基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的新型冠狀病毒肺炎核心中藥靶標預測及其作用機制研究*

李 磊，寧南義，王小龍，張賀廷，李天發(fā)，邢昭雪，巫祥宇

阜陽市中醫(yī)醫(yī)院，安徽 阜陽236000

WHO將新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）的全球傳播風險和影響風險級別由“高”上調(diào)為“非常高”［1］。國家衛(wèi)生健康委員會印發(fā)了《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》［2］。該方案指出，COVID-19主要表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳、乏力，少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛及腹瀉等癥狀；重癥患者多在發(fā)病1周后出現(xiàn)呼吸困難和/或低氧血癥，嚴重者可快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙及多器官功能衰竭等［3］。該病屬中醫(yī)“疫病”范疇，病因為感受“疫戾”之氣。中醫(yī)對“疫病”認識較早，如清代秦之楨《傷寒大白·卷四·疫病》中記載：“疫癥之原不一，如春時應(yīng)暖而反寒，則有寒疫。冬時應(yīng)寒反溫，則有溫疫……六氣之不正者，皆能發(fā)疫也?！北狙芯拷柚W(wǎng)絡(luò)藥理學方法篩選治療COVID-19處方中核心中藥的活性分子及潛在靶標，進一步分析其作用機制。

1 資料與方法

1.1 處方來源處方由2020年2月安徽省省級中醫(yī)專家組及阜陽市中醫(yī)醫(yī)院派駐阜陽市第二人民醫(yī)院參與治療COVID-19的專家開具，阜陽市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科負責審核、調(diào)配、煎煮；經(jīng)篩選，共整理出相關(guān)處方200張；處方涵蓋了不同年齡層次人群，具有一定代表性。

1.2 中藥名稱規(guī)范化處理中藥名稱不規(guī)范給臨床及科研工作帶來諸多不便［4］。本研究參考2015版《中華人民共和國藥典》及《中藥學》［5］教科書對處方中的藥名進行統(tǒng)一化處理，保證藥名一致。中藥拉丁名以《中藥鑒定學》［6］教材及南京中醫(yī)藥大學中藥標本中心（Chinese medicine specimen center ofNanjing University of Chinese Medicine，http：//zybb.njucm.edu.cn/）規(guī)范為準。

1.3 核心中藥篩選將規(guī)范名稱后的中藥逐一錄入Microsoft excel軟件，建立治療COVID-19的中藥處方數(shù)據(jù)庫；使用篩選、統(tǒng)計、數(shù)據(jù)透視等方法過濾處方高頻藥物，并進行可視化處理。

1.4 中藥活性分子過濾及相應(yīng)基因預測以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為過濾條件，在計算系統(tǒng)生物學實驗室TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http：//tcmspnw.com）過濾高頻中藥活性分子，剔除缺少靶標預測數(shù)據(jù)項。同時篩選高頻中藥相關(guān)基因，建立化合物-基因數(shù)據(jù)庫。根據(jù)高頻中藥活性成分在數(shù)據(jù)庫中篩選相應(yīng)基因。應(yīng)用UniProt KB（Universal Protein Knowledgebase，https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫整理基因名稱。

1.5 COVlD-19相關(guān)基因的篩選及中藥-疾病靶基因預測以“Novel Coronavirus Pneumonia”“NCP”為關(guān)鍵詞，分別從人類基因數(shù)據(jù)庫（Gene-Cards，https：//www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，Online Mendelian Inheritance in Man，https：//omim.org/）中尋找疾病相關(guān)基因，建立COVID-19基因數(shù)據(jù)庫。取疾病相關(guān)基因與中藥相應(yīng)基因的交集，獲得中藥治療COVID-19的潛在靶基因，并繪制文恩圖。

1.6 中藥-活性分子-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將中藥-疾病潛在靶基因、活性分子等導入Cytoscape-v3.7.2軟件生成網(wǎng)絡(luò)圖。對圖中各節(jié)點加上屬性進行整理后獲得中藥-活性分子-靶基因-“COVID-19”的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPl）的構(gòu)建及關(guān)鍵靶標篩選利用STRING（https：//string-db.org）數(shù)據(jù)庫，對中藥-疾病潛在靶基因進行蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建；根據(jù)鄰接節(jié)點數(shù)目對潛在靶基因進行排序整理，過濾關(guān)鍵靶標，繪制柱狀圖；并將鄰接節(jié)點≥42的關(guān)鍵靶標活性分子及所屬中藥列表展示。

