增食欲素A調(diào)節(jié)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞自噬的研究

常曉岑，溫晶，索琳娜，白博文，郭丹，趙玉巖

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第四醫(yī)院內(nèi)分泌代謝內(nèi)科，沈陽(yáng) 110032；2.附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110001）

增食欲素是下丘腦的神經(jīng)肽，包括增食欲素A（orexin-A）和增食欲素B（orexin-B）2種，在調(diào)節(jié)睡眠、覺(jué)醒、神經(jīng)內(nèi)分泌平衡、攝食、應(yīng)激反應(yīng)等行為中起十分重要的作用［1-4］。增食欲素有2種膜結(jié)合G蛋白耦聯(lián)受體，即增食欲素受體1（orexin receptor-1，OX1R）和增食欲素受體2（orexin receptor-2，OX2R）。orexin-A是OX1R的高親和力受體激動(dòng)劑，相比之下，orexin-A對(duì)OX2R親和力較低［5-7］。研究［8］表明，orexin-A比orexin-B的生物學(xué)作用更廣泛且重要。既往研究與本課題組前期研究［9-11］均發(fā)現(xiàn)增食欲素對(duì)多種內(nèi)分泌腺細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞活力有影響，但對(duì)自噬的作用鮮有研究。因此，本研究擬分析orexin-A對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞自噬的作用，即對(duì)LC3Ⅰ、LC3Ⅱ以及Beclin-1蛋白表達(dá)水平的影響，以及orexin-A調(diào)節(jié)PC12細(xì)胞自噬后對(duì)去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）分泌水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清購(gòu)自德國(guó)默克Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢云克隆公司；戊二醛固定液購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗LC3多克隆抗體購(gòu)自中國(guó)ABclonal公司；兔抗Beclin-1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；OX1R抑制劑SB334867購(gòu)自美國(guó)Cell signalling公司；自噬抑制劑3-MA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BCA 蛋白定量試劑盒、Western blotting一抗和二抗稀釋液均購(gòu)于自碧云天生物技術(shù)研究所；GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗等均購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

低溫高速離心機(jī)（3K-15）購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；化學(xué)發(fā)光儀（4200SF）購(gòu)自中國(guó)天能儀器公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自?shī)W地利安托斯儀器公司；低速離心機(jī)購(gòu)自科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；電熱恒溫干燥箱購(gòu)自北京市光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：將PC12細(xì)胞接種在DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗（100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素）培養(yǎng)基中，于37 ℃、100%濕度、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d換液1次。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，取出培養(yǎng)皿，將細(xì)胞接種于24孔板中（2 mL/孔）。既往研究［12］發(fā)現(xiàn)，10-6mol/L orexin-A刺激腎上腺髓質(zhì)分泌腎上腺素及NE顯著，因此，本研究采用10-6mol/L orexin-A進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分為3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即orexin-A組（加 入10-6mol/L orexin-A），orexin-A+OX1Ri組（SB334867預(yù)處理1 h后加入10-6mol/L orexin-A）和空白對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每組處理時(shí)間為24 h。

1.2.2 透射電鏡觀察：棄掉空白對(duì)照組和orexin-A組培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次后，將PC12細(xì)胞移入新的離心管中，3 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL 2.5%戊二醛固定24 h，透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.3 Western blotting：收集各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，加入裂解液冰上充分裂解，BCA法測(cè)定蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，洗膜3次后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜3次后加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜3次，ECL顯色。應(yīng)用Image J軟件分析結(jié)果。

1.2.4 ELISA檢測(cè)上清液中NE含量：將細(xì)胞培養(yǎng)液從培養(yǎng)瓶移入離心管中，離心后棄沉淀，取上清液。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)上清液中NE含量。每個(gè)樣品測(cè)定3次，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，計(jì)算每個(gè)樣品的平均OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Orexin-A上調(diào)PC12細(xì)胞OX1R蛋白表達(dá)

如圖1所示，orexin-A顯著上調(diào)了PC12細(xì)胞中OX1R蛋白的表達(dá)水平（P＜ 0.05），而同時(shí)加入orexin-A和OX1R抑制劑的PC12細(xì)胞中OX1R蛋白的表達(dá)水平明顯下降，且與空白對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖1 Orexin-A對(duì)PC12細(xì)胞OX1R蛋白表達(dá)的影響Fig.1 The effect of orexin-A on OX1R protein expression in PC12 cells

2.2 Orexin-A對(duì)PC12細(xì)胞自噬的影響

如圖2所示，透射電鏡下可見(jiàn)，空白對(duì)照組正常PC12細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)致密，各細(xì)胞器清晰，形態(tài)良好，少見(jiàn)自噬的發(fā)生。而orexin-A組PC12細(xì)胞則較空白對(duì)照組自噬體增多。表明orexin-A促進(jìn)了PC12細(xì)胞自噬。

圖2 透射電鏡觀察orexin-A對(duì)PC12細(xì)胞自噬的影響Fig.2 The effect of orexin-A on autophagy in PC12 cells observed by transmission electron microscope

