山藥蛋白及其致癢成分分析

孫冬紅，洪玉曉，陳洪鐸，高興華

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽 110001）

山藥可用于治療心血管疾?。?］、糖尿?。?］，同時(shí)具有降血壓［3］、抑制乳腺癌、胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)［4-5］、減輕抗生素相關(guān)性腹瀉［6］、提高記憶力［7］和免疫調(diào)節(jié)活性［8-10］等功能。山藥中的主要成分有淀粉、多糖、蛋白質(zhì)、皂苷、尿囊素、多巴胺和黃酮類化合物等［11-12］。山藥黏液的主要成分為糖蛋白生物大分子［13］。

山藥汁液接觸到皮膚，人會(huì)感覺到強(qiáng)烈的瘙癢。瘙癢是一種引發(fā)搔抓的不適感［14］。組胺及其受體是近幾十年研究最透徹的神經(jīng)介質(zhì)和受體，在多種瘙癢性皮膚病中起關(guān)鍵作用，組胺導(dǎo)致的瘙癢往往同時(shí)伴隨風(fēng)團(tuán)、紅斑和潮紅［15］。許多瘙癢的發(fā)生往往不伴隨風(fēng)團(tuán)的出現(xiàn)，且這些瘙癢抗組胺治療無效，是由非組胺依賴途徑引起的［16］。目前，山藥引起人體皮膚瘙癢的原因和機(jī)制尚未明確。

在20世紀(jì)50年代，SHELLEY等［17］研究表明，來自豆科攀緣植物黑藜豆夾毛刺中的一種蛋白酶mucunain可以引起人體瘙癢，這種瘙癢合并燒灼感，且不伴隨風(fēng)團(tuán)的出現(xiàn)［18］。研究［19-20］表明多種植物的蛋白酶，包括菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶和木瓜蛋白酶等，可引發(fā)瘙癢，并且瘙癢模式與山藥引發(fā)的瘙癢一致。本研究以新鮮山藥為原料，采用陰離子交換層析分離純化、皮膚瘙癢評(píng)價(jià)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和生物信息學(xué)分析等方法篩選出潛在具有致癢作用的蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮山藥（河南山藥種植基地）；土豆（遼寧大潤發(fā)超市）；考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒（上海碧云天公司）；Q-HPR（武漢匯研公司）；AKTA primer（美國GE公司）；電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（北京六一公司）；Orbitrap Fusion質(zhì)譜（美國Thermo公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山藥蛋白的分離純化：

1.2.1.1 樣品預(yù)處理 山藥洗凈切片，-20 ℃冷凍24 h，取500 g室溫解凍，加入1 L純化水勻漿20 min，得到固液混合物，離心（11 500 r/min，4 ℃，25 min）取上清，測(cè)定上清pH為6.35，電導(dǎo)率為3.0 mS/cm，此即樣品溶液1；將其用3×103超濾膜濃縮至200 mL，以NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，依次按照0.8 μm、0.45 μm進(jìn)行膜過濾得到樣品溶液2。

1.2.1.2 純化過程 用20 mmol/L Tris，pH 8.0溶液（溶液A）清洗Q-HPR預(yù)裝柱，將樣品溶液2上樣，收集完流穿液后，用溶液A平衡預(yù)裝柱，用20 mmol/L Tris，1.0 mmol/L NaCl，pH 8.0溶液（溶液B）進(jìn)行線性洗脫5個(gè)柱體積，收集不同的洗脫峰。

1.2.1.3 SDS-PAGE電泳 將樣品溶液2及各組洗脫產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)純化分離條帶。

1.2.2 瘙癢評(píng)價(jià)：分別將樣品溶液1、樣品溶液2及各分離產(chǎn)物以1 mg/mL用純化水溶解。新鮮土豆與純化水以1 mg ∶1 mL勻漿，離心（3 000 r/min，25 min）取上清為陰性對(duì)照。將各組進(jìn)行人體皮膚瘙癢評(píng)價(jià)：用浸有上述樣品的濾紙片分別貼于健康受試者（共19例）前臂30 min，兩濾紙間隔5 cm以上，用數(shù)字評(píng)分分級(jí)法量表進(jìn)行評(píng)分。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2.3 蛋白質(zhì)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定：

1.2.3.1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 對(duì)山藥樣品進(jìn)行蛋白提取和胰酶酶解，使用液相色譜流動(dòng)相溶解肽段，超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。肽段經(jīng)超高效液相系統(tǒng)分離后注入NSI離子源中進(jìn)行電離，Orbitrap Fusion質(zhì)譜分析。

1.2.3.2 質(zhì)譜結(jié)果數(shù)據(jù)庫檢索 使用Maxquant（https：//www.maxquant.org）對(duì)二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索。

雙流機(jī)場(chǎng)車站為某城際客運(yùn)專線中間站，車站總長(zhǎng)943 m，有效站臺(tái)長(zhǎng)450 m，標(biāo)準(zhǔn)段寬55.2 m，有效站臺(tái)中心里程處基坑深20.2 m。有效站臺(tái)與T2航站樓斜拱樁基承臺(tái)邊緣凈距為15 m左右。雙流機(jī)場(chǎng)站與T2航站樓平面位置如圖1所示。

