UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS分析 頭痛寧膠囊的體內(nèi)分布特征

宗時(shí)宇，劉洋，狄志彪，劉峰，張紅*（.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 70003；.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，西安 70075）

頭痛寧膠囊是由陜西步長(zhǎng)制藥有限公司研制和獨(dú)家生產(chǎn)的中藥復(fù)方制劑，是以清代醫(yī)學(xué)家孟元瑞的“立愈湯”（天麻、土茯苓、制何首烏、當(dāng)歸、防風(fēng)）加用全蝎共6味中藥制成，具有滌痰熄風(fēng)、鎮(zhèn)痛逐瘀的功效[1-2]。頭痛寧膠囊在臨床用于治療各種頭痛，尤其針對(duì)原發(fā)性偏頭痛和緊張性頭痛痰瘀阻絡(luò)證具有良好的療效和安全性[3-5]，是我國(guó)第一個(gè)能夠解除頭痛（偏頭痛、緊張型頭痛）的具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新中成藥，2009年被國(guó)家科技部認(rèn)定為“國(guó)家重點(diǎn)新產(chǎn)品”[6]。雖然頭痛寧膠囊的有效性和安全性已得到臨床驗(yàn)證，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確。

目前對(duì)頭痛寧膠囊化學(xué)成分的研究多停留在單味藥材。方中君藥天麻是一種名貴中藥材，對(duì)于偏頭痛、高血壓和失眠等具有良好的治療效果，主要含有酚類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、多糖類(lèi)及甾體類(lèi)等化學(xué)成分[7]。土茯苓具有解毒利濕、涼血解毒、祛風(fēng)止痛的功效，含有糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、苯丙素類(lèi)、黃酮和黃酮苷類(lèi)、甾醇類(lèi)、皂苷類(lèi)及揮發(fā)油等多種化學(xué)成分[8]。制何首烏的藥效成分主要為二苯乙烯苷類(lèi)、蒽醌類(lèi)以及黃酮類(lèi)[9]。當(dāng)歸主要含有揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖和黃酮等成分[10]。防風(fēng)的主要活性成分包括色原酮、香豆素、揮發(fā)油等[11]。全蝎中含蝎毒、生物堿及甾體衍生物等小分子成分[12]。有關(guān)頭痛寧膠囊體內(nèi)效應(yīng)物質(zhì)的系統(tǒng)性研究還未見(jiàn)報(bào)道。

中藥多成分藥代動(dòng)力學(xué)可通過(guò)揭示中藥成分能否被機(jī)體有效利用來(lái)幫助發(fā)現(xiàn)可成為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的中藥成分[13]。因此，本課題組借助UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS分析手段，開(kāi)展了頭痛寧膠囊在大鼠體內(nèi)的分布特征研究，以期為揭示其潛在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000型超高效液相色譜系統(tǒng)和Q Exactive Focus型 質(zhì) 譜 儀（美 國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；TL2010S型中通量組織研磨儀（北京鼎昊源科技有限公司）；NX-1R型冷凍型高速臺(tái)式離心機(jī)[鼎昊源（天津）科技有限公司]；YGC-36型氮吹儀（鄭州寶晶電子科技有限公司）；SQP型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，d＝0.1 mg]；XM-P22H型無(wú)級(jí)調(diào)功超聲波清洗機(jī)[小美超聲儀器（昆山）有限公司]。

1.2 試藥

頭痛寧膠囊（批號(hào)：190317，陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，規(guī)格：0.4 g/粒）；肝素鈉注射液（醫(yī)用，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇為色譜級(jí)，甲酸為質(zhì)譜級(jí)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量260～280 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（陜）2018-001。

2 方法

2.1 給藥方案

大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和給藥組，每組6只。空白對(duì)照組灌胃給予純凈水，給藥組按照預(yù)實(shí)驗(yàn)探索的最大給藥濃度0.56 g·mL－1，以大鼠體質(zhì)量10 mL·kg－1的劑量（約為60 kg成人等效劑量的15倍）灌胃給予頭痛寧膠囊內(nèi)容物水溶液，每日給藥1次，連續(xù)4 d。并于第4日給藥前所有大鼠禁食不禁水12 h。

