表達(dá)及臨床病理意義

余麗穎，詹欣雨，曾思羽，陳明付，高 歡，陳瓊霞，陳 瑩，鎮(zhèn)鴻燕

（江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）是一群具有自我更新能力和分化潛能的細(xì)胞，可導(dǎo)致多種惡性腫瘤生物學(xué)行為，如復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、異質(zhì)性、多藥耐藥、放療耐藥等［1］。腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物對(duì)于腫瘤診斷、治療及預(yù)后判斷具有重要意義。

2018 年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer）發(fā)布全球癌癥發(fā)病率和死亡率評(píng)估值表明，乳腺癌在全球女性癌癥發(fā)生率和死亡率均位居首位［2］，是嚴(yán)重危害女性健康的疾病。2003 年Al－Hajj 等［3］研究發(fā)現(xiàn)CD44＋CD－/lowLineage－標(biāo)記的乳腺癌細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性，是最早被鑒定出來的乳腺癌干細(xì)胞。乳腺癌干細(xì)胞被認(rèn)為是許多乳腺癌患者復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的“元兇”，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥與腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān)，影響乳腺癌患者的生存及預(yù)后，一些相關(guān)腫瘤標(biāo)記物可以用于乳腺癌靶向性治療及預(yù)后判斷［4－7］。

乙醛脫氫酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）是乙醛脫氫酶家族成員之一，是一種解毒酶，負(fù)責(zé)將視黃醇氧化為視黃酸［8］。研究［9－13］表明，ALDH1 是結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、膀胱癌等多種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物。2007 年，Ginestier 等首次鑒定ALDH1 是乳腺癌的干細(xì)胞標(biāo)志物［14］。該研究表明ALDH1 蛋白表達(dá)陽性的乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出腫瘤干細(xì)胞的特性，具有成瘤性。但目前ALDH1 在乳腺癌免疫組化定位研究及臨床病理相關(guān)性研究國內(nèi)相關(guān)報(bào)道較少，尚待進(jìn)一步開展。

本研究擬采用免疫組織化學(xué)方法檢測ALDH1 蛋白在乳腺癌及癌旁組織中的定位及表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理資料分析ALDH1 與乳腺癌T 分期腫瘤最大直徑、腫瘤分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以期對(duì)乳腺癌的診斷和預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2008－2013 年江大病理診斷所確診為乳腺癌的病例71 例，全部病例手術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療。全部病例均為女性病人，年齡27 ～88 歲，中位年齡58 歲。腋窩淋巴結(jié)清掃病例48例，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38 例。組織學(xué)分級(jí)：I 級(jí)4 例，II 級(jí)49 例，III 級(jí)18 例。根據(jù)腫瘤T 分期將腫瘤分成：T1 ～T2 期即腫瘤最大直徑為0 ～5 cm 54 例，T3 期即腫瘤最大直徑≥5 cm 17 例。71例腫瘤患者中癌旁組織29 例。所有標(biāo)本均用10%中性甲醛固定，石蠟包埋。由有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生進(jìn)行HE 病理切片的復(fù)查和篩選，在HE 切片中標(biāo)記并選取典型的乳腺癌組織及其癌旁組織，取直徑1 mm 的組織芯制成組織微陣列芯片。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測

鼠抗人單克隆ALDH1 為美國BD 公司產(chǎn)品，Envision 試劑盒為丹麥Dako 公司產(chǎn)品，ALDH1一抗工作濃度1∶100。組織切片常規(guī)脫蠟水化，微波修復(fù)煮沸10 min。染色方法采用Envision 二步法，用PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。一抗孵育4 ℃過夜。

1.3 ALDH1 免疫組化染色結(jié)果判定

細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核著色，呈現(xiàn)明確的棕黃色顆粒，且定位準(zhǔn)確、背景清晰。參照許良中等［15］免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)首先按染色強(qiáng)度打分：0 分為無色，1 分為淡黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色（染色深淺須與背景對(duì)照）；再按陽性細(xì)胞所占的百分比打分：0 分為陰性，1 分為陽性細(xì)胞數(shù)≤10%，2 分為陽性細(xì)胞數(shù)為11% ～50%，3 分為陽性細(xì)胞數(shù)為51% ～75%，4 分為陽性細(xì)胞數(shù)為≥75%。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積＞3 分為免疫反應(yīng)（＋），0 ～2 分為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS20 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，腫瘤T 分期（腫瘤最大徑）、腫瘤分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間陽性率差異用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH1 在乳腺癌及癌旁組織中表達(dá)情況