1.2.4 生物信息學(xué)分析：

1.2.4.1 基因本體論（gene ontology，GO）分析 GO對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)層面的注釋來源于UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫（http：//www.ebi.ac.uk/GOA/）［21］。使用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)蛋白進(jìn)行富集分析。蛋白結(jié)構(gòu)域注釋使用基于蛋白序列算法的軟件InterProScan以及相應(yīng)的InterPro結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）［22］對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域注釋及富集分析。

1.2.4.2 蛋白-蛋白互作分析 使用STRING（http：//string-db.org）［23］進(jìn)行分析，設(shè)置信度閾值＞0.4，得到鑒定蛋白之間的互作關(guān)系。使用在線韋恩分析工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對(duì)分離后各組分蛋白進(jìn)行差異分析。

1.2.5 蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ龋涸赑fam數(shù)據(jù)庫中（https：//pfam.xfam.org/search）查詢，并與注釋到的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行對(duì)比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21和Graphpad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，對(duì)于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，使用非參數(shù)檢驗(yàn)（符號(hào)秩和檢驗(yàn)）進(jìn)行差異分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山藥蛋白質(zhì)分離純化

采用Q-HPR陰離子交換柱，得到4個(gè)較明顯的色譜峰，分別命名為洗脫峰1～4（E1～4）。山藥樣品溶液2的分離純化圖譜見圖1。

圖1 山藥蛋白分離純化圖譜Fig.1 Plot showing isolation and purification of yam proteins

2.2 電泳蛋白分離

對(duì)樣品溶液2、分離組分1、分離組分2、分離組分3及分離組分4進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，其中，樣品溶液2、分離組分1和分離組分2中蛋白主要分布于25×103～35×103，分離組分3蛋白主要分布在75×103，分離組分4蛋白主要分布于30×103～35×103。見圖2。

圖2 蛋白SDS-PAGE電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the isolated yam proteins

2.3 瘙癢評(píng)價(jià)結(jié)果

經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，陰性對(duì)照組、樣品溶液2和分離組分（2、3和4）瘙癢評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用配對(duì)樣本比較的Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。瘙癢評(píng)分：土豆水提液均值0.21（陰性對(duì)照組）、樣品溶液1均值4.58（P＜ 0.05）、樣品溶液2均值3.89（P＜ 0.05）和分離組分1均值3.21（P＜ 0.05）；分離組分2均值0.37（P＞0.05）、分離組分3均值0.37（P＞ 0.05）、分離組分4均值0.26（P＞ 0.05）。見圖3。

圖3 瘙癢評(píng)分統(tǒng)計(jì)圖Fig.3 Statistical chart showing pruritus score

2.4 山藥總蛋白定性組學(xué)分析結(jié)果

2.4.1 山藥蛋白質(zhì)鑒定：通過質(zhì)譜分析，得到29 695張二級(jí)譜圖，經(jīng)蛋白理論數(shù)據(jù)搜庫后，得到可利用有效譜圖10 869張。通過譜圖解析，共鑒定到7 121條肽段，其中特異性肽段6 191，鑒定出1 529個(gè)蛋白質(zhì)。

2.4.2 山藥蛋白注釋：從GO、蛋白結(jié)構(gòu)域及蛋白描述等方面進(jìn)行了詳細(xì)的注釋。發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶2（cysteine proteinase 2，CCP2）、B樣組織蛋白酶2（cathepsin B-like protease 2，CATHB2），和Oryzain α鏈（oryzain alpha chain，Os04g0650000）屬于木瓜蛋白酶家族，蛋白功能結(jié)構(gòu)域?yàn)榘腚装彼岬鞍酌浮?/p>

2.4.3 山藥蛋白GO功能分析及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域富集分析：為了明確這1 529個(gè)蛋白主要涉及的功能，將鑒定到蛋白進(jìn)行了GO富集分析。GO富集分析顯示生物學(xué)過程（biological processes，BP）主要富集在檸檬酸鹽代謝、二磷酸核苷磷酸化和嘌呤核苷酸生物合成過程等；細(xì)胞組分（cellular component，CC）主要富集在多聚核糖體胞漿小核糖體亞單位、細(xì)胞連接和呼吸鏈復(fù)合體等；分子功能（molecular function，MF）主要富集在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶激活、銅離子結(jié)合和氧化還原酶激活等（圖4A～4C）。蛋白結(jié)構(gòu)域（protein domain，PD）富集到了磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、Ⅲ類轉(zhuǎn)氨酶和木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶等（圖4D）。

圖4 山藥蛋白GO功能富集和蛋白結(jié)構(gòu)域富集結(jié)果Fig.4 GO function enrichment and protein domain enrichment of yam proteins

2.4.4 蛋白-蛋白互作分析（protein-protein interaction，PPI）：為研究蛋白間的相互作用，使用STRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)CCP2、CATHB2和Os04g0650000處于網(wǎng)絡(luò)的相對(duì)核心位置（圖5）。