1.8 GO功能富集分析及KEGG通路分析對獲得的中藥-“COVID-19”潛在靶基因進行靶點基因本體論（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 核心中藥200張?zhí)幏街泄彩褂弥兴?36味，合計3418味次。使用頻次＞100的有17味，排名前5味的分別為茯苓（Poria）、甘草（Glycyrrhizae Radix Rhizoma）、陳皮（Citri Reticulatae Pericarpium）、白 術(shù)（Atractylodis Macrocephalae Rhizoma）、半夏（Pinelliae Rhizoma）。除白術(shù)外，均為二陳湯（宋代《太平惠民和劑局方》）組成中藥［7］。尸檢報告結(jié)合相關(guān)文獻提示，痰濕既是COVID-19致病因素，又是病理產(chǎn)物，對該病形成的危害較大。二陳湯為治療痰濕證的基礎(chǔ)方，在COVID-19的治療中有重要意義［8-9］。故將半夏、茯苓、陳皮、甘草（二陳湯）納入本研究；頻次排名前17味的中藥見表1，可視化展示見圖1。

表1 使用頻次＞100的17味高頻中藥

圖1 使用頻次＞100的17味高頻中藥

2.2 中藥活性分子過濾及相應(yīng)靶基因預測基于上述篩選條件，通過TCMSP平臺共過濾出半夏活性分子13個，陳皮活性分子5個，茯苓活性分子15個，甘草活性分子92個。根據(jù)搜集到的活性分子，在化合物-基因數(shù)據(jù)庫中尋找相應(yīng)靶點，共獲得4味藥相關(guān)靶基因223條。

2.3 COVlD-19相關(guān)基因篩選及中藥-疾病靶基因預測根據(jù)限定關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫尋找到相關(guān)基因369條，OMIM數(shù)據(jù)庫尋找到相關(guān)基因2條。去重整理后共獲得COVID-19相關(guān)基因364條。取COVID-19的相關(guān)基因與核心中藥相關(guān)靶基因的交集，得到二陳湯治療COVID-19的潛在靶標52條。見圖2。

圖2 二陳湯治療“COVID-19”潛在靶標

2.4 核心中藥-活性分子-靶基因-“COVlD-19”的網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將二陳湯-疾病的52條潛在靶標匹配中藥關(guān)鍵活性分子、節(jié)點屬性、網(wǎng)絡(luò)連線等，并導入Cytoscape軟件生成網(wǎng)絡(luò)圖。經(jīng)賦予各節(jié)點、連線屬性，進一步整理，獲得二陳湯-活性分子-靶基因-“COVID-19”的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，將二陳湯中4味中藥分別予以展示，見圖3。圖中共547條網(wǎng)絡(luò)連線，153條節(jié)點屬性。包含疾病COVID-19，半夏、茯苓、陳皮、甘草4味中藥，映射出96個活性分子，52個潛在靶標。網(wǎng)絡(luò)圖外圈、內(nèi)圈為活性分子，圈內(nèi)包含相應(yīng)靶標、疾病COVID-19以及4味核心中藥。

圖3 中藥-活性分子-潛在靶標-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPl網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶標篩選利用STRING數(shù)據(jù)庫對52條潛在靶標進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。圖中節(jié)點表示靶基因，綠色、紅色、深藍色、黃色、黑色、淺藍色連線分別代表基因鄰接、基因融合、基因共進化、蛋白互作、共表達關(guān)系、蛋白同源性。網(wǎng)絡(luò)圖中共有52個節(jié)點，771條邊，平均節(jié)點度值為29.7，平均局部聚類系數(shù)為0.785（圖4-1）。依據(jù)鄰接節(jié)點數(shù)目對靶基因進行排序，過濾關(guān)鍵靶基因（圖4-2）。鄰接節(jié)點數(shù)目≥42的核心靶標有8條，進一步匹配其相應(yīng)活性分子。核心靶標分別為胱天蛋白酶3（Caspase-3，CASP3）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）、重組人白細胞介素1β（recombinant human IL1B protein，IL1B）、促分裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、促分裂原活化蛋白激酶3（mitogenactivated protein kinase 3，MAPK3）、促分裂原活化蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、信號傳導子和激活子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3），作用較強的活性分子有baicalein（黃芩苷）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、naringenin（柚皮素）、nobiletin（川橙皮素）、kaempferol（山柰酚）、licochalcone a（甘草查爾酮A）、quercetin（槲皮素）。見表2。

