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    天花粉中瓜氨酸含量的熒光檢測

    2021-12-30 03:14:32陳匯鴻向玲玲梁韻詩伍海婷黃新安張靜廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究中心廣州510405
    中南藥學(xué) 2021年11期
    關(guān)鍵詞:熒光法天花粉瓜氨酸

    陳匯鴻,向玲玲,梁韻詩,伍海婷,黃新安,張靜(廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究中心,廣州 510405)

    天花粉(Trichosanthis Radix)為葫蘆科植物栝樓的干燥根,是一種常用的中藥。其性味甘、微苦、微寒,具有清熱瀉火、生津止渴、消腫排膿的作用,常用于治療熱病煩渴、肺熱燥咳、瘡瘍腫毒[1-2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明其提取物具有治療糖尿病、終止妊娠、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用[3-7]。 瓜氨酸是天花粉的主要特征氨基酸[8],同時也是《中國藥典》規(guī)定的天花粉定性鑒別的標(biāo)準(zhǔn)。目前,天花粉中瓜氨酸的定量檢測主要有以下3種方法:

    ① 高效液相色譜法[9-10]:該法通常需要將無紫外吸收的氨基酸進行柱前衍生化,然后采用高效液相色譜對瓜氨酸衍生物進行分離和定量分析。最近也有報道采用蒸發(fā)光散射檢測器,可以直接測定天花粉配方顆粒中的瓜氨酸含量[11]。② 薄層色譜法[12]:該法通過硅膠薄層色譜將瓜氨酸與其他物質(zhì)分離,然后采用茚三酮試液顯色,通過掃描峰面積而得到瓜氨酸含量。③ 紫外分光光度法[13-14]:該法的原理是瓜氨酸選擇性與二乙酰肟在強酸(硫酸+磷酸)高溫下反應(yīng)生成有紫外吸收的產(chǎn)物,然后通過測定反應(yīng)混合液的吸光度而得到瓜氨酸含量。這3種方法都能準(zhǔn)確測量天花粉中的瓜氨酸含量,可以為天花粉藥材的質(zhì)量評價提供客觀依據(jù),但是目前仍難以實現(xiàn)大規(guī)模和高通量的檢測。

    基于熒光技術(shù)具有靈敏度高和便捷快速等優(yōu)勢,我們在前期的工作中,設(shè)計合成了一類高選擇性的瓜氨酸熒光探針Napdialyne[15]。該化合物本身無熒光,但是在酸性條件下可以與瓜氨酸反應(yīng)生成高熒光的加成產(chǎn)物。本研究擬使用該熒光探針首次探索天花粉中瓜氨酸含量的熒光測定(檢測原理見圖1),并與其他兩種測定方法(紫外分光光度法和薄層色譜法)進行對比,為天花粉中瓜氨酸含量的檢測提供新的技術(shù)手段。

    圖1 瓜氨酸熒光探針Napdialyne的檢測原理Fig 1 Detection principle of citrulline fluorescent probe Napdialyne

    1 材料

    1.1 儀器

    TU-1900紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);CAMAG TLC Scanner 4薄層色譜掃描儀(瑞士卡瑪有限公司);Thermo Scientific Varioskan LUX酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾科技公司);KQ-50B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ST60-4微孔板恒溫振蕩器(杭州米歐儀器有限公司)。

    1.2 試藥

    L-瓜氨酸對照品(上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司,純度>98%,批號:RNV684);無水乙醇、二甲基亞砜、二乙酰肟、濃硫酸、磷酸、異丙醇、三氯乙酸、正丁醇、茚三酮、冰醋酸均為分析純;天花粉藥材均購買自廣州市面藥店,分別是杏園春(河南產(chǎn)地),百姓大藥房(四川產(chǎn)地),松草堂旗艦店(安徽產(chǎn)地),經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院藥用植物教研室杜勤教授鑒定,并研磨成細粉。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 對照品溶液的制備

    精密稱取4.6 mg的L-瓜氨酸對照品溶解在525 μL 50%乙醇中,配制成初始濃度為8.76 mg·mL-1的L-瓜氨酸溶液。

    2.2 供試品溶液的制備

    精確稱取3 g天花粉粉末置于錐形瓶中,加入10 mL 50%乙醇,超聲30 min,過濾,用50%乙醇定容至10 mL,待用。

    2.3 瓜氨酸含量測定

    2.3.1 熒光法 在96孔板中依次加入100 μL純水、40 μL 100%(w/v)三氯乙酸水溶液、40 μL 50%乙醇、10 μL熒光探針Napdialyne(0.314 mg·mL-1,DMSO溶解)以及10 μL供試品溶液,將其置于50℃下震蕩孵育3 h。冷卻后,取10 μL反應(yīng)液于90 μL DMSO溶液中稀釋后測量熒光,λex=320 nm,λem=376 nm。

    2.3.2 紫外分光光度法 取1 mL供試品稀釋溶液,依次加入0.25 mL 30 g·L-1二乙酰肟水溶液、1 mL混合酸(V硫酸∶V磷酸=3∶1),搖勻。置于100℃下,避光煮沸30 min。冷卻至室溫后,測定490 nm處的吸光度。