2.2 血漿樣品收集與處理

分別于第4日灌胃給藥后15、30、60、90、120 min，采取大鼠眼眶靜脈叢血約0.3 mL，置于加有抗凝劑1%肝素鈉溶液的EP管，離心（4000 r·min－1，10 min），取上層血漿100 μL，置于1.5 mL EP管中，加入200 μL甲醇，渦旋混勻，離心（13 000 r·min－1，10 min），分離上清，氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)尤?0 μL甲醇復(fù)溶，離心（13 000 r·min－1，10 min），取上清液進(jìn)行分析。

2.3 組織樣品收集與處理

取完血樣，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，進(jìn)行心臟灌注，取出心、肝、脾、肺、腎、腦等組織，用生理鹽水快速清洗，吸干水分后稱(chēng)重，并用等量的生理鹽水進(jìn)行勻漿，離心（13 000 r·min－1，10 min），分離上清，按 1∶3 比例加入沉淀劑甲醇，渦旋混勻，離心（13 000 r·min－1，10 min），取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾進(jìn)行分析。

2.4 排泄物收集與處理

從第3日給藥后8 h開(kāi)始至第4日給藥前，收集所有大鼠的尿糞排泄物。糞便用2倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿，離心（13 000 r·min－1，10 min），分離上清，按 1∶3 比例加入沉淀劑甲醇，渦旋混勻，離心（13 000 r·min－1，10 min），取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾進(jìn)行分析。

2.5 色譜和質(zhì)譜條件

2.5.1 色譜條件 Thermo Accucore aQ C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm），流速0.3 mL·min－1，進(jìn)樣量5 μL，柱溫30℃。流動(dòng)相采用甲醇（A）和0.1%甲酸水（B）梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～10 min，5%～25%A；10～25 min，25%～60%A；25～30 min，60%A；30～35 min，60%～95%A。

2.5.2 質(zhì)譜條件 離子源為加熱電噴霧離子源（H-ESI），噴霧電壓3.5 kV，鞘氣（N2）流量 40 arb，輔助氣流量10 arb，輔助加熱器溫度350℃，毛細(xì)管溫度320℃，S-lens射頻水平50，自動(dòng)增益控制（AGC）106。掃描方式采用正、負(fù)離子Full MS/dd-MS2模式，F(xiàn)ull MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率35 000；掃描范圍m/z80～1200，碰撞能量30 eV。

2.6 數(shù)據(jù)處理

利用UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS，在“2.5”項(xiàng)條件下，對(duì)所有樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。根據(jù)質(zhì)譜精確相對(duì)分子量信息，選擇一級(jí)準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)荷比實(shí)測(cè)值與理論值誤差小于5的分子與自建的頭痛寧膠囊化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行匹配，推測(cè)化學(xué)成分信息。

3 結(jié)果

3.1 入血化學(xué)成分

從給藥后15、30、60、90、120 min的大鼠血漿樣品中分別檢出39、44、42、41、38種頭痛寧膠囊的原形成分。由此可見(jiàn)，在給藥后30 min，大鼠體內(nèi)入血的化學(xué)成分最多，共有44種（見(jiàn)表1），包括以升麻素、升麻素苷、落新婦苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、亥茅酚及亥茅酚苷等為代表的14種黃酮類(lèi)成分，以油酸、亞油酸等為代表的11種有機(jī)酸類(lèi)成分，以天麻素為代表的5種酚類(lèi)成分，以2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和白藜蘆醇為代表的2種二苯乙烯苷類(lèi)成分，以及如蒽醌、香豆素等12種其他類(lèi)成分。頭痛寧膠囊的入血原形成分主要來(lái)源于藥材制何首烏和當(dāng)歸，其次為天麻和防風(fēng)，類(lèi)型以黃酮類(lèi)化合物居多。