表2 中藥-活性分子-關(guān)鍵靶基因

圖4 -2關(guān)鍵靶基因

圖4 -1蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO功能注釋及KEGG代謝通路富集分析對上述52個潛在靶基因進行GO富集分析，并根據(jù)P值大小對富集結(jié)果進行排序，進一步對生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）進行可視化展示［10］。52個潛在靶基因可能參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)、細胞對生物刺激的反應(yīng)、細胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)、凋亡信號通路的調(diào)控、凋亡信號通路的負調(diào)控、外源性凋亡信號通路、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)等生物過程，見附表1及圖5-1。主要存在的RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復合物、核轉(zhuǎn)錄因子復合物、細胞-基質(zhì)黏附連接、線粒體膜間隙、線粒體外膜等細胞組分，見圖5-2。主要執(zhí)行細胞因子活性、受體配體活性、趨化因子受體結(jié)合、MAP激酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、趨化因子活性、核激素受體結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等分子功能見圖5-3。

圖5 -3潛在靶基因執(zhí)行的分子功能（MF）

圖5 -2潛在靶基因所處的細胞組分（CC）

圖5 -1潛在靶基因參與的生物過程（BP）條形圖

KEGG通路富集結(jié)果顯示，潛在靶基因主要富集在IL-17信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、C型凝集素受體信號通路、Th17細胞分化等信號通路。見附表2。相應(yīng)的通路富集結(jié)果可視化展示見圖6。

圖6 潛在靶基因KEGG通路富集結(jié)果條形圖

3 討論

本研究中作用較強的活性分子主要集中在黃酮類化合物，如黃芩苷、柚皮素、山柰酚、川橙皮素、甘草查爾酮A、槲皮素等及植物甾醇類如β-谷甾醇。黃酮類化合物有廣泛的抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性［11-12］。其中，黃芩苷有顯著的廣譜抗病毒及抗呼吸道炎癥作用，通過影響炎癥信號通路進而抑制多種炎癥因子表達，達到抗炎效果，臨床可用于肺炎、感染等的治療［13-14］。川橙皮素是陳皮中的優(yōu)效活性分子，具有稀釋痰液、解痙平喘等作用，臨床可用于治療咳嗽痰多等癥［15-16］。氧化應(yīng)激可導致細胞死亡，其機制包括增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）的形成、線粒體功能障礙、激活凋亡相關(guān)死亡信號等。甘草查爾酮A在細胞抗氧化系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，可增強細胞本身的抗氧化能力［17］。柚皮素屬二氫黃酮類化合物，能通過NF-κB通路抑制炎癥因子，降低由LPS誘導的肺部炎癥，且能下調(diào)TNF-α等因子水平，保護和治療肺損傷［18-19］。山柰酚通過降低MAPK、NF-κB等信號通路，抑制TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β的表達從而發(fā)揮抗炎活性［20］，還可通過增加總SOD活力，發(fā)揮防治放射性肺損傷的作用［21］。近來研究［22］表明，柚皮素、山柰酚可能通過抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能、減輕肺損傷，從而用于COVID-19的治療。姚運秀等［23］研究顯示，槲皮素通過與ACE2結(jié)合調(diào)節(jié)多條信號通路，從而可能用于治療COVID-19。相關(guān)分子對接結(jié)果提示，槲皮素與2019-nCoV 3CL水解酶有較好的結(jié)合活性，且與該病臨床推薦化學藥的親和力相似［24-25］。β-谷甾醇屬植物甾醇的一種，廣泛存在于多種植物的細胞膜，表現(xiàn)出抗炎、抗氧化等藥理活性，其本身無抗病毒活性，但能較好抑制病毒介導的炎癥反應(yīng)，通過下調(diào)RIG-I表達阻斷干擾素合成及干擾素信號轉(zhuǎn)導，從而抑制放大的免疫應(yīng)答；抑制病毒誘導CD3+及CD8+T細胞募集至肺組織介導免疫病理，從而發(fā)揮抗炎機制［26-27］。