    2.3.3 薄層色譜法 精密吸取樣品并點樣在硅膠板上,采用正丁醇-無水乙醇-冰醋酸-水=8∶2∶5∶3展開,吹干后在硅膠板上噴灑茚三酮顯色劑,高溫下吹干顯色。置于薄層色譜儀中,500 nm下掃描,讀取數(shù)值。

    采用以上3種方法,對河南產(chǎn)地的天花粉中瓜氨酸的含量進行了測定。結(jié)果熒光法、紫外分光光度法、薄層色譜法測得的瓜氨酸含量分別為2.083%(RSD=1.7%)、1.849%(RSD=2.7%)和1.697%(RSD=1.2%)。數(shù)據(jù)吻合較好,這說明熒光法可以較準(zhǔn)確地測定天花粉中瓜氨酸的含量。

    2.4 線性關(guān)系考察

    用50%乙醇逐步稀釋對照品溶液配制梯度對照品溶液,按“2.3”項下條件進行測定,以瓜氨酸的濃度為橫坐標(biāo)(X),熒光強度/吸光度/吸收峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果在熒光法中,熒光強度與L-瓜氨酸對照品的濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為Y=131.0X+1.173,線性范圍為0.0017~0.44 mg·mL-1,線性系數(shù)(R2)為0.9962;在紫外分光光度法中,回歸方程為Y=2.733X+0.016 76,線性范圍為0.004~ 0.25 mg·mL-1,R2為0.9951;在薄層色譜法中,回歸方程為Y=1.818×104X-59.22,線性范圍為0.024~0.30 mg·mL-1,R2為0.9953。同時,以3倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,估算熒光法的檢測限(LOD)為0.39 μg·mL-1。

    2.5 精密度考察

    精密吸取供試品溶液,按“2.3.1”項下反應(yīng)條件,連續(xù)檢測6次,計算得到熒光強度的RSD為0.66%,說明儀器的精密度良好。

    2.6 重復(fù)性考察

    精密稱取天花粉粉末適量,按“2.2”項下方法制備6份供試品溶液。按“2.3.1”項下條件進行測定,記錄熒光值,計算得到瓜氨酸含量的RSD值為1.7%,說明該方法重復(fù)性良好。

    2.7 加樣回收率考察

    精密稱取供試品溶液5份,分別測定瓜氨酸含量。然后按大約1∶1的比例加入瓜氨酸對照品,按“2.3.1”項下方法進行測定,計算平均加樣回收率。結(jié)果熒光法的加樣回收率在97.09%~ 106.84%,RSD值在1.6%~2.7%,說明該方法的準(zhǔn)確度較高。

    2.8 不同產(chǎn)地天花粉中瓜氨酸的含量測定

    為考察熒光法測定天花粉中瓜氨酸含量的適用范圍,分別收集了市面藥店所售的河南、四川、安徽3個產(chǎn)地的天花粉,測定其瓜氨酸的平均含量分別為2.083%、1.423%、1.835%(見表1)。其結(jié)果存在一定差異,表明本方法可以用于不同產(chǎn)地天花粉中的瓜氨酸的定量檢測。

    表1 不同產(chǎn)地天花粉的瓜氨酸含量測定 Tab 1 Citrulline content in Trichosanthis Radix from different producing areas

    3 討論

    近年來,熒光檢測技術(shù)由于快速、靈敏、便捷等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于各種生物檢測中,但是其在中藥材鑒定和質(zhì)量控制方面的研究仍較少。本研究采用課題組前期構(gòu)建的高選擇性瓜氨酸熒光探針Napdialyne,首次系統(tǒng)地建立了一套天花粉中瓜氨酸含量的熒光測定方法。通過與其他兩種常見的瓜氨酸測定方法(紫外分光光度法和薄層色譜法)對比,筆者發(fā)現(xiàn)3種方法結(jié)果較為接近,測得的瓜氨酸含量分別為2.083%、1.849%、1.697%。

    雖然目前已有3種方法可以用于檢測瓜氨酸含量,但在檢測的便利性上三者均存在一定的局限。高效液相色譜法對設(shè)備的要求較高,且耗時較長;紫外分光光度法需要高溫強酸的反應(yīng)條件,筆者在前期的條件優(yōu)化過程中也發(fā)現(xiàn)該法需要嚴格避光和控制時間,否則會出現(xiàn)較大的誤差;薄層色譜法則需要先通過硅膠薄層色譜對瓜氨酸進行分離,然后茚三酮高溫顯色,存在手工操作的差異。此外,受限于苛刻的反應(yīng)條件或色譜分離步驟,這3種方法均不能用于高通量檢測。相比之下,熒光法通常在96孔板中進行,具有簡便、可靠、檢測通量高、線性范圍廣等優(yōu)點,可以為天花粉的質(zhì)量控制提供新的快速檢測手段。

    致謝:感謝廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張蕾教授在薄層色譜掃描儀使用上的協(xié)助。

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