2.3 Orexin-A通過(guò)OX1R促進(jìn)PC12細(xì)胞自噬

如 圖3、4所 示，orexin-A組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組，而orexin-A+OX1Ri組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表達(dá)水平則顯著低于orexin-A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。orexin-A組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著高于空白對(duì)照組和orexin-A+OX1Ri組。

圖3 Orexin-A對(duì)PC12細(xì)胞LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白表達(dá)的影響Fig.3 The effect of orexin-A on LC3Ⅱ and LC3Ⅰ protein expression in PC12 cells

2.4 Orexin-A對(duì)PC12中NE分泌的調(diào)節(jié)

結(jié)果顯示，orexin-A組NE濃度［（1.99±0.14）pg/mL］顯著高于空白對(duì)照組［（1.77±0.10）pg/mL］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；而orexin-A+OX1Ri組的NE濃度［（1.88±0.13）pg/mL］顯著低于orexin-A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。提示orexin-A可能是通過(guò)OX1R上調(diào)PC12細(xì)胞NE分泌水平。

3 討論

orexin-A和orexin-B是來(lái)自同一前體前orexin 原的神經(jīng)肽。二者高度表達(dá)于涉及攝食行為的側(cè)下丘腦區(qū)域，也存在于腎上腺、胃腸道、胰腺等外周組織及血液中。增食欲素的2個(gè)功能性受體（OX1R、OX2R）廣泛且有差異地分布于腦組織中，也見(jiàn)于腎臟、腎上腺、甲狀腺、睪丸、卵巢、空腸、肺等外周組織中。研究［5-6，13-14］表明，orexin-A與OX1R的結(jié)合力是orexin-B與OX1R結(jié)合力的5～100倍，而orexin-A和orexin-B對(duì)于OX2R則具有相似的親和力。相對(duì)于orexin-B，orexin-A穩(wěn)定性好、生物學(xué)作用更強(qiáng)且廣泛，而orexin-A又是OX1R的高親和力受體激動(dòng)劑，因此，本研究主要探討orexin-A與OX1R的作用。結(jié)果顯示，orexin-A組PC12細(xì)胞中OX1R的蛋白表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組，而加入受體抑制劑后，PC12細(xì)胞OX1R的蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜ 0.05），提示orexin-A上調(diào)了PC12細(xì)胞OX1R蛋白的表達(dá)。

圖4 Orexin-A對(duì)PC12細(xì)胞Beclin-1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Orexin-A effect of orexin-A on Beclin-1 protein expression in PC12 cells

增食欲素系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)攝食與能量平衡，促進(jìn)覺(jué)醒，以及調(diào)節(jié)呼吸、情緒、心率、血壓等作用［15］。近年來(lái)的研究主要關(guān)注于增食欲素對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、活力、激素分泌的作用，但對(duì)細(xì)胞自噬的影響鮮有研究。細(xì)胞自噬被稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是依賴溶酶體降解細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的代謝途徑［16］。自噬在細(xì)胞新陳代謝、結(jié)構(gòu)重建、生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，透射電鏡下可見(jiàn)orexin-A組PC12細(xì)胞的自噬體較空白對(duì)照組PC12細(xì)胞增多，提示orexin-A可能促進(jìn)了細(xì)胞自噬。LC3是自噬標(biāo)志物，有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ 2種表現(xiàn)形式，自噬形成時(shí)，胞漿型LC3（即LC3Ⅰ）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨问降腖C3（自噬體膜型），即LC3Ⅱ。研究［17-18］表明，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值與自噬體形成的數(shù)量成正比，因此，可用LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值估計(jì)自噬水平，比值增高往往代表自噬體形成。Beclin-1是酵母ATG6的同源體，也是自噬相關(guān)的特異性基因，調(diào)控自噬前體和自噬體的形成［19］。因此，也可用其表達(dá)水平判斷自噬水平，Beclin-1升高是自噬形成的重要指標(biāo)［20］。本研究結(jié)果顯示，orexin-A組PC12細(xì)胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1的蛋白表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組和orexin-A+OX1Ri組（P＜ 0.05）。提示orexin-A可能通過(guò)OX1R來(lái)激活自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1，從而促進(jìn)PC12細(xì)胞自噬，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，orexin-A組PC12細(xì)胞的NE含量顯著高于空白對(duì)照組，而加入OX1Ri組PC12細(xì)胞的NE含量明顯下降，說(shuō)明orexin-A通過(guò)OX1R影響細(xì)胞自噬、調(diào)節(jié)PC12細(xì)胞的NE分泌水平，提示PC12細(xì)胞的NE分泌調(diào)節(jié)機(jī)制可能與細(xì)胞自噬有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)orexin-A可能通過(guò)OX1R促進(jìn)PC12細(xì)胞自噬，并上調(diào)PC12細(xì)胞的NE分泌水平，且orexin-A對(duì)PC12細(xì)胞NE分泌水平的調(diào)節(jié)機(jī)制可能與細(xì)胞自噬有關(guān)。盡管具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步探索，但本研究發(fā)現(xiàn)了orexin-A對(duì)腎上腺細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用，補(bǔ)充了orexin-A的生物學(xué)功能，對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)orexin-A具有重要意義。orexin-A及其受體OX1R可能成為調(diào)節(jié)腎上腺功能紊亂的治療靶點(diǎn)之一。