肺內(nèi)外有害刺激可引發(fā)多種炎癥細胞在肺內(nèi)的募集和活化，釋放大量細胞因子及趨化因子。有害刺激（包括病毒感染）早期，IL-1β與TNF-α迅速分泌，當有害刺激持久強烈或機體免疫亢進時，促炎抗炎平衡被打破，進一步促進如IL-2、IL-6等一系列細胞因子及趨化因子的活化及釋放，引起級聯(lián)“瀑布效應(yīng)”，形成一種失控的炎癥反應(yīng)，又稱“細胞因子風暴”［28］?！凹毎蜃语L暴”導致自身免疫細胞攻擊正常宿主細胞，造成全身多臟器損傷［29］。COVID-19患者炎癥反應(yīng)增強，重癥患者血漿中多種促炎因子表達水平更高，整體預后較差，這可能與COVID-19重癥患者發(fā)生“細胞因子風暴”的比例更高有關(guān)［30-31］。非特異性免疫作為機體對抗流感病毒的第一道防線，在流感病毒入侵呼吸道上皮細胞時啟動，其中最重要的細胞因子為IFN、TNF-α和IL-6［32］。同時，輔助型T細胞2（T helper 2 cell，Th2）能夠分泌Th2型細胞因子，如IL-4、IL-6、IL-10等，其中IL-10是Th2中最重要的細胞因子［33］，也是流感后肺炎典型的抗炎細胞因子，流感病毒感染機體時IL-10表達升高，其與肺部炎癥的嚴重程度呈正相關(guān)［34］。冠狀病毒感染肺炎時，來源于非特異性免疫或特異性免疫的細胞因子急劇增多，同時趨化因子誘導促炎因子、抗炎因子到達感染部位，導致肺組織廣泛水腫和肺泡表面蛋白失活以及肺毛細血管滲漏，引起急性肺損傷；失控的細胞因子風暴進一步彌散炎癥，肺泡結(jié)構(gòu)破損造成機體肺血氧不足，最終進展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），這可能是COVID-19患者病情加重、死亡的重要原因之一［35-36］。此外，肺泡上皮細胞中的STAT3可被IL-6激活，導致STAT3持續(xù)活化和過度表達從而引發(fā)肺氣道炎癥［37］。肺炎支原體脂質(zhì)膜相關(guān)蛋白具有活化STAT3的作用，而活化的STAT3能促進黏蛋白分泌［38-39］。研究［40］表明，肺炎支原體感染組中STAT3的表達水平顯著高于對照組，STAT3表達的上調(diào)是引發(fā)呼吸道相關(guān)疾病的因素之一。

在病毒（包括冠狀病毒）感染性疾病中，病毒引發(fā)凋亡十分常見。凋亡對于病毒性疾病可能同時存在兩種相反的作用。一方面，機體可以利用凋亡機制殺死被病毒感染的細胞從而有利于清除病毒，另一方面也使病毒顆粒從胞內(nèi)釋放，反而促進了病毒的傳播。機體在感染SARS、禽流感病毒后的確切致病機理目前尚不明確，但細胞凋亡可能是其中的重要環(huán)節(jié)［41］。包括SARS、甲型流感病毒性肺炎及其他一些重癥肺炎均有凋亡過程參與［42-44］。而CASP3、MAPK在體內(nèi)外細胞凋亡方面起關(guān)鍵作用［45-46］。首先，Caspase是參與細胞凋亡過程的重要酶類，通過裂解特異性底物調(diào)控細胞凋亡。Fas結(jié)合蛋白（FADD）結(jié)合并激活Caspase-8前體，活化的Caspase-8進一步激活下游死亡執(zhí)行者Caspase-3，從而誘導細胞凋亡。線粒體在細胞凋亡中處于凋亡調(diào)控的中心位置，而Bcl-2家族蛋白在線粒體凋亡通路中居核心地位，許多Bcl-2家族蛋白都定位于線粒體膜上。當線粒體凋亡通路被激活時，線粒體外膜破壞，線粒體膜間腔的細胞色素C被釋放到細胞質(zhì)中觸發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細胞凋亡。而Bcl-2可以誘導、直接引發(fā)或抑制線粒體外膜的通透化，調(diào)控細胞凋亡。其次，不同蛋白質(zhì)激酶分子的逐級序貫磷酸化并激活是細胞信號通路的重要特征。MAPK級聯(lián)激活是多種信號通路的中心環(huán)節(jié)，可將膜受體接受的信號轉(zhuǎn)導至核內(nèi)以控制基因表達，是細胞生長、分化和應(yīng)激反應(yīng)的共同信號通路［47］。細胞感染SARS病毒后，多條通路的蛋白分子發(fā)生磷酸化和去磷酸化改變，尤其p38 MAPK是凋亡中的關(guān)鍵一環(huán)［48］。

