藏橐吾藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

萬(wàn)玉瑩，周燕，達(dá)娃卓瑪，3*（.西藏大學(xué)，拉薩 8500；.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都 6004；3.中藥藏藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院，拉薩 850005）

藏醫(yī)藥學(xué)是我國(guó)民族醫(yī)藥學(xué)的瑰寶，藏藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)題一直是制約藏藥發(fā)展的核心問(wèn)題，其中藏藥材的標(biāo)準(zhǔn)化更是藏藥現(xiàn)代化的前提和基礎(chǔ)[1-2]。藏橐吾[Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu]是菊科（Compositae）橐吾屬（Ligularia）多年生草本，主要分布在我國(guó)的西藏東部及尼泊爾海拔3700～4500 m的灌叢、山坡等地方[3]，全草入藥[4]，是藏藥體系的常用藥材，資源豐富[5-6]。西藏珞巴族將其作為消炎藥治療咽喉疼痛[7]，但目前對(duì)其報(bào)道相對(duì)較少。藏橐吾性溫，味苦，入肺經(jīng)，常與其他藏族當(dāng)?shù)氐拈椅釋僦参镆黄鸨环Q作“日肖”，用于清熱解毒、緩解燒傷及風(fēng)濕等癥狀[4]，其藥用價(jià)值在《中國(guó)中藥資源志要》中也有所記載，溫肺止咳，潤(rùn)肺降氣，還有散寒、化痰以及止痰的功效[5]。

歷版《中國(guó)藥典》、各地方藥典、《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥·第一冊(cè)》正文中均未收載藏橐吾相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版第四部通則相關(guān)規(guī)定[8]，首次對(duì)藏橐吾藥材根、莖、葉及粉末的顯微特征和薄層色譜進(jìn)行鑒別，并對(duì)藥典規(guī)定的常規(guī)項(xiàng)目進(jìn)行檢查，確定使用藏橐吾藥材中大量且具有生物活性的倍半萜成分——蜂斗菜素為薄層鑒別及含量測(cè)定指標(biāo)[9]，為地方藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考，為國(guó)家藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步完善奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器與試藥

Waters Acquity UPLC H-CLASS液相色譜儀（四元泵，PDA檢測(cè)，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，Empower 色譜數(shù)據(jù)工作站）；色譜柱為Welch Ultimate XBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Sartorius BT 25 S（十萬(wàn)分之一）、BSA124S-CW（萬(wàn)分之一）電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；蜂斗菜素對(duì)照品（實(shí)驗(yàn)室自制，純度＞99.0%）；硅膠G板（青島海洋化工有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純（中國(guó)MORELLK公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.2 藥材

藏橐吾藥材8批次，均采自西藏自治區(qū)境內(nèi)各不同地區(qū)，經(jīng)西藏自治區(qū)藏醫(yī)院格桑巴珠副主任藥師鑒定為菊科橐吾屬植物藏橐吾[Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu]，藥材全草曬干，粉碎后過(guò)2號(hào)篩，混合均勻，備用。樣品信息見(jiàn)表1。

表1 藏橐吾藥材采集信息 Tab 1 Sample collection information of Ligularia rumicifolia (Drumm.) S.W.Liu

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材性狀特征

藥材干燥根部呈不規(guī)則塊狀，大小不一，根肉質(zhì)，多數(shù)，根簇生多數(shù)細(xì)根，長(zhǎng)3～15 cm，直徑0.1～0.3 cm，表面灰褐色，有縱皺紋，質(zhì)較柔韌，不易折斷。葉片橢圓形或卵形，長(zhǎng)15～20 cm，寬5～7 cm，葉基呈心形，邊緣具規(guī)則的三角形齒；莖生葉無(wú)柄，基部抱莖，表面棕褐色，近圓柱形，質(zhì)地較硬，易折斷，內(nèi)部淡黃色，中空結(jié)構(gòu)。氣微香，味苦。藏橐吾原植物及干燥藥材見(jiàn)圖1。

圖1 藏橐吾原植物（A）及干燥藥材（B）Fig 1 Original plant（A）and dry medicinal material（B）of Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu

2.2 顯微特征

2.2.1 根橫切面 呈類圓形，表皮細(xì)胞1～2列，直徑約24 μm；外周孔隙較大，直徑為0.05～0.1 mm，環(huán)繞一周有5～7個(gè)；皮層多為薄壁細(xì)胞，直徑約48 μm，15～17層疏松排列；內(nèi)周孔隙呈類圓形，周狀排列一周5～7個(gè)，直徑0.05～0.1 mm；中間有中心維管束，直徑約為橫切面直徑的1/6。韌皮部呈圓環(huán)形排列在木質(zhì)部周圍，5～7列；木質(zhì)部呈緊密排列圓形，約占橫切面半徑的1/16（見(jiàn)圖2）。

圖2 藏橐吾根橫切面Fig 2 Cross section of Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu root

2.2.2 莖橫切面 類圓形，表皮細(xì)胞1列，皮層較厚，4～5列排列成環(huán)；雙韌性維管束周狀排列，一周環(huán)繞15～20個(gè)，2個(gè)旁支上各有3～4個(gè)雙韌性維管束；髓部由數(shù)十列細(xì)胞組成的環(huán)髓帶包圍。中心類圓形導(dǎo)管，半徑約為橫切面半徑的1/10（見(jiàn)圖3）。

圖3 藏橐吾莖橫切面Fig 3 Cross section of Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu stem

2.2.3 主葉脈橫切面 上、下表皮細(xì)胞各1列，橢圓形或類圓形；海綿組織細(xì)胞3～5列，不規(guī)則疏松排列；柵欄組織緊密排列2～3列；中間有中心維管束，橢圓形，木質(zhì)部呈疏松排列半圓形，直徑約0.2 mm，細(xì)胞大小不一；韌皮部在木質(zhì)部下方，韌皮部細(xì)胞緊密排4～5列，細(xì)胞較木質(zhì)部細(xì)胞較小，直徑約為木質(zhì)部細(xì)胞1/2（見(jiàn)圖4）。

圖4 藏橐吾主葉脈橫切面Fig 4 Main vein cross section of Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu

2.2.4 生藥粉末 本品粉末灰褐色或灰綠色，葉表皮細(xì)胞分兩種，一種是上表皮，細(xì)胞呈方形或多角形，另一種是下表皮，細(xì)胞呈波浪形，氣孔不定式，副衛(wèi)細(xì)胞4～5個(gè)，大小30.0～61.6 μm。纖維單個(gè)或成束存在，木纖維具紋孔。薄壁細(xì)胞類圓形，大小不等。木栓細(xì)胞類圓形，壁增厚。非腺毛較多，表面光滑。螺紋導(dǎo)管為主，也存在網(wǎng)紋及具緣紋孔導(dǎo)管，直徑29.8～42.9 μm。木栓石細(xì)胞多見(jiàn)，表面觀呈類長(zhǎng)方形、長(zhǎng)條形或多邊形，垂周壁連珠狀增厚，長(zhǎng)110.1～143.5 μm，寬15.4～33.9 μm，可見(jiàn)細(xì)密的裂紋及紋孔。散在草酸鈣方晶，直徑35.3～55.4 μm。棕色塊不規(guī)則狀，大小不等，散在（見(jiàn)圖5）。

圖5 藏橐吾生藥粉末Fig 5 Crude drug powder of Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu

2.3 薄層鑒別

稱取藏橐吾藥材粉末1.0 g，加入25 mL 甲醇，常溫超聲45 min，放置室溫，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另稱取蜂斗菜素適量，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為0.68 mg·mL－1的對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502），吸取上述溶液各 1 μL，點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（3∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴25%磷鉬酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰?？稍跇悠?、對(duì)照藥材及對(duì)照品相應(yīng)位置上，觀察到相同深藍(lán)色斑點(diǎn)（見(jiàn)圖6）。

圖6 藏橐吾TLC圖Fig 6 TLC of Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu

2.4 水分測(cè)定

不同產(chǎn)地的藏橐吾藥材水分含量8.58%～ 10.12%，平均值含量為9.4%。以平均值上浮20%為上限，暫定本品水分不得過(guò) 11.0%。8批樣品水分含量均在規(guī)定范圍內(nèi)，藥材水分合格率為100%（通則0832 第二法）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 水分、總灰分、酸不溶性灰分的測(cè)定結(jié)果(n＝2) Tab 2 Determination of water，total ash and acid insoluble ash (n＝2)