29 例乳腺癌癌旁導(dǎo)管組織中，ALDH1 表達(dá)主要呈核表達(dá)。癌旁正常乳腺導(dǎo)管組織，ALDH1表達(dá)主要定位導(dǎo)管肌上皮細(xì)胞內(nèi)呈散在分布，少許定位在導(dǎo)管上皮內(nèi)呈散在分布（圖1）；癌旁組織部分導(dǎo)管中見乳腺導(dǎo)管上皮增生，在增生上皮內(nèi)見ALDH1 陽性表達(dá)細(xì)胞（圖2）；71 例乳腺癌中，ALDH1 表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿中，部分癌組織呈散在表達(dá)（圖3），部分癌組織呈彌漫表達(dá)，表達(dá)細(xì)胞呈星芒狀結(jié)構(gòu)（圖4）。

圖1 正常乳腺導(dǎo)管中ALDH1 表達(dá)（Envision 法20×）Fig.1 Expression of ALDH1 in normal mammary ducts（Envision 20×）

圖2 乳腺增生導(dǎo)管中ALDH1 表達(dá)（Envision 法20×）Fig.2 Expression of ALDH1 in the duct of mammary hyperplasia（Envision 20×）

圖3 乳腺癌中ALDH1 散在表達(dá)（Envision 法40×）Fig.3 Scattered expression of ALDH1 in breast cancer（Envision 40×）

圖4 乳腺癌中ALDH1 彌漫表達(dá)（Envision 法40×）Fig.4 Diffused expression of ALDH1 in breast cancer（Envision 40×）

2.2 ALDH1 在乳腺癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

71 例乳腺癌中ALDH1 陽性表達(dá)32 例，陽性率45.1%。T1 ～T2 期54 例腫瘤中ALDH1 表達(dá)陽性28 例，陽性率51.9%；T3 期腫瘤17 例中ALDH1 表達(dá)陽性4 例，陽性率23.5%。組織學(xué)分級(jí)I 級(jí)腫瘤4 例中ALDH1 表達(dá)陽性3 例，陽性率75.0%；II 級(jí)腫瘤49 例中ALDH1 表達(dá)陽性19例，陽性率38.8%；III 級(jí)腫瘤18 例中ALDH1 表達(dá)陽性10 例，陽性率55.6%。腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤38 例中ALDH1 表達(dá)陽性16 例，陽性率42.1%；腋窩淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移腫瘤10 例中ALDH1 表達(dá)陽性3 例，陽性率30.0%。ALDH1 表達(dá)與乳腺癌患者T 分期、腫瘤分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）（表1）。

表1 ALDH1 的表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系（n＝71）Tab.1 Relationship between ALDH1 expression and clinicopathological parameters of breast cancer（n＝71）

3 討論

研究［16］表明，腫瘤干細(xì)胞與腫瘤發(fā)生、異質(zhì)化及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。1994 年，Dick 團(tuán)隊(duì)成功鑒定人急性髓系白血病細(xì)胞成瘤細(xì)胞是CD34＋CD38－細(xì)胞［17］，首次證明腫瘤干細(xì)胞存在。Al－Hajj等［3］2003 年從乳腺癌中分離具有干細(xì)胞特性的CD44＋/CD24－/low細(xì)胞表型的細(xì)胞，并證實(shí)乳腺癌中存在一種具有成瘤能力的腫瘤干細(xì)胞，即乳腺癌癥干細(xì)胞。目前，研究證明，乳腺癌的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物有許多種，如CD133、CD44、CD24、ALDH1 等，其中ALDH1 是非常重要的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物。

乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）家族中共包括了17 種同工酶，廣泛分布于多種組織中，能夠催化多種醛的氧化［18］。哺乳動(dòng)物乙醛脫氫酶根據(jù)其亞細(xì)胞所在位置、結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)特性和原始序列的相似性可以分為三類：第一類是細(xì)胞質(zhì)的乙醛脫氫酶（ALDHl）；第二類是線粒體的乙醛脫氫酶（ALDH2）；第三類則是可誘導(dǎo)性的細(xì)胞質(zhì)的乙醛脫氫酶和可誘導(dǎo)性的微粒體的乙醛脫氫酶（ALDH3）［19］。