氧化應(yīng)激（oxidative stress）在多種疾?。ò鞲胁《靖腥荆┑闹卵走^程中有重要作用，流感病毒感染引起的肺組織細胞損傷與氧自由基造成氧化應(yīng)激態(tài)升高有關(guān)，且氧化應(yīng)激是造成細胞凋亡的重要因素［49］。氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化能導致肺臟細胞發(fā)生壞死性炎癥及損傷［50-51］，也能調(diào)控STAT基因表達，進一步引起細胞因子變化［52］。

KEGG信號通路富集結(jié)果顯示，IL-17是一種前炎癥因子，具有促進細胞增殖分化、調(diào)節(jié)免疫、促進生物因子表達與轉(zhuǎn)錄作用，氣道出現(xiàn)病毒感染后，CD11b+細胞大量分泌IL-17，IL-17通過結(jié)合嗜酸性細胞及氣道上皮細胞表面受體，釋放大量炎性因子，加劇氣道炎癥，加重肺部感染，形成惡性循環(huán)［53］。重癥肺炎患者外周血中IL-17顯著升高，且IL-17水平與患者病情發(fā)展及嚴重程度密切相關(guān)，提示IL-17可能是炎癥反應(yīng)體系中起重要作用的細胞因子［54］。Toll樣受體（TLR）信號通路亦與肺炎密切相關(guān)［55］。TLR是一種模式識別受體，可識別內(nèi)源性和外源性配體，并通過其信號轉(zhuǎn)導途徑激活NF-κB誘導前炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄［56-57］。TLR2/3/9介導細胞因子IL-6和IFN-γ的產(chǎn)生和釋放，共同參與宿主對成人病毒性CAP的免 疫 應(yīng)答［58］。TNF-α是腫瘤壞死因 子（tumor necrosis factor，TNF）的亞型，炎癥時其表達顯著升高，血清含量增多，導致毛細血管通透性升高，炎性滲出增加，并引起免疫反應(yīng)，從而造成組織細胞受損［59］。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α與重癥肺炎發(fā)病有密切關(guān)系，患者體內(nèi)TNF-α水平升高的原因主要在于單核-巨噬細胞系統(tǒng)的激活導致單核-巨噬細胞活化增殖增多，從而造成TNF-α分泌增多。冠狀病毒感染機體后TNF-α表達增高，不僅對肺及支氣管造成損傷，還干擾機體免疫調(diào)節(jié)［60-61］。COVID-19患者大多存在缺氧癥狀，在應(yīng)對缺氧脅迫過程中，低氧誘導因子1（Hypoxia inducible factor 1，HIF-1）發(fā)揮了重要作用，HIF-1主要由HIF-1α及HIF-1β兩個亞單位組成［62］。甲型H1N1流感病毒感染能誘導HIF-1α發(fā)生核轉(zhuǎn)位調(diào)控炎性因子表達而加重炎癥反應(yīng)，炎癥又加重微環(huán)境缺氧，導致HIF-1α進一步上調(diào)，促進HIF-1α核聚集，這種惡性循環(huán)可能是“細胞因子風暴”產(chǎn)生的機制之一，而HIF-1α是整個惡性循環(huán)的關(guān)鍵節(jié)點［63］。研究［64］表明，二陳湯加味可能通過抑制HIF-1α表達與釋放，發(fā)揮抗氧化損傷及抗炎作用，從而保護肺組織。

綜上所述，本研究篩選出治療COVID-19的136味中藥，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法對核心中藥進行靶標預測及作用機制分析。CASP3、IL-6、MAPK3、IL-10、IL-1β等可能為中藥治療COVID-19的關(guān)鍵靶標，而黃芩苷、β-谷甾醇、槲皮素等活性分子作用較強。核心中藥可能通過作用于IL-17、Toll樣受體、腫瘤壞死因子、低氧誘導因子-1等信號通路，參與調(diào)控細胞因子及炎癥免疫介質(zhì)、細胞凋亡、氧化應(yīng)激等環(huán)節(jié)，從而發(fā)揮對COVID-19的防治作用。COVID-19傳染性較強，中藥在治療時能發(fā)揮多靶點-多環(huán)節(jié)-整體性優(yōu)勢。然而由于本研究處方樣本量偏少，對靶標分析深度尚有欠缺，仍待進一步臨床及實驗驗證。

附表1潛在靶基因參與的生物過程（BP）