2.5 灰分、酸不溶性灰分測(cè)定

不同產(chǎn)地的藏橐吾藥材總灰分含量為5.95%～10.53%，平均值為7.8%，酸不溶性灰分含量為1.23%～4.77%，平均值為2.40%。以平均值上浮20%為上限，暫定本品總灰分含量不得過(guò) 9.5%，酸不溶性灰分含量不得過(guò)3.0%。其中在8批藏橐吾藥材中，藥材批號(hào)為Z2020-08總灰分不合格，藥材批號(hào)為Z2020-08、Z2020-07酸不溶性灰分不合格。藥材總灰分合格率為87.5%；酸不溶性灰分合格率為75%（通則2302），結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6 浸出物測(cè)定

隨機(jī)選取一批藥材為代表（批號(hào)：Z2020-03），對(duì)浸出物提取方法進(jìn)行考察。結(jié)果表明，以浸膏計(jì)，熱浸法以純水作為溶劑時(shí)得到浸出物含量最高。采用此方法測(cè)得8批不同產(chǎn)地藏橐吾藥材水溶性浸出物含量為 44.30%～50.96%，平均值為45.3%，以本品干燥品平均值的80%為下限，暫定本品水溶性浸出物不得少于32.3%。8批不同產(chǎn)地的藏橐吾藥材均符合要求（通則2201）。藥材浸出物合格率為100%，結(jié)果見(jiàn)表3～4。

表3 浸出物提取方法的考察(n＝2) Tab 3 Extraction method (n＝2)

表4 水溶性浸出物含量測(cè)定結(jié)果(n＝2) Tab 4 Determination of water-soluble extract content (n＝2)

2.7 蜂斗菜素含量測(cè)定

2.7.1 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.1%甲酸 水＝38∶43∶19（V/V/V）；色 譜 柱：Welch Ultimate?XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：232 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.7.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蜂斗菜素對(duì)照品適量，用甲醇稀釋得到質(zhì)量濃度為815.6 μg·mL－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL用甲醇定容到25 mL量瓶中，得到質(zhì)量濃度為32.62 μg·mL－1的對(duì)照品溶液。

2.7.3 供試品溶液的制備 精密稱取藏橐吾藥材粉末（過(guò)2號(hào)篩）0.5 g，精密加入甲醇25 mL，稱量。常溫超聲45 min，放置室溫，稱量，用甲醇補(bǔ)足重量；過(guò)濾，續(xù)濾液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

2.7.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液（甲醇）進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，蜂斗菜素與相鄰色譜峰的分離度均＞1.5，與其他組分可以達(dá)到完全分離，對(duì)稱因子在0.95～1.05，峰形對(duì)稱，理論塔板數(shù)≥10 000。結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 蜂斗菜素HPLC色譜圖Fig 7 HPLC chromatogram of petasin

2.7.5 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液，制成7個(gè)蜂斗菜素對(duì)照品系列溶液，以對(duì)照品質(zhì)量濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y＝7.853×104X＋8.241×104（r＝0.9996），結(jié)果表明，蜂斗菜素在9.79～45.67 μg·mL－1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.7.6 精密度考察 取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果蜂斗菜素峰面積的RSD為0.60%，表明該儀器精密度良好。

2.7.7 重復(fù)性考察 選擇同一批次藥材（批號(hào)：Z2020-06），按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液平行試驗(yàn)6次，結(jié)果顯示蜂斗菜素含量的RSD為0.63%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.8 穩(wěn)定性考察 取“2.7.7”項(xiàng)下供試品溶液于0、2、6、8、10、12 h 進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果蜂斗菜素的峰面積RSD為0.47%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.9 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的藏橐吾（批號(hào)：Z2020-06）樣品9份，每份約 0.25 g，按供試品中待測(cè)成分含量的80%、100%、120%精密加入蜂斗菜素對(duì)照品，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果蜂斗菜素加樣回收率分別為96.41%、96.26%、95.47%，RSD分別為1.5%、1.5%、1.8%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.7.10 樣品測(cè)定 分別取西藏不同產(chǎn)地的藏橐吾藥材，按“2.7.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算藏橐吾藥材中蜂斗菜素的含量。結(jié)果8批藥材中蜂斗菜素含量范圍 0.116%～0.168%，平均含量為0.141%。以平均含量的80%為限（按干燥品計(jì)算），暫定藏橐吾樣品中蜂斗菜素含量不得少于0.1%。8批不同產(chǎn)地的藏橐吾藥材均符合要求，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 蜂斗菜素含量測(cè)定結(jié)果(n＝3) Tab 5 Content determination of petasin (n＝3)