乙醛脫氫酶1（ALDH1）能有效促使短鏈脂肪族醛和芳香族醛的氧化，是一種催化一系列脂肪族和芳香族醛氧化成相應(yīng)的羧酸的酶，它幾乎存在于所有哺乳動(dòng)物組織。人類ALDH1 基因位于9 號(hào)染色體，由5.3 × 104個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成，包含13 個(gè)外顯子，共編碼501 個(gè)氨基酸［20］。ALDH1是一種含鋅酶類，由兩個(gè)亞基組成，其中一個(gè)位于酶的活性中心，另一個(gè)起著穩(wěn)定四級(jí)結(jié)構(gòu)的作用。ALDH1 具有高度氧化活性，在氧化視黃醇為視黃酸的過程中參與基因的表達(dá)和細(xì)胞增殖、分化。因此，探討ALDH1 蛋白表達(dá)定位及臨床病理關(guān)系，有助于了解乳腺癌干細(xì)胞在乳腺癌發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，為乳腺癌患者治療提供潛在靶點(diǎn)。

Ginestier 等［14］對(duì)577 份乳腺癌患者癌組織標(biāo)本行免疫組化檢測研究，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)ALDH1 的乳腺癌細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，并與乳腺癌患者生存期有顯著相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)，ALDH1 在乳腺癌中的表達(dá)率為45.1%，與Mansour 等［16］的研究結(jié)果41.7%接近。圖1 ～圖3 顯示，乳腺癌組織同良性乳腺組織相比，陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，證明了乳腺癌癌癥干細(xì)胞含量增多，乙醛脫氫酶在乳腺癌干細(xì)胞中活性明顯升高。因此，在乳腺癌與乳腺良性病變中，ALDH1 的陽性表達(dá)定位差異可以作為判斷腫瘤良惡性的輔助標(biāo)記。

此外，乳腺癌旁組織中，ALDH1 主要表達(dá)在細(xì)胞核中，而乳腺癌組織中則主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，這說明在腫瘤的發(fā)生中，ALDH1 出現(xiàn)了從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位。乙醛脫氫酶是一類存在于細(xì)胞質(zhì)的酶類。ALDH1 核表達(dá)可能是其沉默狀態(tài)，當(dāng)腫瘤干細(xì)胞被激活，處于活躍增殖狀態(tài)時(shí)，ALDH1 則進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)行使其功能。因此，ALDH1 可能是腫瘤干細(xì)胞生長活躍的標(biāo)志，這有待進(jìn)一步研究。

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，不同T 分期腫瘤ALDH1 的表達(dá)率不同，其中T1 ～T2 期腫瘤ALDH1 表達(dá)率51.9%，T3 期為23.5%，前者ALDH1 陽性率明顯高于后者。該研究結(jié)果提示腫塊較小的腫瘤中可能存在相對(duì)比例較高的ALDH1 陽性腫瘤干細(xì)胞，因此，小體積腫瘤具有生長迅速的潛能。

Armstrong 等［21］的研究表明ALDH1 通過參與視黃醇的氧化過程參與基因的表達(dá)和組織分化，是造血干細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果表明，組織學(xué)分級(jí)I 級(jí)及III 級(jí)ALDH1 陽性率分別為75.0%、55.6%，前者明顯高于后者。同時(shí)，圖1 與圖3 顯示在良性組織中ALDH1 陽性細(xì)胞呈核表達(dá)，癌組織中呈星芒狀，因此，提示在ALDH1 陽性乳腺癌細(xì)胞在腫瘤形成中出現(xiàn)了上皮間質(zhì)化改變，從而在形態(tài)學(xué)角度上證明ALDH1 蛋白表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞分化過程，并證明ALDH1 陽性乳腺癌細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性。該研究結(jié)果與Vieira 等［22］2020 年在頭頸癌中的研究結(jié)果一致。

另外，本研究結(jié)果表明，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移清掃病例中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移乳腺癌中ALDH1陽性率分別為42.1%及30.0%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌ALDH1 陽性表達(dá)呈升高趨勢。本研究結(jié)果與周飛等［9］2020 年研究結(jié)果一致。提示ALDH1 蛋白陽性乳腺癌具有較強(qiáng)侵襲性，與乳腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果表明ALDH1 在乳腺癌中表達(dá)與腫瘤活躍生長密切相關(guān)，同時(shí)也與腫瘤形成上皮間質(zhì)化相關(guān)。提示ALDH1 有可能參與腫瘤增殖、分化及轉(zhuǎn)移過程，與乳腺癌的生存及預(yù)后密切相關(guān)。ALDH1 陽性表達(dá)有望成為腫瘤診斷及治療的靶點(diǎn)。