表1 頭痛寧膠囊入血原形成分 Tab 1 Prototype composition of Toutongning capsule into blood

續(xù)表1

3.2 組織分布

大鼠腦組織中檢測(cè)到升麻素、大黃酚、白藜蘆醇和溶血磷脂酰膽堿等8種頭痛寧膠囊的原形成分，這些成分主要來(lái)源于藥材制何首烏。大鼠的心、肝、脾、肺、腎組織中分別檢測(cè)到7、9、20、4、11種頭痛寧膠囊的原形成分。表明原形成分在脾臟的分布最廣泛，其次為腎臟、肝臟，在肺組織的分布最少。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有組織中均檢測(cè)到了升麻素。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 排泄物化學(xué)成分

大鼠的糞便和尿液中各檢出21種頭痛寧膠囊的原形成分（見(jiàn)表2），主要為黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)及酚類(lèi)成分。糞便中檢測(cè)出的化學(xué)成分多來(lái)源于藥材土茯苓、制何首烏和當(dāng)歸，尿樣中的成分多來(lái)源于藥材天麻、制何首烏和當(dāng)歸。

表2 頭痛寧膠囊在組織和排泄物中的原形成分分布 Tab 2 Distribution of prototype components in tissues and excreta of Toutongning capsule

續(xù)表2

4 討論

該實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS技術(shù)，在正、負(fù)離子同時(shí)掃描模式下，對(duì)大鼠給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的血漿、重要臟器組織和排泄物樣品進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥后30 min，大鼠體內(nèi)入血的化學(xué)成分最多，共檢測(cè)到44種頭痛寧膠囊的原形成分；排泄物中檢出21種；腦組織中檢測(cè)到8種；心、肝、脾、肺、腎組織中分別檢測(cè)到7、9、20、4、11種，在脾、腎、肝組織中有較高的暴露量，這可能是因方中諸藥多入肝、脾、腎經(jīng)的緣故。所檢出的化學(xué)成分主要來(lái)源于藥材制何首烏、當(dāng)歸、天麻和防風(fēng)，類(lèi)型以黃酮類(lèi)、有機(jī)酸、酚類(lèi)及二苯乙烯苷類(lèi)化合物為主。黃酮類(lèi)成分主要有升麻素、升麻素苷、落新婦苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚及亥茅酚苷等；酚類(lèi)成分代表為天麻素；二苯乙烯苷類(lèi)成分有2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和白藜蘆醇。

落新婦苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、天麻素和升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷分別是藥材土茯苓、制何首烏、天麻和防風(fēng)的質(zhì)控指標(biāo)成分[16]。姜華等[17]研究表明，防風(fēng)中升麻素具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、抗炎作用，且作用迅速；升麻素苷也具有相應(yīng)的藥理活性，但作用遲緩，效果不及升麻素。聶西周等[18]采用系統(tǒng)藥理學(xué)方法對(duì)頭痛寧膠囊治療偏頭痛的TNF通路進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于藥材制何首烏的成分白藜蘆醇在治療偏頭痛的TNF機(jī)制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。另有研究[19]顯示，頭痛寧膠囊可通過(guò)降低患者血漿溶血磷脂酸及血液流變學(xué)水平，從而緩解偏頭痛。該實(shí)驗(yàn)在大鼠腦組織中檢測(cè)到了來(lái)源于藥材制何首烏的原形成分溶血磷脂酰膽堿，因而我們推測(cè)頭痛寧膠囊可能是通過(guò)其成分溶血磷脂酰膽堿與血漿中溶血磷脂酸結(jié)合，從而降低了血漿中游離溶血磷脂酸的水平。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)頭痛寧膠囊在大鼠體內(nèi)的分布特征研究，檢測(cè)分析得到的升麻素、升麻素苷、白藜蘆醇、溶血磷脂酰膽堿、天麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、落新婦苷和2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷等成分，可為頭痛寧膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究及藥效標(biāo)志物的篩選提供依據(jù)和參考。