3 討論

3.1 對(duì)照品的選擇

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，藏橐吾主要化學(xué)成分有黃酮類[10]、單萜[10]、生物堿類[11]、倍半萜類[9，12-15]等，且認(rèn)為從橐吾屬植物中分離出的倍半萜類物質(zhì)是抗菌的主要活性成分[13]。

Ye等[9]從藏橐吾藥材中分離出45個(gè)倍半萜類成分，艾里莫酚烷型的倍半萜蜂斗菜素作為其中一個(gè)大量且特征性成分，具有抑菌、抗炎[16]、舒張血管[17]、抗腫瘤[18-21]、解痙、抗白三烯、抗組胺[22]等多種藥理活性。因此，考慮臨床功效、含量、特征性和分離難度等因素，本課題組將蜂斗菜素作為指標(biāo)成分，進(jìn)行藏橐吾藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

3.2 薄層色譜鑒別

3.2.1 展開(kāi)劑、薄層板類型的考察 考察了5種不同類型展開(kāi)劑系統(tǒng)：石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（3∶1）、石油醚（60～90℃）-丙酮（5∶1）、石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯（2∶0.5∶0.5）、二氯甲烷-乙酸乙酯（4∶1）、二氯甲烷-甲醇（10∶1），結(jié)果在石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（3∶1）和石油醚（60～90℃）-丙酮（5∶1）展開(kāi)劑體系下，分離效果較好，且Rf值適中，相比之下，前者分離效果和對(duì)照物質(zhì)成點(diǎn)性更好，Rf值0.65左右，展開(kāi)后斑點(diǎn)清晰明顯，無(wú)拖尾，符合藥典相關(guān)規(guī)定。

3.2.2 顯色劑的考察 考察4種顯色劑顯色效果（25%磷鉬酸溶液、5%硫酸-乙醇溶液、2% FeCl3-乙醇溶液、1%香蘭素-硫酸溶液）。結(jié)果25%磷鉬酸溶液作顯色劑展開(kāi)后斑點(diǎn)清晰，背景無(wú)干擾。

3.3 含量測(cè)定

3.3.1 供試品溶液制備方法的考察 采用不同濃度的甲醇、乙醇溶液（50%、70%、100%）作為提取溶劑，當(dāng)提取溶液是100%甲醇時(shí)，得到蜂斗菜素含量最高。在此基礎(chǔ)上，考察冷浸、超聲、回流三種提取方式在不同提取時(shí)間下對(duì)蜂斗菜素提取含量的影響，結(jié)果表明超聲45 min時(shí)，提取效率最高。

3.3.2 流動(dòng)相的考察 考察了甲醇-水、甲醇-甲酸水（0.1%、0.2%）、乙腈-水、乙腈-甲酸水（0.1%、0.2%）等二元流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)很難將目標(biāo)峰與周圍峰很好分離，在此基礎(chǔ)上考察三元流動(dòng)相體系甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-甲酸水（0.1%、0.2%），結(jié)果綜合考慮壓力、峰形以及樣品分離效果等因素，最終確定流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.1%甲酸水＝38∶43∶19。

3.4 小結(jié)

本研究通過(guò)對(duì)多產(chǎn)地藏橐吾藥材性狀描述、顯微鑒別及初次建立薄層鑒別方法，可知該植物鑒別特征明顯，可作為藏橐吾藥材的鑒別依據(jù)；通過(guò)對(duì)藏橐吾藥材各檢查項(xiàng)及浸出物測(cè)定，初步確定各常規(guī)試驗(yàn)項(xiàng)限量；通過(guò)首次建立蜂斗菜素對(duì)照品的含量測(cè)定方法，初步確定藏橐吾藥材質(zhì)控指標(biāo)性化學(xué)成分及限量，為其品種鑒別、地方藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。