圖5 山藥蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Protein-protein interaction network of yam proteins

2.5 分離純化后各組分蛋白質(zhì)譜鑒定及致癢組分的成分分析

2.5.1 質(zhì)譜鑒定：具有致癢活性的蛋白組分通過質(zhì)譜分析，共鑒定到990條肽段，其中特異性肽段為872，鑒定到235個(gè)蛋白質(zhì)。另外3個(gè)非致癢組分：組分2鑒定到257個(gè)蛋白，組分3鑒定到328個(gè)蛋白，組分4鑒定到240個(gè)蛋白。見表1。為了鑒別致癢活性組分中的差異蛋白，利用在線韋恩分析工具對(duì)4個(gè)組分進(jìn)行分析，識(shí)別出致癢組分中含有91個(gè)非重疊蛋白，其中包含CCP2（圖6）。

圖6 4個(gè)組分韋恩圖結(jié)果Fig.6 Venn diagram showing the results of the four components

表1 各組份質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Statistical table showing MS results of each component

2.5.2 模塊化分析：為進(jìn)一步研究具有致癢活性組分蛋白的相互作用關(guān)系，通過STRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行模塊化分析，發(fā)現(xiàn)CCP2是連接2個(gè)獨(dú)立網(wǎng)絡(luò)的核心分子。見圖7。

圖7 致癢活性組分的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Protein-protein interaction network of the itch-inducing active component

2.5.3 CCP2結(jié)構(gòu)域匹配：使用Pfam數(shù)據(jù)庫對(duì)CCP2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行匹配，在Pfam數(shù)據(jù)庫中輸入CCP2的氨基酸序列。結(jié)果顯示，該蛋白注釋到“木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶”，CCP2全長(zhǎng)198個(gè)氨基酸，1-195氨基酸與“木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶”模型（模型全長(zhǎng)218個(gè)氨基酸）的23-218序列相匹配。

3 討論

通過對(duì)山藥蛋白組學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)1 529個(gè)山藥蛋白中存在木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶（CCP2、CATHB2和Os04g0650000）。蛋白結(jié)構(gòu)域富集到木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶。對(duì)山藥蛋白進(jìn)行分離純化及瘙癢評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)分離后組分1具有致癢活性，質(zhì)譜定性分析鑒定到該組分含有235個(gè)蛋白，通過STRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和模塊化分析，發(fā)現(xiàn)CCP2處于網(wǎng)絡(luò)的核心位置且是連接2個(gè)獨(dú)立網(wǎng)絡(luò)的核心分子。在Pfam數(shù)據(jù)庫中，該蛋白注釋為“木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶”。以上結(jié)果提示山藥蛋白中存在半胱氨酸蛋白酶。在分離純化后的活性組分中，核心分子CCP2的一級(jí)氨基酸序列與木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶具有高度同源性。

CCP2在玉米中可以促進(jìn)玉米種子的發(fā)芽和成熟過程［24］。研究［25］表明，植物在自然衰老或耐受脅迫下會(huì)導(dǎo)致CCP2mRNA升高，而在極端脅迫條件下CCP2mRNA的含量減少，導(dǎo)致蛋白酶活性降低，從而減少蛋白的循環(huán)利用并減少代謝產(chǎn)物向植物其余部分的輸出。因此，CCP2在植物耐受性上可能起著重要作用。

CCP2作為一種半胱氨酸蛋白酶，其在瘙癢方面的研究未見相關(guān)報(bào)道。目前已有的研究［26-27］指出，植物中的一些蛋白酶可引發(fā)皮膚瘙癢，主要有菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶及從黑藜豆毛刺中提取的Mucunain，其均屬于半胱酸蛋白酶類。研究［19，28-29］表明，半胱氨酸蛋白酶引發(fā)的瘙癢是通過G蛋白偶聯(lián)受體家族的蛋白酶激活受體（protease activated receptor，PAR）激活引起。該家族由4個(gè)成員組成，PAR1～PAR4，它們被蛋白酶水解激活，并向下游傳遞信號(hào)，引起外周機(jī)械反應(yīng)C纖維瘙癢通路的激活。

山藥致癢模式為快速出現(xiàn)的瘙癢同時(shí)伴有燒灼感，這種瘙癢在皮膚首次接觸新鮮山藥汁數(shù)十秒至數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)，并且瘙癢時(shí)沒有風(fēng)團(tuán)。山藥引起的瘙癢模式和上述蛋白酶引起的瘙癢模式極為相似。基于已有的文獻(xiàn)報(bào)道和山藥分離后的活性評(píng)價(jià)及成分分析，初步推測(cè)山藥中CCP2為山藥致癢活性成分。山藥引起瘙癢的機(jī)制可能是山藥中的蛋白酶通過PAR的激活引起的非組胺依賴性瘙癢［18，30］。因此，山藥蛋白致癢成分，特別是CCP2的進(jìn)一步研究有助于建立非組胺依賴的瘙癢模型，為探討?zhàn)W機(jī)制提供有利工具。